陶珊珊,王 靜,章英才,白 琳,劉迎雪

(寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)為一類廣泛分布于植物各器官細(xì)胞中富含羥脯氨酸且高度糖基化的糖蛋白(HRGPs)家族,主要由阿拉伯糖和半乳糖構(gòu)成多糖支鏈和蛋白質(zhì)核心鏈組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子[1-3]。通過分子生物學(xué)等技術(shù)對植物細(xì)胞中非常重要的糖蛋白AGPs研究表明,AGPs在生殖發(fā)育過程,包括花粉發(fā)育、花粉管生長、自交不親和、大孢子母細(xì)胞形成,果實(shí)的成熟和衰老過程,以及根和莖等營養(yǎng)器官發(fā)生與發(fā)育等方面起著重要作用[2-6]。研究結(jié)果表明,寧夏枸杞多糖及果實(shí)的細(xì)胞壁多糖是阿拉伯半乳聚糖AGPs糖蛋白,是枸杞子中具有免疫調(diào)節(jié)功能的藥用有效成分[2-5];番茄LeAGP1過量表達(dá)導(dǎo)致植株的株高下降,分支增多,種子數(shù)量及大小減少,表明此AGPs參與了營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育[7];過量表達(dá)黃瓜 (Cucumissativus)CsAGP1基因的煙草植株株高增加,說明AGPs促進(jìn)了莖的生長[8];擬南芥AtAGP30對種子萌發(fā)和根的發(fā)育起重要的調(diào)控作用[9],AtFLA1促進(jìn)了根的發(fā)育和細(xì)胞分化[10],AtFLA11、AtFLA12參與了次生細(xì)胞壁發(fā)育[11-13],與木質(zhì)素形成同源的基因AtXYP1、AtXYP2,該類AGPs與維管束發(fā)育密切相關(guān)[14],AtAGP31參與維管束發(fā)育與逆境應(yīng)答[15-16],AtAGP19基因在細(xì)胞分裂與生長、葉的發(fā)育以及生殖發(fā)育過程中起著重要的作用[17]?；贏GPs相關(guān)基因的表達(dá)模式證實(shí)了多種類型的AGPs基因在不同組織部位特異性表達(dá),在植物營養(yǎng)器官和繁殖器官發(fā)育中起非常重要的作用,因此,探明AGPs在不同組織部位分布的特征尤其重要[2-3]。

AGPs在植物各器官中都有存在,利用AGPs的特異性抗體,成為研究不同植物中不同部位AGPs分布與特性的重要手段,在枸杞果實(shí)AGPs免疫定位[2-5]、低溫引起雛菊(Bellisperennis)胚珠和花藥發(fā)育過程中AGPs分布的變化[18]、以及利用AGPs單克隆抗體JIM8、JIM13、MAC207和LM2對擬南芥有性生殖過程中AGPs進(jìn)行定位方面取得了較多的研究成果[2-3,19]。在營養(yǎng)器官方面,JIM4識別的AGPs與胡蘿卜根早期維管組織的發(fā)育相關(guān),JIM14識別的AGPs與根次生加厚的篩管有關(guān)[20],而JIM13識別的AGPs定位在幼嫩的木質(zhì)部和根冠[21],LM2、LM14識別的AGPs定位于野生型大麥根毛的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中[22],由此說明,不同的單克隆抗體識別的AGPs在根組織發(fā)育中有其特定的分布,但對植物葉發(fā)育中AGPs分布的研究較少。利用針對性抗體對AGPs進(jìn)行定位的免疫學(xué)研究方法,由于其較高的特異性,成為不同植物中不同部位AGPs分布研究的良好途徑[2-3]。

葉是植物進(jìn)行光合作用和蒸騰作用的主要器官,也是植物對環(huán)境變化比較敏感的器官,其AGPs的分布直接影響到其功能。研究表明,棗葉中有豐富的黃酮類[23-24]、三萜類[25]、糖類和皂苷等[26],不同發(fā)育時期靈武長棗葉營養(yǎng)成分含量與果實(shí)營養(yǎng)成分和果實(shí)品質(zhì)間存在明顯的相關(guān)性[26];AGPs參與了靈武長棗果實(shí)維管束發(fā)育過程的形態(tài)建成、細(xì)胞分裂和體積的增大,并為果實(shí)發(fā)育提供營養(yǎng)支持及保護(hù)[2,27],因此,葉AGPs分布有可能對果實(shí)品質(zhì)的形成發(fā)揮著重要作用。

靈武長棗(ZiziphusjujubaMill cv. Lingwuchangzao)是鼠李科棗屬的鮮食棗品種,原產(chǎn)于寧夏靈武市,果實(shí)具有優(yōu)良的藥用品質(zhì)和食用品質(zhì)。近年來,在靈武長棗果實(shí)研究方面取得了非常多的研究成果[2-3,27],而有關(guān)靈武長棗葉AGPs糖蛋白的分布,以及對果實(shí)品質(zhì)的影響尚不明了。因此,本研究以果實(shí)不同發(fā)育時期靈武長棗葉為材料,應(yīng)用免疫熒光定位技術(shù),較系統(tǒng)研究不同時期葉中AGPs糖蛋白的分布特征,為進(jìn)一步研究葉AGPs對靈武長棗生長發(fā)育及其在果實(shí)品質(zhì)影響方面的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以位于寧夏靈武市的寧夏紅棗工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地6年生靈武長棗的葉為供試材料,采用隨機(jī)設(shè)計,3次重復(fù),每次重復(fù)選擇生長發(fā)育良好、樹勢適中、長勢相似、栽培管理水平一致的5～10株植株。在果實(shí)膨大前期(7月10日)、快速膨大期(8月9日)、著色期(9月8日)、完熟期(9月28日)分別設(shè)計4次試驗(yàn),每次試驗(yàn)時間均設(shè)定于上午9∶00—11∶00進(jìn)行,從試驗(yàn)植株樹冠的東、西、南、北4個方位以及上、中、下、里、外各個方向選擇棗吊中部果柄附近的葉作為試驗(yàn)對象[2-3,27]。

AGPs單克隆抗體JIM13購自美國喬治亞大學(xué),堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 試驗(yàn)方法

參照Bao等[5]、王瑩瑩[28]及林曼娜[29]的方法,略有改動。

1.2.1 石蠟切片制作 選取各不同發(fā)育時期的葉,用鋒利的刀片將葉片分割成含有3條主脈的約0.6 cm×1.0 cm的小塊,立即放入含有3.7%(v/v)甲醛的2F4固定液中,蓋緊瓶蓋后注射器抽氣至樣品下沉瓶底,室溫固定4 h。更換固定液3次,每次30 min。然后用PBS磷酸緩沖液(10 mmol·L-1,pH=7.0)清洗3次,每次15 min。樣品在4℃下用0.05% Toluidine blue染色15 min,在4℃下依次用30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脫水,每次60 min,100%乙醇脫水3～4次,60 min·次-1。樣品用乙醇∶Steedman’s wax=1∶1在37℃恒溫箱中滲透過夜,次日更換乙醇∶Steedman’s wax=1∶3混合液,在37℃滲透2.5 h,再用純Steedman’s wax在37℃滲透3次,每次2 h。將樣品用純Steedman’s wax在牛皮紙盒中包埋至凝固。后期蠟塊的固著、整修、切片、貼片和展片等步驟參考王靜,章英才等的方法[2-3,27]。

1.2.2 糖蛋白免疫熒光定位 切片脫蠟、復(fù)水、PBS淋洗浸泡、封閉液處理等參考王靜,章英才等的方法[2-3,27]。然后用PBS(含1% BSA)以1∶100比例稀釋后的AGPs單克隆抗體JIM13于4 ℃下孵育過夜,次日用PBS淋洗浸泡3次,每次10 min,以去除多余抗體,再用PBS(含1% BSA)以1∶300比例稀釋后的堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗36℃黑暗條件下孵育1 h。標(biāo)記后,PBS淋洗浸泡除去未標(biāo)記的二抗,0.01% Toluidine blue染色去除植物本身的自發(fā)熒光,切片經(jīng)PBS淋洗浸泡后封片。切片在OLYMPUS IX73熒光顯微鏡(Olympus,日本)和LEICA STELLARIS 5激光共聚焦顯微鏡(Leica,德國)下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 膨大前期葉AGPs分布特征

膨大前期葉AGPs的分布特征見圖1。

(1)表皮:果實(shí)膨大前期葉上、下表皮均由一層排列緊密的細(xì)胞組成。上表皮細(xì)胞較大,近長方形,垂直于葉片方向的細(xì)胞壁較薄,抗體所識別的抗原熒光AGPs分布較少,而表皮細(xì)胞外切向壁較厚,抗體所識別的抗原熒光AGPs分布較多,形成了較厚的角質(zhì)層;下表皮細(xì)胞較小,方形,抗體所識別的抗原熒光AGPs分布情況與上表皮相似,下表皮細(xì)胞外切向壁AGPs分布較多,同樣形成了較厚的角質(zhì)層;氣孔僅分布于下表皮,孔下室較大,保衛(wèi)細(xì)胞中分布著少量AGPs(圖1A～E)。

(2) 葉肉:葉肉由6～7層細(xì)胞組成,靠近上表皮的葉肉組織由3層垂直于上表皮的長柱狀柵欄組織細(xì)胞組成、排列很緊密,細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs;近下表皮的葉肉組織主要由 3～4層短柱狀的柵欄組織細(xì)胞組成,垂直于下表皮,排列也較緊密,細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部也密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs(圖1A～E)。由此看來,葉肉是葉AGPs分布的主要部位,靈武長棗葉為典型的等面葉,具有較典型的旱生結(jié)構(gòu)特征。

(3)葉脈:靈武長棗葉具有3條發(fā)達(dá)的主脈,中間主脈維管束的直徑較大,兩側(cè)主脈維管束直徑略小(圖1A,B,D,F)。主脈維管束由近軸面的木質(zhì)部、形成層和遠(yuǎn)軸面的韌皮部組成。主脈木質(zhì)部發(fā)達(dá),主要包括多列導(dǎo)管和薄壁組織,每列均由6～7個放射狀排列的導(dǎo)管組成,近形成層的導(dǎo)管直徑相對較大,在木質(zhì)部導(dǎo)管和薄壁組織細(xì)胞的細(xì)胞壁上密集分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs,在近形成層的木質(zhì)部中AGPs尤其豐富;木質(zhì)部和韌皮部之間的形成層由多層扁平狀細(xì)胞組成,細(xì)胞中分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs;韌皮部由多層排列緊密的較小細(xì)胞組成,細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs。維管束外由一圈卵圓形的分泌細(xì)胞形成維管束鞘的結(jié)構(gòu),細(xì)胞中沒有抗體所識別的抗原熒光AGPs分布(圖1A,B,D,F)。

主脈的上表皮之下為2～3層大小不等的厚角組織,細(xì)胞壁分布著較多抗體所識別的抗原熒光AGPs,緊鄰其下為 4～5層圓形或卵圓形較大的薄壁細(xì)胞,細(xì)胞壁上也分布著較多抗體所識別的抗原熒光AGPs,其中分布有1～2個分泌道,內(nèi)部沒有AGPs熒光分布;下表皮之上為3～4 層形態(tài)較小的厚角組織,細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs,緊鄰其上為6～7層圓形或卵圓形較大的薄壁細(xì)胞,細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部抗體所識別的抗原熒光AGPs略少,其中分布有3～4個分泌道,內(nèi)部沒有AGPs熒光分布(圖1A,B,D,F)。

在上下表皮間的葉肉中間部位,分布著比較小的側(cè)脈和細(xì)脈,大部分葉脈被橫切,有時可見葉脈的縱切,葉脈維管束的結(jié)構(gòu)較簡單(圖1C,E)。外面是一圈含分泌物的薄壁細(xì)胞組成的維管束鞘,細(xì)胞中沒有抗體所識別的抗原熒光AGPs分布,內(nèi)部木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs(圖1C,E)。

2.2 快速膨大期葉AGPs分布特征

(1)表皮:果實(shí)快速膨大期上表皮垂直于葉片方向的細(xì)胞壁較薄,抗體所識別的抗原熒光AGPs分布較少,表皮細(xì)胞外切向壁較厚,抗體所識別的抗原熒光AGPs分布較多,形成了較厚的角質(zhì)層;下表皮抗體所識別的抗原熒光AGPs分布情況與上表皮相似,細(xì)胞外切向壁AGPs分布較多,同樣形成了較厚的角質(zhì)層,氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中分布著少量AGPs(圖2A～F)。

注:A～D為熒光顯微鏡圖片,Bar=50 μm; E和F為激光共聚焦顯微鏡圖片,Bar=50 μm。A、B:葉兩側(cè)主脈結(jié)構(gòu)及葉AGPs分布;C、E、F:葉結(jié)構(gòu)及AGPs分布;D:葉中間主脈結(jié)構(gòu)及AGPs分布。Note:A～D are the pictures of fluorescence microscope, Bar=100 μm; E and F are the pictures of CLSM, Bar=50 μm. A, B:Bilateral main veins structure and AGPs distribution of leaf;C, E, F:Leaf blade structure and AGPs distribution;D:Middle main vein structure and AGPs distribution of leaf.圖2 快速膨大期葉AGPs免疫熒光分布Fig.2 Immunofluorescence distribution of AGPs in leaf during the rapid enlargement period

(2)葉肉:葉肉組織的細(xì)胞組成、細(xì)胞排列情況與果實(shí)膨大前期葉基本相似,葉肉柵欄組織細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs,AGPs分布特征也與膨大前期葉相同,葉肉柵欄組織是葉AGPs分布的主要部位(圖2A～F)。

(3)葉脈:中間和兩側(cè)主脈維管束在木質(zhì)部導(dǎo)管和薄壁組織細(xì)胞的細(xì)胞壁上分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs,形成層和韌皮部細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部分布著較多抗體所識別的抗原熒光AGPs,相比果實(shí)膨大前期有所減少(圖2A,B,D)。與果實(shí)膨大前期相似,維管束外由分泌細(xì)胞形成的維管束鞘細(xì)胞中基本沒有抗體所識別的抗原熒光AGPs分布(圖2A,B,D)。

主脈的上、下表皮之內(nèi)的厚角組織細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部,以及緊鄰其內(nèi)的圓形或卵圓形較大薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均分布著抗體所識別的抗原綠色熒光AGPs,但相比膨大前期葉略有減少(圖2A,B,D);上、下表皮厚角組織內(nèi)部薄壁細(xì)胞中分布的分泌道均沒有AGPs熒光(圖2A,B,D)。

上、下表皮間葉肉中間部位分布的側(cè)脈和細(xì)脈,不論是橫切還是縱切,維管束的結(jié)構(gòu)均較簡單(圖2C,E,F)。與膨大前期葉相似,外面含分泌物的維管束鞘薄壁細(xì)胞中沒有抗體所識別的抗原熒光AGPs,內(nèi)部木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs(圖2C,E,F)。

2.3 著色期葉AGPs分布特征

(1)表皮:果實(shí)著色期葉上、下表皮細(xì)胞壁上抗體所識別的抗原熒光AGPs分布情況與快速膨大期相似,表皮細(xì)胞外切向壁較厚,抗體所識別的抗原熒光AGPs分布較多,形成了較厚的角質(zhì)層(圖3A～F)。

(2)葉肉:與之前時期不同,果實(shí)著色期葉的葉肉組織細(xì)胞排列更加密集,即便是鄰近下表皮處的柵欄組織細(xì)胞排列也非常緊密,而且葉肉柵欄組織細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均密集分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs(圖3A～F)。

(3)葉脈:主脈維管束在木質(zhì)部導(dǎo)管和薄壁組織細(xì)胞的細(xì)胞壁上密集分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs,在近形成層的木質(zhì)部中AGPs尤其豐富;形成層和韌皮部細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部分布著較多抗體所識別的抗原熒光AGPs(圖3A,B)。主脈的上下表皮之下的厚角組織、薄壁細(xì)胞及分布的分泌道AGPs分布特征與膨大前期葉相似(圖3A,B)。側(cè)脈和細(xì)脈維管束的結(jié)構(gòu)均較簡單,內(nèi)部木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs(圖3C～F)。主脈、側(cè)脈和細(xì)脈維管束外的維管束鞘細(xì)胞中基本沒有抗體所識別的抗原熒光AGPs分布(圖3C～F)。

2.4 完熟期葉AGPs分布特征

(1)表皮:果實(shí)完熟期葉上、下表皮細(xì)胞壁上抗體所識別的抗原熒光AGPs分布情況與之前時期相似,表皮細(xì)胞外切向壁抗體所識別的抗原熒光AGPs分布較多,形成了較厚的角質(zhì)層(圖4A～F)。

(2)葉肉:果實(shí)完熟期葉上、下表皮內(nèi)的葉肉柵欄組織細(xì)胞與著色期相比排列更加緊密,柵欄組織細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均密集分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs(圖4A～F)。

(3)葉脈:與著色期相似,各主脈維管束在木質(zhì)部導(dǎo)管和薄壁組織細(xì)胞的細(xì)胞壁上密集分布著大量抗體所識別的抗原熒光AGPs,在近形成層的木質(zhì)部中AGPs同樣豐富;而韌皮部細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部分布著較多抗體所識別的抗原熒光AGPs(圖4A～B)。主脈厚角組織、薄壁細(xì)胞及分泌道AGPs分布特征與著色期相似(圖4A～B)。側(cè)脈和細(xì)脈維管束木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部均密集分布著抗體所識別的抗原熒光AGPs(圖4C～F)。各葉脈維管束鞘細(xì)胞中均沒有抗體所識別的抗原熒光AGPs分布(圖4A～F)。

3 討論與結(jié)論

1)阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)是一類高度糖基化的蛋白質(zhì)[2-3],作為細(xì)胞壁-質(zhì)膜連續(xù)體的結(jié)構(gòu)元素而存在,AGPs可能與植物適應(yīng)逆境條件有關(guān)[18]。許多研究表明富羥脯氨酸糖蛋白(HRGPs)作為植物細(xì)胞壁的一種結(jié)構(gòu)蛋白,在植物抗冷害機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[2-3],HRGPs重要成員阿拉伯聚半乳糖蛋白AGPs與植物冷害存在重要相互關(guān)系,被證明在脅迫下參與信號傳導(dǎo)和細(xì)胞壁代謝[30]。棉花根部組織中的一個AGP基因GhAGP31在冷脅迫下表達(dá)量顯著上升[31],表明AGPs參與了植物的抗寒過程。另有研究表明,低溫可能導(dǎo)致“生理性干旱”脅迫的產(chǎn)生[32],低溫不僅使夏威夷椰子葉片葉肉細(xì)胞Ca2+水平及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、光合作用及蒸騰作用顯著降低[33],而且AGPs的分布和表達(dá)也發(fā)生了變化。Yan等[34]采用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)研究了人工低溫脅迫下多種AGPs在香蕉幼苗葉片中的分布及變化規(guī)律;王瑩瑩[28]以香蕉葉片為供試材料,利用9種識別AGPs的單克隆抗體,采用免疫熒光技術(shù)研究了自然低溫脅迫下兩種香蕉葉片抗原的分布及差異表達(dá),探討了AGPs在不同冷敏感程度香蕉葉片中的差異變化,不同抗體在兩種香蕉葉片中所識別的抗原位置及含量變化趨勢不同,揭示了AGPs與植物冷害的關(guān)系,認(rèn)為香蕉中的AGPs基因MaFLA2-1、MaFLA17-3、MaFLA2-2的表達(dá)量可能與香蕉的抗冷性密切相關(guān),表明這些 AGPs抗原也可能參與了香蕉的抗冷過程,揭示了AGPs與植物冷害的關(guān)系,豐富了植物抗冷機(jī)理,為香蕉抗冷育種工作提供參考。近年來發(fā)現(xiàn),AGPs在植物應(yīng)對生物及鹽脅迫等非生物脅迫過程中也扮演著重要角色[35-36],Lamport等[36]利用鹽脅迫分析AGPs功能認(rèn)為,阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)通過未知機(jī)制參與細(xì)胞擴(kuò)張,因此AGPs含量和細(xì)胞擴(kuò)張速率可能存在相關(guān)性,鹽脅迫使煙草BY-2細(xì)胞中AGPs大量上調(diào),AGPs通過高度多孔的果膠網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)散的速度大大提高。由此看來,AGPs在植物應(yīng)對低溫、鹽堿脅迫導(dǎo)致的生理干旱等非生物脅迫過程中發(fā)揮了重要作用。

不僅如此,低溫等非生物脅迫還可能影響AGPs在植物體中的分布[30]。Leszczuk等[18]在低溫對雛菊(Bellisperennis)胚珠和花藥發(fā)育過程中AGPs分布變化影響研究中,利用識別AGPs碳水化合物鏈的特異性抗體(JIM13、JIM15、MAC207)免疫細(xì)胞化學(xué)研究表明,在雛菊發(fā)育的第一階段,AGPs在雌性和雄性生殖結(jié)構(gòu)中的分布發(fā)生了明顯變化。通常情況下,AGPs具有特定持久的時空分布方式,AGPs抗原表位可見于每個形成階段的大孢子母細(xì)胞壁、大孢子和胚囊中,而在脅迫條件下的發(fā)育過程中,AGPs的定位發(fā)生改變,AGPs在胚囊壁中完全消失;在雄性部位發(fā)育的過程中,AGPs在正常情況下存在于絨氈層、小孢子母細(xì)胞和小孢子中,為了響應(yīng)低溫發(fā)育,AGPs定位于小孢子的公共壁和成熟花粉粒中,此外,AGPs在殘余的絨氈層細(xì)胞中積累[18]。

寧夏是我國西北地區(qū)干旱半干旱荒漠與草原的過渡地帶,全區(qū)3/4以上屬干旱區(qū)。水分是限制該地區(qū)植物生長、產(chǎn)量和分布的主要因素之一,在所有的非生物限制因子中占首要地位[37]。葉與干旱環(huán)境的關(guān)系最密切,反應(yīng)最敏感,環(huán)境不僅影響葉的外部形態(tài),同時也影響著葉的內(nèi)部構(gòu)造和生理活動[38],其中葉結(jié)構(gòu)特征最能體現(xiàn)植物對干旱環(huán)境的適應(yīng)性[39]。靈武長棗是具有寧夏地方特色的藥食同源鮮果品種,抗寒、耐鹽堿、耐高溫和干旱[40]。作為干旱鹽堿地和沙荒地種植的先鋒樹種,靈武長棗葉演化出了具有較粗的葉脈,發(fā)達(dá)的機(jī)械組織,葉肉組織排列緊密,全部由多層?xùn)艡诮M織組成,表皮有較厚的角質(zhì)層,氣孔通常只分布在葉的下表皮等多種適應(yīng)性結(jié)構(gòu),逐漸形成多種抗旱、耐旱的形態(tài)結(jié)構(gòu)及對應(yīng)的AGPs分布特征,在葉表皮細(xì)胞外壁、柵欄組織細(xì)胞、維管束木質(zhì)部和韌皮部、機(jī)械組織等分布了大量的AGPs,反映了干旱條件下葉結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性與各部位AGPs分布的相關(guān)性。從干旱缺水到營養(yǎng)器官和生殖器官的熱脅迫,AGPs被認(rèn)為有助于植物應(yīng)對生物和非生物脅迫的反應(yīng)[41]。

2)AGPs糖蛋白在植物營養(yǎng)生長與生殖生長和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[2-3,42],但對植物葉發(fā)育中AGPs的研究較少。王瑩瑩[28]發(fā)現(xiàn),抗體JIM4、JIM8、JIM14、JIM15和LM2等所識別的AGPs抗原在香蕉葉表皮、保衛(wèi)細(xì)胞均有分布,既具有保護(hù)作用,又抵御了低溫脅迫。Domon等[43]發(fā)現(xiàn),芒草(Miscanthus)在低溫脅迫下細(xì)胞壁中(1→3),(1→4)-β-D-glucan含量均表現(xiàn)上升,植物細(xì)胞壁成分的改變與植物抗寒性有著密切關(guān)系。植物在生長過程中受到生物脅迫或者非生物脅迫后,細(xì)胞壁的某些特性會發(fā)生極大改變,這些脅迫會改變細(xì)胞壁組分的含量及結(jié)構(gòu),從而改變細(xì)胞壁的機(jī)械性能,這種細(xì)胞壁機(jī)械性能的改變可以認(rèn)為是植物對外界環(huán)境脅迫的一種響應(yīng)[2-3,28]。本研究中,不同時期葉表皮的細(xì)胞壁及外壁中分布的AGPs,在干旱下誘發(fā)了表皮細(xì)胞壁的增厚和外壁中較厚角質(zhì)的產(chǎn)生,減少了植物體內(nèi)水分的過分蒸騰流失,使葉肉細(xì)胞更有效地利用水分,更好地發(fā)揮了保護(hù)及抵御干旱的功能。

旱生植物的葉肉向著提高光合效能、合成更多有機(jī)物以抵抗干旱的方面發(fā)展[39],靈武長棗葉高度發(fā)達(dá)的柵欄組織既避免了干旱地區(qū)強(qiáng)烈光照對葉肉細(xì)胞的損傷,又可以有效利用衍射光進(jìn)行光合作用,即柵欄組織越厚、柵欄組織細(xì)胞越小且排列越緊密,則植物利用光能的效率越高[38]。干旱脅迫下,馬尾松針葉通過增加綠色折疊薄壁組織厚度維持較高的光合能力[44]。研究表明,低溫脅迫下,香蕉葉片組織細(xì)胞內(nèi)的一些可溶物含量也在發(fā)生著改變,可溶性總糖、還原糖、甘油及可溶性蛋白質(zhì)的含量均隨著溫度的降低而升高,并且淀粉與糖之間的轉(zhuǎn)化與植物的抗冷性有著密切關(guān)系[45]。煙草AGPs從引導(dǎo)組織向花粉管轉(zhuǎn)移,為花粉管的生長提供營養(yǎng)支持[46]。本研究表明,靈武長棗4個時期葉柵欄組織細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部都分布有大量JIM13抗體所識別的抗原,基本沒有明顯的變化,葉肉始終是葉AGPs分布的主要部位。葉肉柵欄組織細(xì)胞是植物進(jìn)行光合作用的主要場所,柵欄組織細(xì)胞中大量的AGPs可能既參與了葉營養(yǎng)物質(zhì)的合成,又作為營養(yǎng)物質(zhì)來源,為植物的生長發(fā)育和后期果實(shí)營養(yǎng)物質(zhì)的積累提供了保障和營養(yǎng)支持[2]。

3)細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)及AGPs等細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白共同構(gòu)成[2,47],參與了植物細(xì)胞的生長發(fā)育、抗寒和抗旱等多種生命過程[2,28]。本研究表明,在靈武長棗4個時期葉主脈和側(cè)脈維管束木質(zhì)部和韌皮部所有細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部都分布有JIM13抗體所識別的抗原,基本沒有明顯的變化。AGPs可能參與了木質(zhì)部和韌皮部纖維素等細(xì)胞壁物質(zhì)的沉積,以及木質(zhì)部導(dǎo)管的分化和細(xì)胞壁的進(jìn)一步增厚等過程[2-3,27,48]。靈武長棗葉脈維管組織中分布的AGPs參與了葉脈維管束發(fā)育過程的形態(tài)建成,為干旱條件下水分和養(yǎng)分的高效運(yùn)輸提供了保障[2,27]。另外,王瑩瑩[28]發(fā)現(xiàn)多種不同抗體識別的維管束中AGPs抗原主要分布在香蕉葉脈的厚壁細(xì)胞和維管束鞘、木質(zhì)部、韌皮部,而本研究結(jié)果略有不同,不論靈武長棗葉的主脈和側(cè)脈,在維管束鞘細(xì)胞中基本上都沒有AGPs的分布,可能與不同植物種類的葉結(jié)構(gòu)差異有關(guān),有可能還與維管束鞘中所含不同成分相關(guān)。AGPs不僅是細(xì)胞壁多糖的組分,而且可能參與了靈武長棗葉維管束鞘細(xì)胞中分泌物的形成和積累,既提高了細(xì)胞液濃度,增大滲透勢,又利于保水抗旱。