唐夢君，周倩，張小燕，唐修君，陸俊賢，樊艷鳳，楊星星，陳薇，高玉時

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚州 225125）

雞肉富含蛋白質(zhì)以及人體必需的多種氨基酸，利用率高，肉質(zhì)細(xì)嫩，滋味鮮美，且雞肉消費沒有宗教或文化限制，深受消費者的喜愛。由于雞肉營養(yǎng)物質(zhì)豐富且水分含量高，在其生產(chǎn)、加工、貯藏等過程中易受微生物的污染。微生物的生長繁殖是影響肉質(zhì)腐敗的直接因素，為延長貨架期，降低貯藏溫度以減緩微生物生長以及酶的活性是其有效措施[1,2]，目前雞肉低溫保鮮主要有冷凍（-18 ℃以下）、冷藏（0～4 ℃）、冰溫保鮮（0～-2 ℃）和微凍保鮮（-2～-4 ℃）[3-6]。微凍保鮮介于傳統(tǒng)的凍結(jié)和冰溫之間的溫度，微凍技術(shù)能夠保持樣品的新鮮度和延長貨架期，在保鮮領(lǐng)域具有較好地的發(fā)展前景[7]。

研究發(fā)現(xiàn)肉類在低溫貯藏條件下，一些適合生存的腐敗微生物如：假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）等[8-11]可以利用雞肉中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖，加速腐敗進(jìn)程，影響產(chǎn)品的貨架期。冷鮮雞微生物群落多樣性因不同貯藏溫度而有所差異[12]。吳海虹等[13]比較分析了冷鮮雞在三種貯藏溫度（4 ℃、0 ℃和-1.5 ℃）條件下微生物菌群多樣性的差異。桂國弘等[14]報道了冷鮮雞在4 ℃貯藏保存過程中的微生物菌群多樣性，而有關(guān)冷鮮雞在微凍條件下微生物菌落結(jié)構(gòu)變化的研究還鮮有報道。

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，16S rRNA高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于肉制品、水產(chǎn)品等食品領(lǐng)域細(xì)菌群落多樣性分析[15,16]，該技術(shù)無需對菌株進(jìn)行培養(yǎng)，直接從樣本中提取細(xì)菌總DNA進(jìn)行分析，能客觀反映樣本的微生物群落組成，同時對多個樣本進(jìn)行檢測，具有高效，結(jié)果可靠等優(yōu)點。本研究采用16S rRNA高通量測序技術(shù)分析冷鮮雞在微凍貯藏過程中菌群變化規(guī)律，以期為冷鮮雞微凍保鮮研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

生物安全柜，日本ESCO公司；高速冷凍離心機，日本HITACHI；電泳儀，北京六一儀器廠；Bagmixer均質(zhì)器，法國INTERSCIENCE；BC/BD-519HEX海爾冰箱，青島海爾特種電冰柜有限公司。

1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司；無菌采樣袋，青島海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖，美國Sunshine公司；TransStartFastPfu DNA聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

從常州某肉雞屠宰場采購黃羽肉雞雞肉樣品，樣品經(jīng)三級水預(yù)冷，預(yù)冷后樣品裝于無菌采樣袋中，分別置于-3 ℃冰箱微凍保存，取樣時間分別為0、1、2、4、7、14、21和28 d，取雞胸肉做檢測樣品，每個時間點各取2只雞。

1.3.2 DNA提取和PCR擴增

無菌條件下取25 g雞胸肉，用滅菌剪刀剪碎置于均質(zhì)袋中，加入225 mL滅菌PBS，均質(zhì)器拍打60 S，將肉樣及液體轉(zhuǎn)入滅菌50 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至另一50 mL離心管中，12 000g離心5 min，去上清；重復(fù)上述步驟，直到樣品離心完畢。用2 mL TE清洗沉淀兩次（每次12 000g離心5 min），棄上清，菌體沉淀用于DNA提取。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的方法操作，提取細(xì)菌總DNA，用Nano Drop 2000測定DNA濃度和純度。選用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，30個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上下游引物（5 μmol/L）各0.8 μL，TransStartFastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補足至20 μL。將每個樣本3個重復(fù)的PCR產(chǎn)物混合。

1.3.3 Illumina測序及數(shù)據(jù)處理

測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用Illumina公司的MiSeq PE300平臺完成，數(shù)據(jù)處理利用美吉生物生信云平臺（https://cloud.majorbio.com）對樣本進(jìn)行OTU以及Alpha多樣性（包括Shannon、Chao1和Coverage）分析；對物種進(jìn)行Venn分析和群落組成分析，群落組成分析主要從門和屬水平對樣品的細(xì)菌組成進(jìn)行分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)取2次平行樣品的平均值，采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，同一時間點微凍組和冷藏組的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行T檢驗差異分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 貯藏過程中細(xì)菌群落OTU和Alpha多樣性分析

通過對0 d和在微凍條件下貯藏1、2、4、7、14、21和28 d以及4 ℃貯藏1、2、4和7 d共24個雞肉樣品進(jìn)行16S rRNA測序，數(shù)據(jù)質(zhì)控后，共得到有效序列1 363 037條。樣本的優(yōu)化序列長度主要分布在401～440 bp，集中在421～440 bp，平均序列長度421 bp。圖1a和1b為雞肉在微凍和冷藏貯藏過程中細(xì)菌的OTU韋恩分析結(jié)果。圖1a顯示：微凍條件下貯藏0～28 d 8組樣本共注釋出8 507個OTU，核心的OTU為95個，冷藏條件下貯藏0～7 d 5組樣本共注釋出3 253個OTU，核心的OTU為79個，說明在貯藏過程中有一些微生物一直存在，對腐敗的變化有重大影響[17]。在微凍條件下，樣品OTU的變化趨勢是先降低后升高再降低的過程，新鮮雞肉樣品OTU為1 279個，微凍貯藏4 d后達(dá)到一個峰值，OTU為2 653個，說明產(chǎn)生了新的微生物，其菌落豐富度和多樣性增加。此后，OTU值又逐漸降低，在貯藏后的21 d和28 d的OTU值為分別為426和487個，由此可以看出，在不同的貯藏時間，細(xì)菌多樣性存在差異，在貯藏前期雞肉處于鮮肉與次鮮肉之間，雞肉營養(yǎng)成分高，細(xì)菌迅速生長繁殖，在后期，細(xì)菌多樣性降低。說明低溫對大部分微生物的生長產(chǎn)生了抑制作用，只有耐低溫的細(xì)菌能生存下來。

微凍和冷藏兩組樣品的Alpha多樣性分析結(jié)果見表1。樣品測序覆蓋率可反映測序樣品中微生物的真實情況，數(shù)值越高，測序結(jié)果越準(zhǔn)確。所有樣品的測序覆蓋率超過0.99，說明大多數(shù)微生物都被檢測到，可進(jìn)行后續(xù)分析[18]。Shannon指數(shù)反映群落多樣性，Chao1指數(shù)反映群落豐富度[19]。冷鮮雞在微凍和冷藏條件下，在貯藏期間呈現(xiàn)Shannon指數(shù)下降，說明冷鮮雞在貯藏期間微生物多樣性逐漸降低；在微凍貯藏組，Chao指數(shù)先上升，在貯藏后4 d達(dá)到高峰，然后又逐漸下降，而在冷藏貯藏組，Chao1指數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢，說明在貯藏過程中微生物群落的豐富度趨向單一。以上結(jié)果說明，低溫對大部分微生物的生長產(chǎn)生了抑制作用。在貯藏的第1、2、4和7天，微凍組和冷藏組相比，微凍組的Shannon和Chao1指數(shù)均高于冷藏組，表明在微凍條件下微生物群落多樣性和豐富度比冷藏組高，分析其原因可能是在冷藏條件下，腐敗微生物大量繁殖，產(chǎn)生的代謝物影響了其他菌種的生長，從而使得物種多樣性和豐富度比微凍條件下降低更快。

表1 冷鮮雞在不同溫度貯藏過程中微生物Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity indexes of the chilled chicken during storage under different temperature

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 基于門分類水平上的分析

基于OTU注釋結(jié)果，樣本在門水平的群落組成采用柱形圖來展示其菌落分布及差異性，微凍和冷藏條件下門水平的分類結(jié)果如圖2和3所示。由圖2可知，在門分類水平上，以相對豐度0.01%為閾值，將相對豐度＜0.01%的菌門歸為其他。冷鮮雞在微凍和冷藏貯藏過程中優(yōu)勢菌門為：變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和綠彎菌門，在整個貯藏過程中都存在，但在不同的貯藏階段其所占的相對豐度有差異。在新鮮雞肉樣品中變形菌門（32.55%）、擬桿菌門（24.01%）、厚壁菌門（17.64%）和放線菌門（12.09%）是優(yōu)勢菌相，與茹志瑩等[20]冰鮮雞的最初優(yōu)勢菌相組成相似。變形菌門在整個貯藏周期內(nèi)其豐度相對較大，初期占比為32.55%，隨著貯藏時間的延長，其占比逐漸增加，在微凍條件下，貯藏第28 d，占比為87.81%，4 ℃冷藏7 d后，占比為98.33%，成為貯藏末期的優(yōu)勢菌門，厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和綠彎菌門，則隨著貯藏時間的延長，其占比逐漸降低。

圖2 冷鮮雞在微凍貯藏過程中微生物相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria in chilled chicken during freezing storage

圖3 冷鮮雞在冷藏過程中微生物相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacteria in chilled chickens during storage at 4 ℃

2.2.2 基于屬分類水平上的分析

在屬水平上，以相對豐度≥0.05%為閾值，將相對豐度＜0.05%的菌屬歸為其他，在微凍和冷藏貯藏條件下，豐度≥0.05%的細(xì)菌屬分別有13和9個，其具體種類見圖4和圖5。在新鮮樣品中主要的污染菌屬為：金黃桿菌屬（9.62%）、不動桿菌屬（7.6%）、棒狀桿菌屬（2.34%）、乳酸桿菌屬（2.47%）和假單胞菌屬（1.15%）。在新鮮樣品中檢測到金黃桿菌屬、不動桿菌屬和假單胞桿菌屬，其主要原因可能是在屠宰加工過程中減菌效果不明顯導(dǎo)致其成為貯藏過程中的潛在污染菌[21]。王倩等[22]研究發(fā)現(xiàn)雞胴體經(jīng)過預(yù)冷水后金黃桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬污染明顯。

圖4 冷鮮雞在微凍貯藏過程中微生物相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria in chilled chicken during partially frozen storage

圖5 冷鮮雞在冷藏貯藏過程中屬水平上的微生物相對豐度Fig.5 Relative abundance of bacteria in chilled chickens during storage at 4 ℃

假單胞桿菌屬、希瓦氏菌屬、不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬是在整個貯藏過程中豐度較高的4種菌屬，但在微凍和冷藏貯藏條件下，其豐度變化存在差異，結(jié)果見圖6。假單胞桿菌屬在微凍條件下，在0到7 d貯藏期間，除了在貯藏后第7天數(shù)量偏高以外，其生長速度低于冷藏環(huán)境。在微凍貯藏2 d、4 d后，假單胞桿菌豐度增加不明顯占比分別為2.16%和13.53%，而在冷藏條件下，貯藏后第2天假單胞桿菌屬的比例已經(jīng)增加到11.04%，貯藏第4天達(dá)到33.17%。在兩種貯藏條件下的貯藏末期，假單胞桿菌屬都是其優(yōu)勢腐敗菌，這與以前的研究報道一致[23,24]。研究報道嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬是冷鮮肉中的常見腐敗菌，在冷藏過程中快速生長，使肉腐敗變質(zhì)[25-27]。在本研究中，冷鮮雞肉在貯藏的0～7 d，希瓦氏菌屬和嗜冷桿菌屬均呈現(xiàn)上升趨勢，在冷藏條件下，其生長速度高于微凍條件，在冷藏的第7天，其優(yōu)勢菌屬為：假單胞菌屬（54.93%）、希瓦氏菌屬（26.69%）、不動桿菌屬（8.74%）、嗜冷桿菌屬（5.66%）、氣單胞桿菌屬（1.93%）、黃桿菌屬（0.90%）、金黃桿菌屬（0.50%）、乳球菌屬（0.13%）和腸桿菌屬（0.11%）。在微凍條件下，貯藏14～28 d，希瓦氏菌屬和嗜冷桿菌屬其占比降低，在貯藏28 d其占比分別為0.02%和0.49%，其生長受到了抑制。不動桿菌屬中大部分細(xì)菌被認(rèn)為是動物類食品中常見的致病菌屬之一[28]，在冷藏條件下，貯藏0～4 d，其豐度逐漸增加，到第4天達(dá)到峰值，為34.2%，第7天時又回落到8.74%。而在微凍條件下，貯藏0～7 d，其值低于冷藏條件，第7天時，豐度值接近，在貯藏21 d和28 d時，其豐度值較低，均為0.67%。由以上結(jié)果可以看出，在微凍條件下，隨著貯藏時間的延長，其菌相組成趨向單一，在貯藏第28天時，主要為假單胞桿菌屬。但在微凍整個貯藏過程中，冷鮮肉中假單胞桿菌屬、希瓦氏菌屬和嗜冷桿菌屬的變化情況較為復(fù)雜，分析其原因有可能是在樣本儲存過程中，-3 ℃的冰箱溫度有波動，導(dǎo)致其腐敗微生物的豐度變化較冷藏條件下復(fù)雜，并不是簡單遞增或遞減，而是一個不斷變化的過程。

圖6 冷鮮雞在微凍和冷藏條件下不同冷藏時間4種優(yōu)勢腐敗菌的相對豐度Fig.6 Fourdominant spoilage microorganisms in chilled chicken of different storage days under freezing storage conditions at-3 ℃ and 4℃

雖然對冷鮮雞在貯藏期間微生物菌相的變化已有大量的研究報道[12,14]，但不同的雞肉樣品其初始的微生物菌相以及貯藏后期的優(yōu)勢腐敗菌并不相同。Zhang等[29]研究發(fā)現(xiàn)引起冰鮮雞腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢腐敗菌屬為熱殺索絲菌、肉食桿菌屬、發(fā)光桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、沙雷氏菌屬、庫爾特氏桿菌屬、希瓦氏菌屬和肥桿菌屬。茹志瑩等[20]研究報道冰鮮雞保鮮期間假單胞桿菌在后期急劇增加，成為優(yōu)勢腐敗菌。溫冬玲等[30]對不同溫度下冷鮮雞肉細(xì)菌的群落多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，在貯藏前期，假單胞桿菌比例最大，而類香味菌屬為中后期優(yōu)勢腐敗菌。吳海虹等[13]對不同貯藏溫度（4、0和-1.5 ℃）對冷鮮雞肉樣品中菌群多樣性的變化影響進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4 ℃貯藏條件下樣品的優(yōu)勢菌群為假單胞菌群，而在0 ℃和-1.5 ℃貯藏條件下樣品的優(yōu)勢菌群為葡萄球菌。本研究發(fā)現(xiàn)冷藏條件下樣品的優(yōu)勢菌群為假單胞菌屬、希瓦氏菌屬、不動桿菌屬、嗜冷桿菌屬和氣單胞桿菌屬，而微凍條件下貯藏末期樣品的優(yōu)勢菌屬主要是假單胞桿菌以及其他未明確的菌屬?？梢妰?yōu)勢腐敗菌因雞只本身攜帶微生物的種類、不同屠宰企業(yè)的污染環(huán)境不同，以及不同的冷藏溫度而有所差異。

3 結(jié)論

運用16S rRNA高通量測序分析冷鮮雞在微凍條件下的菌群結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果顯示，在微凍貯藏過程中，優(yōu)勢菌門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，優(yōu)勢菌屬為假單胞桿菌屬、希瓦氏菌屬、不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬，在貯藏末期以假單胞桿菌屬為主；在冷藏貯藏末期主要以變形菌門和擬桿菌門為主，假單胞菌屬、希瓦氏菌屬、嗜冷桿菌屬和氣單胞桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。