■ 么寶蘭 劉蕓娜 劉 佳 閆子豪 李月紅

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

近年來，抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的濫用引發(fā)出一系列耐藥性和環(huán)境問題，為了尋求更好的解決辦法，越來越多的學(xué)者嘗試將益生菌應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中。芽孢桿菌是益生菌中常見的菌種，其中地衣芽孢桿菌在芽孢桿菌中是最具應(yīng)用前途的菌種，因其安全、耐熱、能分泌多種酶和產(chǎn)酶量高等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。地衣芽孢桿菌易形成孢子，比較適合于添加到飼料中，能夠降解飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)，使其被水產(chǎn)動(dòng)物的腸道更加充分的吸收和利用。有研究表明，地衣芽孢桿菌不僅能夠增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體免疫力，預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物的疾病，還可以有效分解水體中的有害物質(zhì)。最重要的是能夠平衡腸道菌群，抑制致病菌的生長繁殖[1]。

嗜水氣單胞菌是一種重要的革蘭氏陰性、能動(dòng)的桿狀細(xì)菌，是一種生活在淡水中的人畜共患病細(xì)菌，可導(dǎo)致水生動(dòng)物、陸生動(dòng)物和人類感染，廣泛存在于各種水體中[2]。嗜水氣單胞菌會(huì)產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的外毒素，進(jìn)而引發(fā)魚類出血性敗血癥[3]。該菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了水產(chǎn)動(dòng)物的健康發(fā)展，同時(shí)也對(duì)人類的生命健康構(gòu)成威脅。

試驗(yàn)以鯽魚為對(duì)象，探討飼料中添加地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚抗氧化能力、免疫功能及肝、腸組織結(jié)構(gòu)的影響，為地衣芽孢桿菌的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，也為鯽魚的健康養(yǎng)殖開辟新的思路。

1 材料

1.1 菌種和試驗(yàn)動(dòng)物

地衣芽孢桿菌菌種、嗜水氣單胞菌菌種由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃保存。試驗(yàn)鯽魚360 尾，平均體重為（51.5±0.5） g，購自長春市新立城水庫，基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平見表1，購自浙江澳華飼料有限公司。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

1.2 主要耗材

超氧化物歧化酶試劑盒、過氧化氫酶測(cè)定試劑盒、丙二醛測(cè)定試劑盒、補(bǔ)體C3 檢測(cè)試劑盒、補(bǔ)體C4檢測(cè)試劑盒、堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒、免疫球蛋白M測(cè)定試劑盒和酸性磷酸酶測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

2 方法

2.1 菌種的活化與擴(kuò)增

將地衣芽孢桿菌菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基[pH（7.3±0.1）]中活化，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，將菌液倒入10 mL EP 管中，離心，離心后棄上清液，用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，并重懸于無菌生理鹽水中，均勻噴灑在基礎(chǔ)日糧飼料上，使飼料中地衣芽孢桿菌的含量達(dá)到108CFU/g，攪拌均勻后放入烘箱，37 ℃烘干即可，現(xiàn)做現(xiàn)用。

2.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)鯽魚在80 L的玻璃缸中暫養(yǎng)14 d，選擇健康鯽魚360 尾，分為空白對(duì)照組（CK 組）、地衣芽孢桿菌試驗(yàn)組（DY 組）、嗜水氣單胞菌攻毒組（CKG 組）和地衣芽孢桿菌治療組（DYG 組），每組隨機(jī)分配3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 尾魚。CK 組和CKG 組以基礎(chǔ)飼料投喂，DY 組和DYG 組將地衣芽孢桿菌添加到基礎(chǔ)飼料中投喂，每日10：00—10：30、16：00—16：30 進(jìn)行投喂，按3%體重日糧飼喂，連續(xù)投喂6 周，2 d 換一次水，每次換水40 L。

2.3 生長指標(biāo)檢測(cè)

試驗(yàn)開始時(shí)，分別測(cè)定各組鯽魚初始體重，飼喂6 周后，稱重前停食24 h，空腹測(cè)定終末體重，計(jì)算各組試驗(yàn)魚的相對(duì)增重率和特定生長率。

相對(duì)增重率（%）=（終末體重-初始體重）/初始體重×100

特定生長率（%/d）=（In 終末體重-In 初始體重）/飼養(yǎng)天數(shù)×100

2.4 樣品采集

6 周投喂試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)玻璃缸中隨機(jī)選取9 尾魚取樣，使用MS-222（200 mg/L）麻醉，從尾靜脈抽取血液，4 ℃靜置24 h 用以制備血清。取肝、腸組織固定在固定液中用于制備組織學(xué)切片。石蠟切片的制作由塞維爾生物公司完成。然后通過腹腔注射嗜水氣單胞菌的方式對(duì)剩余各組鯽魚進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。每尾魚經(jīng)腹腔注射0.2 mL嗜水氣單胞菌，將嗜水氣單胞菌懸浮在1×PBS里，劑量為107CFU/mL。攻毒24 h后，從各組隨機(jī)選擇9 尾魚，其余操作同上。攻毒期間觀察鯽魚的狀態(tài)并及時(shí)記錄死亡情況，14 d后結(jié)束感染試驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)累積死亡率。

累積死亡率(%)=累積死亡數(shù)量/初始數(shù)量×100

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 20.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Tukey 多重比較分析組間差異顯著性，若P＜0.05 表示組間差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 飼料中添加地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚生長性能的影響

從表2 可知，與CK 組相比，DY 組可顯著提高鯽魚終末體重、相對(duì)增重率和特定生長率（P＜0.05）。

表2 地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚生長性能的影響

3.2 飼料中添加地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚血清免疫指標(biāo)的影響

由圖1可知，6周飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，與CK 組相比，DY 組顯著提高鯽魚血清中ACP活性和C3、C4、IgM 含量（P＜0.05），DY組AKP活性有升高趨勢(shì)組不顯著（P＞0.05）。但是攻毒后，受地衣芽孢桿菌的保護(hù)，與CKG組比，DYG 組鯽魚血清中AKP、ACP 活性及C4 含量顯著提高（P＜0.05），但C3和IgM含量差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚血清非特異性免疫指標(biāo)的影響

3.3 飼料中添加地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚血清抗氧化能力的影響

由圖2可知，6周飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，DY組的鯽魚血清中的CAT、SOD 活性顯著高于CK 組（P＜0.05），MDA含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。攻毒后，與CKG 組相比，DYG組的SOD活性、MDA含量相比CKG組差異顯著（P＜0.05），但CAT活性差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚血清抗氧化指標(biāo)的影響

3.4 飼料中添加地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖3 和表3 可以看出，DY 組腸絨毛高度、寬度及肌肉厚度均高于對(duì)照組，CK 組和DY 組腸絨毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)長呈指狀，形態(tài)較好。攻毒后,CKG 組腸道出現(xiàn)損傷，腸絨毛發(fā)生斷裂，腸上皮細(xì)胞排列紊亂，紋狀緣排列不規(guī)則，腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡化。DYG組較CKG 組的損傷較輕，紋狀緣和上皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞邊界明顯。

圖3 地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

3.5 飼料中添加地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖4 可知，經(jīng)顯微觀察后，CK 組肝細(xì)胞排列緊密，邊界清晰，細(xì)胞質(zhì)致密，細(xì)胞核均居于細(xì)胞的中間，肝血竇清晰可見，結(jié)構(gòu)完整，DY 組肝細(xì)胞與CK 組相差不大。CKG 組肝細(xì)胞核遷移，肝血竇充血，肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷，肝細(xì)胞核溶解，排列紊亂，界限模糊，DYG 組的肝細(xì)胞較CKG 組情況有所好轉(zhuǎn)，損傷減少，排列逐漸清晰，情況有所緩解。

圖4 地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

3.6 攻毒感染試驗(yàn)

含地衣芽孢桿菌飼料喂養(yǎng)鯽魚6 周后，進(jìn)行嗜水氣單胞菌注射攻毒試驗(yàn)，感染期間累積死亡率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖5。CKG 組第1 天即出現(xiàn)死亡情況，6 d 內(nèi)死亡率急劇增加，接下來幾天開始減緩，14 d 內(nèi)的累積死亡率達(dá)83.33%；而DYG 組在第2 天出現(xiàn)死亡，死亡率顯著低于CKG組（P＜0.05）。

圖5 嗜水氣單胞菌感染 14 d 內(nèi)鯽魚累積死亡率

4 討論

水產(chǎn)養(yǎng)殖中益生菌的添加為魚類的健康生長提供了一種生態(tài)友好的預(yù)防措施。芽孢桿菌作為一種重要的益生菌，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用。王旭達(dá)等[4]投喂仿刺參含有不同濃度地衣芽孢桿菌的飼料，試驗(yàn)結(jié)果表明投喂107CFU/g 和109CFU/g 地衣芽孢桿菌的仿刺參,不僅可以促進(jìn)仿刺參的生長，顯著提高消化酶活性及免疫酶活性，還可以增強(qiáng)其對(duì)燦爛弧菌的抵抗能力。Peng 等[5]發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌T-1 的N-酰基高絲氨酸乳糖YtnP 對(duì)鯽魚嗜水氣單胞菌感染具有抑制作用，可以通過減弱毒力因子的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)感染嗜水氣單胞菌的水生動(dòng)物的保護(hù)作用，對(duì)嗜水氣單胞菌感染的最佳保護(hù)期在感染早期，可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的早期預(yù)防。樊英等[6]在飼料中添加含活菌量達(dá)5×107CFU/g 和1×108CFU/g 的地衣芽孢桿菌投喂大瀧六線魚，研究發(fā)現(xiàn)兩種飼料對(duì)大瀧六線魚生長指標(biāo)、腸道消化酶活性和非特異性免疫酶活性均有顯著提高。由于添加劑量不同，提高程度也有所不同。所以地衣芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖具有積極作用，能夠促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物健康發(fā)展，并且具有作為水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病預(yù)防和控制的生物防治劑的潛力。

4.1 地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚生長性能的影響

在飼料中添加地衣芽孢桿菌可以促進(jìn)動(dòng)物生長。研究報(bào)道，添加地衣芽孢桿菌可以顯著提高草魚（Ctenopharyngodon idella）、羅非魚（Oreochromis spp）、肉雞、肉兔、斷奶仔豬等的生長性能。王佳昕等[7]研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加地衣芽孢桿菌可以提高肉雞的生長性能，添加量為1.0×109CFU/kg 效果最佳。Elleithy等[8]研究發(fā)現(xiàn)在肉雞日糧中添加多種芽孢桿菌菌株顯著增加了體重。Qin 等[9]研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加地衣芽孢桿菌可以提高草魚的生長性能，可能是由于地衣芽孢桿菌分泌的消化酶，提高了飼料的消化和吸收。以上試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)一致，因此飼料中添加適量的地衣芽孢桿菌可以提高魚的生長性能。

4.2 地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚血清免疫指標(biāo)的影響

AKP作為一種重要的生物體內(nèi)的代謝調(diào)節(jié)酶，參與動(dòng)物免疫反應(yīng)，能抵抗致病菌，殺死微生物和異物，加速物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸。AKP 和ACP 相互聯(lián)系，ACP是調(diào)控磷代謝的重要酶。補(bǔ)體是一種存在于脊椎動(dòng)物血清和組織液中的多蛋白組分系統(tǒng)。激活后，它可以介導(dǎo)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致病原微生物溶解或吞噬。IgM 具有殺菌、激活補(bǔ)體、免疫調(diào)節(jié)和凝集功能，并參與某些自身免疫性疾病和超敏反應(yīng)的病理過程，在先天免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[10]。胡娟等[11]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌HGcc-1 通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)，增強(qiáng)鯉魚的非特異性免疫。Han 等[12]研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌能夠增加羅非魚幼魚血清中補(bǔ)體C3 含量，提高溶菌酶的活性，添加的最佳濃度為4.4×106CFU/g。地衣芽孢桿菌不僅能夠促進(jìn)羅非魚幼魚的生長，提高抗病性，還能促進(jìn)前腸的發(fā)育，保持其完整性。Zhang 等[13]研究顯示飼喂1×107CFU/g 地衣芽孢桿菌和0.3%低聚果糖時(shí)三角鯛血清中的IgM 含量顯著增加。低聚果糖和地衣芽孢桿菌相互作用會(huì)更好地發(fā)揮作用，能顯著增強(qiáng)三角鯛的先天免疫、抗氧化能力并提高抗病性。以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相似。本試驗(yàn)中，DY 組鯽魚血清中AKP 活性有升高趨勢(shì)但并不顯著，攻毒后DYG 組中鯽魚血清中C3 和IgM 含量較CKG 組差異不顯著，可能是個(gè)體差異的原因。因此地衣芽孢桿菌對(duì)魚體的免疫機(jī)能具有積極作用。

4.3 地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚血清抗氧化能力的影響

SOD 和CAT 是魚體的抗氧化酶中的重要組成部分，可以保護(hù)魚類免受氧化損傷，SOD 被認(rèn)為是抵御氧化應(yīng)激的第一道防線，能夠消除有害自由基以及減少氧化應(yīng)激發(fā)生[14]；CAT 是防止活性氧對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響的主要抗氧化酶，可催化過氧化氫分解為水和氧[15]。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，已被用作各種生物體氧化應(yīng)激的指標(biāo)[16]，所以可以根據(jù)這些指標(biāo)來評(píng)價(jià)魚體的抗氧化能力。高肖微等[17]的研究結(jié)果表明，飼料中添加地衣芽孢桿菌能夠顯著提高鯉魚SOD和CAT 的活性，說明在飼料里添加地衣芽孢桿菌，有利于提高鯉魚抗氧化能力，增強(qiáng)魚體免疫力，這與本研究結(jié)果相似。巴翠玉等[18]發(fā)現(xiàn)將地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行組合可以提高鯽魚抗氧化酶活性和非酶抗氧化物質(zhì)GSH 和T-AOC 的含量，降低MDA 的含量。以上結(jié)果均顯示，地衣芽孢桿菌有助于保護(hù)魚類免受氧化應(yīng)激，提高魚體抗氧化能力。

4.4 地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚腸、肝組織結(jié)構(gòu)的影響

魚類腸道由黏膜層、黏膜下肌層和漿膜層四部分組成，是魚類消化和吸收功能的主要器官，對(duì)魚體的健康起著至關(guān)重要的作用[19]。Qin 等[9]研究發(fā)現(xiàn)在草魚的日糧中添加105CFU/g 和106CFU/g 地衣芽孢桿菌，絨毛高度和肌肉厚度顯著增加，因?yàn)榈匾卵挎邨U菌分泌的消化酶能夠促進(jìn)腸道絨毛的增加，提高飼料利用率。Zhang 等[20]在鯉魚的養(yǎng)殖中，將地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑，各試驗(yàn)組鯉魚腸道絨毛顯著高于對(duì)照組，表明其促進(jìn)了腸絨毛的發(fā)育。邱燕等[21]在飼料中添加枯草芽孢桿菌投喂草魚，結(jié)果顯示微絨毛寬度和密度均顯著提高，說明枯草芽孢桿菌能夠促進(jìn)草魚腸道微絨毛的生長發(fā)育，從而增加腸道的吸收面積，提高了飼料的消化率和吸收率。以上結(jié)果與本試驗(yàn)一致，均表明地衣芽孢桿菌可以提高腸絨毛的長度，在改善魚類腸道健康方面發(fā)揮重要的作用。肝臟是魚類主要的代謝和解毒器官[22]。在其他的動(dòng)物模型中，地衣芽孢桿菌已被證明對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用，如Zhao 等[23]研究在膳食中添加地衣芽孢桿菌提高肉雞的生長性能、小腸和肝臟的形態(tài)以及對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌誘導(dǎo)的亞臨床壞死性腸炎的抗氧化能力中，亞臨床壞死性腸炎感染組的肝細(xì)胞嚴(yán)重腫脹，脂肪變性，飼喂地衣芽孢桿菌組的肝臟只有輕微的充血和細(xì)胞變性，得到了明顯的改善。與本研究結(jié)果一致，說明在飼料中添加地衣芽孢桿菌能夠預(yù)防肝損傷。

4.5 地衣芽孢桿菌對(duì)鯽魚抵抗嗜水氣單胞菌感染的影響

嗜水氣單胞菌作為引起水產(chǎn)動(dòng)物病害的主要病原菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來了極大的困擾[24]。通過腹腔注射的攻毒方式使試驗(yàn)動(dòng)物感染病原體，能夠清晰明確的看到試驗(yàn)動(dòng)物的狀態(tài)，從而直面的反映益生菌制劑的保護(hù)作用[25]。本試驗(yàn)經(jīng)過嗜水氣單胞菌攻毒發(fā)現(xiàn)，日糧中添加地衣芽孢桿菌能夠有效提高鯽魚的抗病能力，降低鯽魚的累積死亡率。Chen 等[26]研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌T-1 是一種安全的群體猝滅細(xì)菌、是一種潛在的益生菌。地衣芽孢桿菌T-1 顯著降低了感染嗜水氣單胞菌的斑馬魚的死亡率，并將存活率提高到70%。Gobi 等[27]發(fā)現(xiàn)將濃度為107CFU/g 的地衣芽孢桿菌應(yīng)用至日糧中，結(jié)果顯示喂食地衣芽孢桿菌的魚類的累積死亡率顯著低于喂食對(duì)照飼料的魚類，表明其可以改善羅非魚養(yǎng)殖的健康狀況和對(duì)嗜水氣單胞菌的抗性。同本試驗(yàn)結(jié)果相似。以上結(jié)果均表明，地衣芽孢桿菌可以提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)嗜水氣單胞菌的抗性，但具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

綜上所述，研究結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌可以有效增強(qiáng)鯽魚對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗力，能夠替代抗生素作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌制劑，有利于水產(chǎn)養(yǎng)殖的綠色可持續(xù)發(fā)展，保障水產(chǎn)品的食品安全，為魚類的養(yǎng)殖提供一種有前景的策略。