杜忠佩 陳星伊 金衛(wèi)杰 李蘭華 張玉寶

摘要：黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）可借助種子遠距離傳播，對葫蘆科植物的生長和發(fā)展造成嚴重威脅。為有效防控黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）在南瓜上的侵染，在保證南瓜種子發(fā)芽及子葉生長不受影響的同時能夠有效降低黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）的活性的前提下，尋找南瓜種子干熱處理的最適溫度和時間條件。我們對南瓜新種子和舊種子進行干熱處理，比較了處理溫度、持續(xù)時間及處理后保存時間對南瓜種子發(fā)芽率的影響，并采用實時熒光定量RT-PCR檢測病毒的表達量。試驗結(jié)果表明，處理溫度和持續(xù)時間及其互作效應(yīng)都對南瓜種子的發(fā)芽率有顯著或極顯著影響。恒溫干熱法處理南瓜新種子，處理時間為72 h，處理溫度為80 ℃和86 ℃時，種子發(fā)芽率不會顯著降低，且CGMMV全部滅活。保存1 a的南瓜舊種子，用低于80 ℃的溫度處理72 h，發(fā)芽率沒有顯著變化，但當處理溫度為86 ℃時，種子發(fā)芽率顯著降低。變溫干熱法處理南瓜舊種子，由于累計處理時間長達7 d，當變溫中最高溫度達到72 ℃以上時，將顯著影響南瓜種子的發(fā)芽。由此可見，干熱處理種子是防治南瓜 CGMMV病毒的有效方法之一。

關(guān)鍵詞：南瓜種子；干熱處理；發(fā)芽率；黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）；病毒活性

中圖分類號：S642.1? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：2097-2172（2023）09-0839-06

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.09.010

Effects of Dry Heat Treatments on Pumpkin Seed Germination and

CGMMV Virus Activity

DU Zhongpei 1， CHEN Xingyi 2， JIN Weijie 2， 3， LI Lanhua 1， ZHANG Yubao 2

（1. Jiuquan Vocational and Technical College， Jiuquan Gansu 735000， China; 2. Northwest Institute of Eco-environment and

Resources， Chinese Academy of Sciences， Lanzhou Gansu 730000， China; 3. University of Chinese

Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

Abstract： Cucumber green mottled mosaic virus（CGMMV） can spread over long distances through seeds， posing a serious threat to the growth and development of cucurbitaceae plants. In order to effectively prevent and control the infection of the virus on pumpkins， the optimal temperature and time conditions were searched for dryheat treatment which would not only ensure the germination and cotyledon growth of pumpkin seeds but also reducethe activity of CGMMV. The effects of treatment temperature， duration， and storage time after treatment on the germination rate of pumpkin seeds were compared with new and old pumpkin seeds， and real-time fluorescence quantitative RT-PCR was used to detect the expression level of the virus. The results showed that the treatment temperature， duration， and their interaction effects had a significant and extremely significant impact on the germination rate of pumpkin seeds. When new pumpkin seeds were treated with thermostatic dry heat treatment for 72 hours at 80 ℃ or 86 ℃， the germination rate of the seeds did not significantly decrease， and all CGMMV were inactivated. When the old pumpkin seeds stored for one year were treated at the temperature below 80 ℃ for 72 hours， the germination rate did not show significantly changes. However， when the treatment temperature was 86 ℃， the germination rate of old seeds was significantly decreased. When the alternate temperature dryheat method was used to treat old pumpkin seeds， it would significantly affect the germination of pumpkin seeds due to the cumulative treatment time up to 7 days while the highest temperature among alternate temperature reached above 72 ℃. The experimental results indicated that dryheat treatment of seeds was one of the effective methods for controlling pumpkin CGMMV virus.

Key words： Pumpkin Seed; Dryheat treatment; Germination rate; Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）; Virus activity

收稿日期：2023 - 07 - 27

基金項目：酒泉市科技支撐計劃A類（2022CA1009）。

作者簡介：杜忠佩（1965 — ），男，山東濟寧人，副教授，主要從事農(nóng)業(yè)設(shè)備工程教學研究和科研管理工作。Email：jqdzp@126.com。

通信作者：張玉寶（1980 — ），男，甘肅平?jīng)鋈耍芯繂T，主要從事病毒學研究工作。Email： zyubao@lzb.ac.cn。

黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）屬于煙草花葉病毒屬，正單鏈RNA病毒，是一種很穩(wěn)定的病毒［1 ］。該病毒對環(huán)境適應(yīng)力極強、寄主廣泛，對南瓜、西瓜和甜瓜等葫蘆科植物的生長和發(fā)育造成嚴重威脅，是世界上許多國家和地區(qū)葫蘆科植物上的重要檢疫性病毒。2006年12月我國農(nóng)業(yè)部頒布第788號公告［2 ］，將黃瓜綠斑駁花葉病毒列為全國檢疫性的有害生物，嚴格控制該病毒的傳入。

CGMMV主要通過帶毒種子進行遠距離傳播，病毒粒子可以穩(wěn)定存在于種子表皮與內(nèi)種皮上，種子帶毒是嫁接苗育苗環(huán)節(jié)擴散傳播的最初毒源，砧木攜帶病毒，極易通過嫁接操作使該病害在苗床擴散傳播蔓延到田間［3 ］，南瓜感染CGMMV病毒后，極易在田間擴散蔓延。因此，防止南瓜種子攜帶病毒，使用無毒健康種子是杜絕CGMMV病毒病發(fā)生的關(guān)鍵措施。干熱處理是對帶CGMMV病毒的種子進行殺毒處理的常用方法，該方法將帶毒的干種子置于72 ℃以上的高溫條件下一段時間，使病毒失去活性［3 ］，特別適合于較耐熱的種子，也是一種生態(tài)友好型快速滅殺病毒的有效途徑。有研究認為，殺滅CGMMV的有效溫度為72 ℃，低于這個溫度則沒有效果［4 ］。采用75 ℃處理3 d，可以有效去除瓠瓜種子上的黃瓜綠斑花葉病毒［5 ］。

不同的植物種子耐熱性不同，利用干熱處理方法殺滅種子病毒時，處理溫度和時間的設(shè)置必須考慮對植物種子發(fā)芽率的影響。甘肅省酒泉市是全國著名的種子生產(chǎn)基地，生產(chǎn)的南瓜種子占全國供種量的80%，部分出口國外，因此對CGMMV病毒的殺毒處理顯得尤為重要。而目前對南瓜種子進行干熱處理使黃瓜綠斑駁花葉病毒失活的相關(guān)研究較少，缺乏系統(tǒng)的研究資料，無法對南瓜制種的種子公司進行有效指導。為此，我們通過試驗，研究出南瓜種子干熱處理的最適溫度和時間條件，以確保南瓜種子發(fā)芽及子葉生長不受影響的同時能夠大大降低黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）的活性，從而黃瓜綠斑駁花葉病毒病的危害。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

指示南瓜品種為綠板栗南瓜愛碧斯。試驗選用愛碧斯南瓜種子2份，其中1份為2022年當年生產(chǎn)的新鮮種子，另1份為2021年生產(chǎn)、在室溫條件下安全貯藏1 a以上的種子。水分含量均為80 g/kg，符合國家質(zhì)量標準。種子為黃色種殼，種殼厚度介于西葫蘆種子和西瓜種子之間，種殼的密度低于西葫蘆和西瓜種子。

1.2? ?試驗設(shè)計與方法

試驗于2022年8月至2023年4月在酒泉職業(yè)技術(shù)學院進行。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理均設(shè)溫度與時間2個因素，每個處理設(shè)4個重復。分別以新種子（N，2022年生產(chǎn)）和舊種子（O，2021年生產(chǎn)）為處理對象。

1.2.1? ? 恒溫干熱處理試驗? ? 共設(shè)4個溫度水平，分別為CTe1，65℃；CTe2，72℃；CTe3，80℃；CTe4，86 ℃。設(shè)3個時間水平，分別為CTi1，60 h；CTi2，72 h；CTi3，96 h。共計12個處理組合。以不進行干熱處理的種子作為對照（CK）。

1.2.2? ? 變溫干熱處理? ? 試驗設(shè)3個變溫處理，每個變溫處理有5個溫度水平，分別為ATe1，30- 50-65-50-30（℃）；ATe2，35-50-72-50-35（℃）；ATe3，40-60-80-60-40（℃）。設(shè)3個時間處理，每個時間處理也有5個時間水平，對應(yīng)5個變溫處理順序，分別為ATi1，24-36-60-24-24（h）；ATi2，24-24-72-24-24（h）；ATi3，12-24-96-24- 12（h）。共計9個處理組合。以不處理的種子作為對照（CK）。

干熱處理在海精宏設(shè)備有限公司生產(chǎn)的型號為DHG-9123A的電熱恒溫鼓風干燥箱中進行，整個試驗中恒溫鼓風干燥箱內(nèi)相對濕度在控制在15%～20%。

每個處理的新、舊種子量均為5 kg。經(jīng)干熱處理后各處理的新、舊種子均分為5份，置于室溫下保存?zhèn)溆?。其?份用于南瓜種子病毒檢測，另外4份分別用于測定南瓜種子發(fā)芽率。

1.3? ?測定項目及方法

1.3.1? ? 發(fā)芽率? ? 采用紙上發(fā)芽法，將經(jīng)干熱處理后1、7、30、90 d的在室溫下保存的南瓜新、舊種子在國產(chǎn)華普達250D型恒溫光照培養(yǎng)箱中，在26 ℃的條件下進行發(fā)芽試驗，4次重復，每重復各取新、舊種子100粒，8 d后測定發(fā)芽率。試驗過程按照GB/T 3543.4農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程執(zhí)行。

1.3.2? ? 病毒檢測? ? 南瓜種子中黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）在中國科學院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院皋蘭生態(tài)與農(nóng)業(yè)綜合試驗站實驗室，采用實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Mx3000P，Applied Biosystems，USA）進行SYBR GreenⅠ實時熒光定量（RT-PCR）檢測，檢測中使用SYBR■Premix Ex TaqTM II（TliRNaseH Plus，TaKaRa）試劑盒，采用兩步法擴增技術(shù)［6 - 7 ］。RT- qPCR的反應(yīng)體系為：10 μL TB Green Premix Ex Taq II（TliRNaseH Plus） （2X），0.8 μl PCR Forward Primer（10 μM），0.8 μL PCR Reverse Primer（10 μM），0.4 μLROX Reference Dye II，2 uL cDNA和 6 μL RNA-free H2O。兩步法 PCR 擴增標準程序如下：預變性95 ℃ 30 sec → 95 ℃ 5 sec，60 ℃ 34 sec，循環(huán)35次。

1.4? ?數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

1.4.1? ? 種子發(fā)芽率的計算? ? 種子發(fā)芽率是指在規(guī)定的條件和時間內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)的百分率，采用下式計算。

發(fā)芽率=（發(fā)芽期內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)）×100%

1.4.2? ? 病毒表達水平的計算? ? 采用2 -ΔΔCt法對實時熒光定量PCR的結(jié)果進行計算，獲得病毒的相對表達量。其中ΔΔCt =（處理組目的基因的Ct值-處理組內(nèi)參基因的Ct值）-（未處理組目的基因的Ct值-未處理組內(nèi)參基因的Ct值）［8 ］。

Ct是循環(huán)閾值（cycle threshold的縮寫形式），指在反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）中擴增病毒RNA達到可檢測水平所需的循環(huán)次數(shù)［9 ］。病毒分離陽性率與Ct值呈負相關(guān)，并且在Ct值 > 35 時分離陽性率即降為零［10 ］。

1.4.3? ? 數(shù)據(jù)分析? ? 所有數(shù)據(jù)用Excel 2016進行初步整理歸納。利用Excel進行制圖、SPSS26.0進行方差分析和多重比較。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?干熱處理對南瓜種子發(fā)芽率的影響

2.1.1? ? 恒溫干熱處理對種子發(fā)芽率的影響? ? 恒溫干熱處理后1 d立即測定南瓜種子的發(fā)芽率，對發(fā)芽率的方差分析結(jié)果表明，處理溫度和時間對南瓜新、舊種子的發(fā)芽率有極顯著影響，其交互作用對新、舊種子的發(fā)芽率分別有顯著和極顯著的影響。

與對照相比，處理時間為60 h和72 h時，4個處理溫度對新種子的發(fā)芽率都沒有顯著影響，且4個溫度處理的種子發(fā)芽率也沒有顯著差異（圖1）。但當處理時間延長至96 h，且溫度高于72 ℃時，發(fā)芽率顯著降低。說明長時間的高溫處理，南瓜新種子的發(fā)芽率會顯著降低，干熱處理的時間最好不要超過72 h。

而舊種子對高溫的敏感性比新種子高。從圖2看出，當處理溫度達到86 ℃時，3個不同處理時間的種子發(fā)芽率都顯著低于對照和3個較低溫度處理，說明舊種子比新種子更不耐高溫。當處理時間為60 h和72 h時，65、72、80 ℃這3個處理溫度的舊種子發(fā)芽率沒有顯著差異，與對照相比也沒有顯著降低，但當溫度升高至86 ℃時，種子發(fā)芽率顯著降低。因此，干熱法處理1 a以上的陳舊種子，處理溫度不高于80 ℃，處理時間不超過72 h。

2.1.2? ? 變溫干熱處理對種子發(fā)芽率的影響? ? 變溫干熱處理后1 d立即測定南瓜種子的發(fā)芽率，對發(fā)芽率的方差分析結(jié)果表明，新南瓜種子變溫處理的溫度設(shè)計對種子發(fā)芽率有極顯著影響，但變溫處理對應(yīng)的時間組合對種子發(fā)芽率的影響未達到顯著水平，而兩者交互作用對種子發(fā)芽率有極顯著的影響。

在ATe1［30-50-65-50-30（℃）］的變溫處理下，3種不同處理時間組合的種子發(fā)芽率與對照相比沒有顯著差異（圖3），在ATe3［40-60-80-60-40（℃）］的變溫處理下，3種不同處理時間組合的種子發(fā)芽率都顯著低于對照。ATe2［35-50-72-50-35（℃）］的變溫處理下，除ATi3［12-24-96-24-12（h）］的時間處理組合外，其他2種時間處理組合的發(fā)芽率也顯著低于對照。

南瓜舊種子變溫處理的不同溫度設(shè)計、對應(yīng)的時間組合和兩者的交互作用都對種子發(fā)芽率有極顯著影響。在所有對舊種子的變溫處理中，除了變溫處理ATe1［30-50-65-50-30（℃）］和時間處理ATi2［24-24-72-24-24（h）］的處理組合外，其他所有變溫處理組合的種子發(fā)芽率都顯著低于對照（圖4）。說明這種變溫處理方式不適合南瓜舊種子的干熱處理。

2.2? ?種子干熱法處理后保存時間對發(fā)芽率的影響

從圖5和圖6看出，南瓜種子在長時間的高溫干熱處理后，發(fā)芽率有顯著降低，特別當處理溫度高達86 ℃、持續(xù)時間達到96 h的恒溫處理或持續(xù)6 d的變溫處理，都使南瓜種子發(fā)芽率明顯降低，舊種子的降低幅度比新種子更大。但處理后隨種子保存時間的延長，高溫對種子的傷害有所修復，種子的發(fā)芽率有一定程度的升高。舊種子發(fā)芽率隨保存時間的延長而升高的幅度高于新種子。如南瓜舊種子在86 ℃高溫處理96 h后，發(fā)芽率降低到44.0%，保存90 d后，發(fā)芽率提高到62.0%。而新種子相同條件處理后保存同樣時間，發(fā)芽率從92.0%僅升高到94.5%。新種子經(jīng)變溫處理ATe3［40-60-80-60-40（℃）］和時間處理ATi3［12-24-96-24-12（h）］的處理組合，發(fā)芽率降低到67.0%；但保存90 d以后，發(fā)芽率卻升高到93.0%。說明干熱處理后對種子活力傷害越大，較長時間的保存后，發(fā)芽率升高幅度越大。但干熱處理后種子受高溫脅迫太嚴重，發(fā)芽率降低幅度太大，種子延長保存時間，發(fā)芽率也很難恢復，這種現(xiàn)象在不耐高溫的舊種子變溫處理中更加明顯。舊種子較高溫度的長時間變溫處理后，種子發(fā)芽率一直保持較低水平，沒有明顯升高的趨勢。

2.3? ?干熱處理對南瓜種子黃瓜綠斑駁花葉病毒的滅活效果

對恒溫干熱處理和變溫干熱處理的南瓜新種子采用RT-PCR法進行CGMMV病毒檢測（圖7、圖8），結(jié)果說明，恒溫干熱處理時，當處理溫度高于80 ℃，處理時間超過72 h，南瓜種子上的CGMMV全部滅活。采取變溫處理時，僅溫度較低的ATe1［30-50-65-50-30（℃）］的3個變溫時長處理有少量病毒存活以外，其他2個溫度較高的變溫時長處理的病毒全部失活。說明溫度和時間控制適當，采用干熱處理法完全能殺滅南瓜種子的CGMMV病毒。

3? ?討論與結(jié)論

大部分研究證實在72～85 ℃的溫度下處理葫蘆科種子72 h，其攜帶的CGMMV病毒完全失活或鈍化［11 - 12 ］。本項研究表明，帶毒南瓜種子經(jīng)72 ℃干熱處理72 h，絕大部分病毒滅活，但仍能檢出非常少的病毒存活。在80 ℃溫度下處理72 h，病毒才能全部失活。

不同的作物，甚至相同作物的不同品種，高溫處理對種子的發(fā)芽率影響不同。干熱處理對南瓜種子發(fā)芽率的影響研究較少，黃蕓萍等［13 ］對4個南瓜砧木種子干熱處理的結(jié)果表明，當處理溫度為 72 ℃，處理時間72 h，所有品種的種子發(fā)芽率與對照沒有顯著差別。但當溫度提高至 75 ℃時，處理72 h后，有些品種的種子發(fā)芽率顯著降低。宋順華等［12 ］研究發(fā)現(xiàn)，68～80 ℃的溫度處理種子 72 h后，不會影響其他葫蘆種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，但顯著降低了南瓜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率。本研究結(jié)果顯示，當處理溫度高達86 ℃，處理時間72 h，南瓜新種子的發(fā)芽率仍沒有顯著降低。本研究的變溫處理結(jié)果證明，處理時間太長，南瓜種子的發(fā)芽率嚴重降低。

有試驗設(shè)計種子經(jīng)干熱處理后，在不同溫度下保存一段時間，然后評價干熱處理后的種子隨保存時間延長，發(fā)芽率和發(fā)芽勢的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存時間較短（30 d），種子發(fā)芽率沒有顯著變化，但保存時間超過120 d或1 a，發(fā)芽率顯著降低［12， 14 ］。本研究則發(fā)現(xiàn)對保存1 a的南瓜舊種子進行干熱處理時，較高溫度處理后發(fā)芽率顯著降低，但保存90 d后，發(fā)芽率有恢復至處理前的趨勢。對這一同結(jié)果還需進一步的試驗驗證，為干熱處理種子提供更準確的數(shù)據(jù)支持。

試驗結(jié)果表明，處理溫度和持續(xù)時間及其互作效應(yīng)都對南瓜種子的發(fā)芽率有顯著或極顯著影響。恒溫干熱法處理南瓜新種子，處理時間為72 h，處理溫度為80 ℃和86 ℃時，種子發(fā)芽率不會顯著降低，且CGMMV全部滅活。保存1 a的南瓜舊種子，用低于80 ℃的溫度處理72 h，發(fā)芽率沒有顯著變化，但當處理溫度為86 ℃時，種子發(fā)芽率顯著降低。變溫干熱法處理南瓜舊種子，由于累計處理時間長達7 d，當變溫中最高溫度達到72 ℃以上時，將顯著影響南瓜種子的發(fā)芽。由此可見，干熱處理種子是滅活南瓜 CGMMV病毒的有效方法。

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