姜曉斌, 余碧霞, 劉 冬, 王恒生, 李 萍

(1.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化集成技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 安徽 安慶 246003;2.合肥師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院, 安徽 合肥 230601)

土壤微生物主要由土壤細(xì)菌、古生菌和真菌組成, 廣泛分布于根際和非根際土壤中, 其多樣性和豐富度對(duì)調(diào)節(jié)有機(jī)質(zhì)分解、土壤碳動(dòng)態(tài)和養(yǎng)分循環(huán)等生態(tài)系統(tǒng)功能起著關(guān)鍵作用[1]. 植物根際作為植物與土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)交換的媒介[2], 根際微生物對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要, 可提高植物生產(chǎn)力和抗逆性[3-5], 同時(shí)對(duì)植物的代謝物也具有較強(qiáng)的影響[6].

白芨〔Bletilla striata(Thunb.) Reichb.f.〕為蘭科多年生草本植物, 按花色可分為黃花白芨(Bletilla ochracea)和紫花白芨(Bletilla striata). 白芨在我國(guó)已有2 000多年的藥用歷史, 主要產(chǎn)自貴州、四川、湖南、湖北、安徽、河南、浙江和陜西等省[7]. 據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》記載, 白芨具有收斂止血、消腫生肌等功效, 主治咯血、吐血、外傷出血, 瘡瘍腫痛, 皮膚皸裂[8]. 這些療效與其化學(xué)成分密切相關(guān), 其活性成分主要為多糖、聯(lián)苯、二氫菲、菲類、黃酮類、蘋果酸2-異丁酯葡萄糖、氧芐酯、多酚等[9-10]. 研究發(fā)現(xiàn), 白芨根際微生物和種植的外界環(huán)境可能影響其活性物質(zhì)種類和含量[11-12]. 因此, 探究不同白芨根際土壤微生物結(jié)構(gòu)特征, 對(duì)深入理解白芨與微生物間的相互關(guān)系提供了理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 采樣區(qū)域

兩種白芨樣品采自安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院白芨試驗(yàn)基地, 取5月份自然生長(zhǎng)且長(zhǎng)勢(shì)一致的白芨.

1.2 取樣方法與樣品處理

2022年5月, 在白芨試驗(yàn)田10 m×10 m取樣區(qū)域, 選擇5塊面積為1m×1m的樣方進(jìn)行隨機(jī)取樣. 采用五點(diǎn)取樣法在樣方內(nèi)選擇黃花白芨(BOS)和紫花白芨樣品(BSS)進(jìn)行采集, 取樣范圍為白芨植株根際周圍5 cm, 土層深度為10 cm的根際土壤. 樣品過(guò)2 mm篩, 放置于無(wú)菌離心管中(50 mL), 液氮保存, 用于土壤DNA的提取、宏基因組測(cè)序和土壤理化性質(zhì)的測(cè)定.

1.3 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤樣品預(yù)處理參考吳昊等報(bào)道的方法[13]進(jìn)行. 土壤含水量使用JK-100F土壤水分儀測(cè)定, 土壤含碳量(TC)通過(guò)CE-440型元素分析儀測(cè)定, 土壤含氮量(TN)采用凱氏定氮法測(cè)定, 土壤pH和電導(dǎo)率(水土比浸提液為5∶1)使用Bante902P pH/電導(dǎo)率/TDS/鹽度計(jì)測(cè)定.

1.4 宏基因組數(shù)據(jù)分析

土壤宏基因組DNA提取采用郭輝等報(bào)道的方法[14]進(jìn)行, 使用凝膠純化試劑盒純化. 檢測(cè)濃度滿足要求后, 委托華大基因通過(guò)BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行宏基因組高通量測(cè)序. 利用LEfSe對(duì)白芨樣品的微生物宏基因組原始數(shù)量進(jìn)行篩選, 使用Megahit軟件(默認(rèn)參數(shù))進(jìn)行宏基因組組裝. 使用Metaquast軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行效果評(píng)估, 比較組裝結(jié)果和參考序列, 獲得組裝序列的高質(zhì)量Contigs數(shù)、最長(zhǎng)Contig、N50等信息. 利用Kraken v2軟件將序列與已構(gòu)建的物種組成數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析. 使用R包中的Vegan軟件來(lái)分析Alpha多樣性指數(shù)和PCA[15].

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種白芨土壤理化指標(biāo)差異分析

分別對(duì)兩種白芨土壤樣品的5項(xiàng)主要指標(biāo)(全碳、全氮、含水率、pH值和電導(dǎo)率)進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析, 結(jié)果如表1所示. BOS組和BSS組土壤理化指標(biāo)除全碳外, 均無(wú)顯著性差異, 兩組樣品理化指標(biāo)基本一致.

表1 黃花和紫花白芨根際土壤理化指標(biāo)

2.2 兩種白芨根際微生物組成

宏基因組測(cè)序結(jié)果顯示, 單個(gè)樣品測(cè)序量超過(guò)10 G, 平均序列數(shù)量達(dá)到3 600萬(wàn), 表明微生物測(cè)序量充分且波動(dòng)較小. 如表2所示, BOS和BSS微生物種群分類結(jié)果中, 53.01%和59.94%的序列為未知物種. 兩種白芨根際中微生物序列占比分別為41.16%和33.32%, BOS組略高于BSS組. 白芨主要微生物相對(duì)豐度顯示, 不同分類學(xué)水平上的微生物重復(fù)度呈現(xiàn)較高水平, 其中以細(xì)菌含量最多, 分別為33.67%和25.66%, 其次是為真核生物, 分別為1.33%和1.29%, 再次為病毒, 分別為0.15%和0.16%.

表2 黃花和紫花白芨根際微生物測(cè)序結(jié)果

在門水平上共檢測(cè)到56個(gè)菌門, 其中變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Antinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)含量占比較高, 三者在白芨樣品中的平均含量都超過(guò)75%. 在屬水平上共檢測(cè)到1 666個(gè)菌屬, 豐度最高的均為鏈霉菌屬(Streptomyces), 它在BOS和BSS樣品中的平均含量分別為37.5%和26.2%. 其次是假單胞菌屬(Pseudomonas), 第三是伯克霍爾德菌屬(Burkholderia). 另外, 由圖1可知, 在BOS和BSS樣本間的鏈霉菌屬和假單胞菌屬豐度均存在顯著性差異(p< 0.05).

圖1 門(P)和屬(G)微生物組成

2.3 兩種白芨樣品微生物α多樣性分析

在生態(tài)學(xué)中, 香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和Chao 1指數(shù)常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)[16]. 圖2結(jié)果顯示, 兩種白芨根際微生物存在顯著的差異性. 紫花白芨的Shannon和Chao 1指數(shù)均高于黃花白芨, 表明紫花白芨根際微生物的多樣性更加豐富.

圖2 兩種白芨樣品根際微生物多樣性

2.4 兩種白芨樣品微生物主成分分析

進(jìn)一步對(duì)白芨樣本相似度進(jìn)行分析, 結(jié)果如圖3所示. 由圖3可知, 同一組的樣本距離較近, 說(shuō)明組內(nèi)樣品均勻. 在屬水平上, PC1、PC2和PC3的總體解釋度達(dá)98.6%.

圖3 兩種白芨根際微生物組成主成分分析

2.5 兩種白芨根際微生物分析

對(duì)兩種白芨根際微生物進(jìn)行分類, 結(jié)果顯示, 差異水平從門到種均存在. 組間差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明(見(jiàn)圖4a), 在屬水平上有29個(gè)菌屬存在顯著性差異(P<0.05), 主要包括鏈霉菌屬、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、假單胞菌屬和鞘脂菌屬(Sphingobium)等菌屬;在種水平上有33個(gè)菌屬(見(jiàn)圖4b)存在顯著性差異(P<0.05), 主要包括威尼斯鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)、伍氏束縛菌(Conexibacter woesei)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、印度鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas indica)和黃克里伯菌(Kribbella flavida)等菌屬.

圖4 兩種白芨根際微生物差異情況

2.6 兩種白芨根際土壤微生物含量相關(guān)性分析

為研究?jī)煞N白芨根際土壤微生物豐度間的相互關(guān)系, 我們對(duì)兩組豐度排名前17的微生物進(jìn)行相關(guān)性分析, 結(jié)果如圖5所示, 它們分別為棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、分枝菌酸桿形菌屬(Mycolicibacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanes)、根瘤菌屬(Rhizobium)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、鏈霉菌屬、類諾卡氏菌屬、紅球菌屬(Rhodococcus)、微桿菌屬(Microbacterium)、擬無(wú)枝菌酸菌屬(Amycolatopsis)、諾卡菌屬( Nocardia)、假單胞菌屬、鞘脂菌屬、伯克霍爾德氏菌屬 、貪銅菌屬(Cupriavidus)和堆囊菌屬(Sorangium). 中慢生根瘤菌屬與鏈霉菌屬、類諾卡氏菌屬、紅球菌屬、微桿菌屬、諾卡菌屬和分枝桿菌屬呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系, 且相關(guān)性較高. 分枝菌酸桿形菌屬與12個(gè)屬呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系. 鏈霉菌屬與中慢生根瘤菌屬、棒狀桿菌屬和游動(dòng)放線菌屬等6個(gè)屬呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系, 與假單胞菌屬和根瘤菌屬呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系, 這可能與鏈霉菌屬產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物抑制了假單胞菌屬和根瘤菌屬微生物的生長(zhǎng)相關(guān)[17-18]. 假單胞菌屬與9個(gè)屬呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系, 類似的報(bào)道在多種植物根際中也被觀察到. 此外, 不同微生物豐度之間呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)關(guān)系(p<0.05), 說(shuō)明不同微生物間互作密切, 共同影響著白芨根際營(yíng)養(yǎng)代謝過(guò)程. 土壤中微生物是由多種菌群構(gòu)成, 各類菌群之間形成相互促進(jìn)或抑制的關(guān)系是必然且合理的, 而這種競(jìng)爭(zhēng)通常是對(duì)能源和物資的競(jìng)爭(zhēng), 被稱為生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng), 其最終目標(biāo)是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)或共生的手段使種群生態(tài)適應(yīng)性最大化[19]. 通過(guò)分析不同微生物之間含量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn), 伯克霍爾德氏菌屬的存在會(huì)促進(jìn)纖維堆囊菌屬、貪銅菌屬含量增加. 這是因?yàn)椴嘶魻柕率暇且环N在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、適應(yīng)環(huán)境方面十分有效的微生物[20]. 該結(jié)論與Zang等[21]關(guān)于伯克霍爾德氏菌屬對(duì)植物有益, 可以促進(jìn)部分有益菌定殖的結(jié)論相一致, 所以認(rèn)為在植物根際微生物菌群之間存在一定的促進(jìn)關(guān)系是合理的. 鏈霉菌屬是一類能產(chǎn)生重要抗生素的類群, 是重要的藥用資源. 研究發(fā)現(xiàn), 該屬?gòu)V泛分布于鹽堿度較高的土壤和極端環(huán)境中[22], 這有利于改善和提高白芨根系發(fā)育以及對(duì)外界環(huán)境脅迫的適應(yīng)性.

注釋:綠點(diǎn)代表不同微生物, 點(diǎn)的大小代表其豐度的大小, 紅色、藍(lán)色連接線分別表示兩種土壤微生物之間呈現(xiàn)正相關(guān)、負(fù)相關(guān)關(guān)系, 線的粗細(xì)程度代表兩類菌相關(guān)性絕對(duì)值的大小.圖5 根際與非根際土壤微生物相關(guān)性分析

3 結(jié)論

宏基因組測(cè)序結(jié)果顯示, 兩種白芨根際微生物菌群種類豐富, 紫花白芨根際微生物的物種豐富度比黃花白芨微生物物種豐度更高, 它們的微生物菌群差異水平從門到種均存在. 這些豐度較高的根際微生物存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)性.