姜玲玲,牛小霞,劉 強(qiáng),張 剛,王 璞,李 勇

(寧夏大學(xué)生命科學(xué)院 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,銀川 750021)

隨著我國經(jīng)濟(jì)實(shí)力和人民生活水平的逐步提高,牛肉的需求量也在不斷增加,寧夏作為肉牛養(yǎng)殖大省,肉牛飼養(yǎng)量增長迅猛。“十四五”規(guī)劃提出“到2025年,全區(qū)肉牛飼養(yǎng)量將達(dá)到263萬頭”。肉牛養(yǎng)殖模式向著規(guī)?；?、集約化和標(biāo)準(zhǔn)化不斷發(fā)展。目前,寧夏存在兩種極具特色的肉牛養(yǎng)殖模式:散養(yǎng)模式和規(guī)?；B(yǎng)殖模式。散養(yǎng)模式作為最原始、最基礎(chǔ)的自繁自養(yǎng)自育養(yǎng)殖模式,存在于半農(nóng)半牧區(qū);規(guī)?；B(yǎng)殖模式具有高投資、高產(chǎn)出、養(yǎng)殖周期短等特點(diǎn),存在于農(nóng)場及城市周邊。盡管肉牛養(yǎng)殖是寧夏地區(qū)的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè),但腹瀉問題一直是困擾養(yǎng)殖戶的重要難題之一,其病因極其復(fù)雜,除飼養(yǎng)管理引起的非感染性因素外,以病毒為主的感染性因素引起的腹瀉病防控難度較大,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前,已有研究人員對包括牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus, BCoV)、牛輪狀病毒(bovine rotavirus, BRV)、牛諾瓦病毒(bovine norovirus, BNoV)及牛星狀病毒(bovine astrovirus, BAstV)在內(nèi)的牛腹瀉相關(guān)病毒的結(jié)構(gòu)、致病機(jī)制及分子免疫方面做了大量研究[1-6],但新腹瀉病原不斷出現(xiàn),且各病毒存在混合感染,導(dǎo)致肉牛腹瀉病防控難度不斷增加。因此,本研究對寧夏地區(qū)肉牛腹瀉相關(guān)病毒進(jìn)行RT-PCR檢測,分析不同養(yǎng)殖模式、不同地區(qū)的病毒感染及混合感染情況,并進(jìn)行主要病原的遺傳進(jìn)化分析,以期為寧夏肉牛腹瀉病的綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本實(shí)驗(yàn)室于2021年1月—2022年7月在寧夏銀川市、固原市和吳忠市隨機(jī)采集肉牛拭子樣本293份,其中散養(yǎng)肉牛樣本139份、規(guī)模化養(yǎng)殖肉牛樣本154份。

1.2 試劑與儀器

病毒基因組RNA提取試劑盒(DP315)、DNA Marker(MD102)購自天根生化科技有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(6210A)購自寶生物工程(大連)有限公司,2×PCR Mix(BL553D)、瓊脂糖(BS081)以及核酸染料(BS354B)購自Biosharp生物公司。TC-512 PCR擴(kuò)增儀購自英國Bibbby科技有限公司,凝膠成像儀、電泳儀購自美國伯樂科技有限公司,離心機(jī)購自賽默飛世爾科技公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank公布的各腹瀉病毒序列,針對BRVVP7基因、BVDV 5′UTR基因、BCoVN基因、BNoVRdRp基因以及BAstVORF1ab基因運(yùn)用DNA star、Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。引物由生工生物工程股份有限公司合成。

表1 牛腹瀉相關(guān)病毒的引物信息Table 1 Primer information for bovine diarrhea-associated viruses

1.4 樣本的處理

將采集的樣本從液氮取出,置于4 ℃融化。渦旋振蕩10 min使棉簽上樣本完全溶解,取懸液4 ℃,12 000 r·min-1離心10 min,棄沉淀后進(jìn)行核酸提取。

1.5 RNA提取及RT-PCR檢測

按照天根病毒基因組提取試劑盒提取拭子上清中RNA,根據(jù)TaKaRa反錄說明書將RNA進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,體系(25 μL)如下:2×Taq plus Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL,dd H2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,反應(yīng)35個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果、拍照。

1.6 擴(kuò)增產(chǎn)物序列測定與分析

按照DNA膠回收試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化,將膠回收產(chǎn)物送至庫美生物科技有限公司測序。通過NCBI-BLAST將測序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的國內(nèi)外病毒序列進(jìn)行比對分析。利用MEGA 7.0軟件的鄰位相接法(Neighbor-joining法)進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析;采用DNA star 軟件Meg Align進(jìn)行序列比對和同源性比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同腹瀉病毒檢測結(jié)果

對寧夏地區(qū)293份肉牛樣本進(jìn)行RT-PCR檢測,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后在紫外線光下可觀察到大小為300 bp(BVDV)、444 bp(BCoV)、652 bp(BRV)、286 bp(BNoV)和392 bp(BAstV)的條帶(圖1),與預(yù)期片段大小相符,表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物特異性強(qiáng)。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),寧夏全區(qū)肉牛BVDV、BCoV、BRV、BNoV、BAstV陽性率分別為41.64%、41.98%、59.39%、50.51%、25.26%。

5種腹瀉病原混合感染情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示,0種、1種、2種、3種、4種及5種病毒感染及混合感染占比分別為9.9%、20.48%、27.30%、22.87%、18.09%、1.37%。單種病毒感染數(shù)最多的是BRV,有20份;兩種病毒感染數(shù)最多的是BRV+BNoV,感染數(shù)為20;3種病毒混合感染數(shù)最多的是BVDV+BRV+BNoV,感染數(shù)為19;4種病毒混合感染數(shù)最多的是BVDV+BCoV+BRV+BoAstV,感染數(shù)高達(dá)17。結(jié)果表明,寧夏地區(qū)病毒腹瀉主要以BRV、BNoV、BVDV感染及其混合感染為主。

A. 腹瀉病毒混合感染占比;B～E. 0種、1種、2種、3種、4種病毒混合感染A. Proportion of diarrhea virus mixed infection; B-E. Zero, one, two, three, four kinds of virus mixed infection圖2 不同腹瀉病毒感染情況Fig.2 Different diarrhoea virus infections

2.2 不同養(yǎng)殖模式檢測結(jié)果

對139份散養(yǎng)肉牛樣本、154份規(guī)?；B(yǎng)殖肉牛樣本RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),散養(yǎng)模式下腹瀉相關(guān)病毒陽性率普遍高于規(guī)?；B(yǎng)殖,如散養(yǎng)模式下BVDV、BRV、BNoV、BAstV陽性率遠(yuǎn)高于規(guī)?；B(yǎng)殖(圖3A);散養(yǎng)模式下病毒混合感染情況也較規(guī)?；B(yǎng)殖嚴(yán)重,散養(yǎng)模式下兩種以上腹瀉病毒混合感染率高達(dá)56.43%,規(guī)?；B(yǎng)殖模式下陽性率僅為29.40%(圖3B)。因此,規(guī)?；B(yǎng)殖一定程度上降低了腹瀉相關(guān)病毒的感染及混合感染風(fēng)險。

A．各腹瀉病毒陽性率;B. 腹瀉病毒混合感染情況A. Positive rate of each diarrhea virus; B. Mixed infection of various diarrhea viruses圖3 不同養(yǎng)殖模式下腹瀉病毒檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of diarrhea virus under different breeding modes

2.3 不同地區(qū)檢測結(jié)果

對寧夏82份銀川市、71份固原市、140份吳忠市肉牛樣本的RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),銀川市肉牛腹瀉相關(guān)病毒總陽性率為86.59%;固原市腹瀉病毒總陽性率為92.96%;吳忠市腹瀉病毒總陽性率為90.71%(圖4A)。銀川市以1種、2種腹瀉相關(guān)病毒感染為主,陽性率均為32.93%;固原市以2、3種病毒混合感染為主,陽性率分別為36.62%、25.35%;吳忠市以3、4種病毒感染混合為主,陽性率分別為27.14%、29.29%。各地區(qū)5種病毒混合感染普遍較低,均低于4%(圖4B)。由此說明,寧夏地區(qū)病毒性腹瀉在不同地區(qū)、不同病毒差異明顯,且混合感染較為嚴(yán)重。

A. 各腹瀉病毒陽性率;B. 腹瀉病毒混合感染情況A. Positive rate of each diarrhea virus; B. Mixed infection of various diarrhea viruses圖4 不同地區(qū)腹瀉病毒檢測結(jié)果Fig.4 Diarrheal virus test results in different regions

2.4 主要腹瀉病原遺傳進(jìn)化分析

對BVDV陽性樣本的5′UTR基因片段進(jìn)行回收純化并測序,獲得17條核苷酸序列,上傳至GenBank(登錄號為OQ513857～OQ513873)。應(yīng)用DNA star軟件對5′UTR基因序列與NCBI中上傳的BVDV序列進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)此研究中所有5′UTR基因序列均與GenBank中已公布的BVDV-1e的同源性最高,核苷酸序列一致性為75.30%～99.62%。通過Mega軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),測序的17個BVDV 5′UTR基因序列均與BVDV-1e聚集在同一分支上,與同亞型的IT99-3755、3186V6株親緣關(guān)系較近(圖5A)。

A. BVDV遺傳進(jìn)化樹;B. BNoV遺傳進(jìn)化樹;C. BRV遺傳進(jìn)化樹;D. BCoV遺傳進(jìn)化樹A. BVDV genetic evolution tree; B. BNoV genetic evolutionary tree; C. BRV genetic evolutionary tree; D. BCoV genetic evolutionary tree圖5 肉牛腹瀉相關(guān)病毒遺傳進(jìn)化分析Fig.5 Genetic evolution analysis of diarrhea related viruses in beef cattle

對BNoV陽性樣本的RdRp基因片段進(jìn)行回收純化并測序,獲得的25條核苷酸序列,上傳至GenBank(登錄號:OQ430676～OQ3430682)。應(yīng)用DNA star軟件對RdRp基因序列與NCBI中上傳的BNoV序列進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)所有RdRp基因序列均與GenBank中已公布的BNoV GⅢ.2型同源性最高,核苷酸序列一致性為74.30%～99.18%。通過Mega軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),測序的25個BNoVRdRp基因序列均位于BNoV GⅢ.2分支上,與大多數(shù)中國株(Bo/SDA-3/18/CH等)和埃及株(GIII.2/Bo/BNoV/EGY)遺傳進(jìn)化關(guān)系較近(圖5B)。

對BRV陽性樣本的VP7基因片段進(jìn)行回收純化并測序,獲得的2條核苷酸序列,上傳至GenBank(登錄號:OQ513855、OQ513856)。應(yīng)用DNA star軟件對VP7基因序列與NCBI中上傳的BRV序列進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)2條VP7基因序列與GenBank中已公布的BRV G1亞型同源性最高,核苷酸序列一致性為86.43%～100.00%。通過Mega軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),VP7基因序列與BRV G1亞型遺傳距離最近,與同亞型的T449株聚在同一分支上,一致性高達(dá)100%(圖5C)。

對BCoV陽性樣本的N基因PCR片段進(jìn)行回收純化并測序,獲得的14條核苷酸序列,上傳至GenBank(登錄號:OQ513841～OQ513854)。應(yīng)用DNA star軟件對N基因序列與NCBI中收錄的BCoV序列進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)此研究中的N基因序列與GenBank中已公布的BCoV核苷酸序列一致性為78.26%～100.00%。通過Mega軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),測序的BCoVN基因序列與法國株(登錄號:KT318096、KT318085)同源性最近,聚在一個分支上(圖5D)。

3 討 論

近年來,以腹瀉為主要特征的疫病與日俱增,給寧夏地區(qū)肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn),寧夏地區(qū)肉牛的散戶養(yǎng)殖質(zhì)量及經(jīng)濟(jì)效益均低于規(guī)?；B(yǎng)殖;肉牛養(yǎng)殖規(guī)模越大,養(yǎng)殖技術(shù)效率水平越高,生產(chǎn)效益也隨之增加[7]。病毒性病原引起的腹瀉嚴(yán)重影響肉牛發(fā)育及成活率,目前國內(nèi)除BVDV有滅活疫苗外,其他腹瀉病毒(BCoV、BRV、BNoV、BAstV)尚無特效治療方法[8]。此外,牛腹瀉相關(guān)病毒均為RNA病毒,其基因組極易發(fā)生突變、重組和缺失等變異,使其毒力和致病力增強(qiáng),同時也增加了疫苗研制難度[9]。牛腹瀉性疾病難以根除另一大難題在于肉牛腹瀉往往不是由單一病原引起的,而是多種病原微生物混合感染所致[10-12]。因此,肉牛腹瀉疾病的防控在安全和效益方面都起著至關(guān)重要的作用。流行病學(xué)調(diào)查是疫病防控的基礎(chǔ),而防控的根本是檢測。PCR/RT-PCR作為分子生物學(xué)檢測的核心技術(shù)之一,相較于其他檢測方法,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn),是病原流行病學(xué)調(diào)查最常用的檢測手段[13]。Zhang等[14]對中國西部385頭奶牛鼻黏液進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果顯示,BVDV陽性率為42.34%,與BCoV混合感染率為0.78%。Zhu等[15]對東北黑龍江省奶牛場和肉牛場1 016頭腹瀉牛樣本進(jìn)行BCoVN基因的RT-PCR檢測,結(jié)果顯示BCoV陽性率為15.45%。Chen等[16]對中國BRV感染率進(jìn)行系統(tǒng)評價和薈萃分析,發(fā)現(xiàn)牛BRV匯總患病率高達(dá)46%。孫吉等[17]應(yīng)用多重RT-PCR方法對四川省220份牦牛腹瀉樣本進(jìn)行BCoV、BVDV、BNoV檢測,結(jié)果顯示BNoV檢出率為5.9%,BVDV和BCoV無檢出;也證實(shí)牛腹瀉病通常由兩種及以上的病毒共同感染所致。

本研究對寧夏地區(qū)肉牛腹瀉相關(guān)病毒(BVDV、BCoV、BRV、BNoV、BAstV)進(jìn)行了RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)寧夏全區(qū)肉牛各腹瀉病毒陽性率在25.26%～59.39%,病毒腹瀉主要以BRV、BNoV、BVDV感染極其混合感染為主。寧夏地區(qū)普遍存在腹瀉病毒的感染,可能是由于肉牛的頻繁引種與交易;寧夏極端天氣導(dǎo)致肉牛抵抗力下降,使得病毒在牛群中迅速傳播[18]。混合感染的發(fā)生,一方面是由于肉牛感染某種病毒后產(chǎn)生免疫耐受,免疫力下降,造成易感染其他病毒[19];另一方面,牛群接觸病原不斷積累的同時也增加了病毒變異風(fēng)險[20]。散養(yǎng)模式下肉牛腹瀉相關(guān)病毒感染及混合感染情況較規(guī)模化養(yǎng)殖嚴(yán)重。究其原因,主要是由于規(guī)模化肉牛場具有專業(yè)的飼養(yǎng)模式、飼養(yǎng)人員、獸醫(yī)人員,有效預(yù)防了腹瀉病毒感染及進(jìn)一步傳播,從而規(guī)模牛場表現(xiàn)為較低的肉牛腹瀉病毒陽性率及輕微的混合感染[21]。寧夏銀川市、固原市、吳忠市肉牛腹瀉病毒的感染及混合感染差異明顯,這可能與各地免疫程序、養(yǎng)殖規(guī)模、飼養(yǎng)方式以及病毒本身變異及多樣性有關(guān)。此外,研究發(fā)現(xiàn)有些肉牛并不表現(xiàn)出臨床癥狀,但在其體內(nèi)檢測到了腹瀉相關(guān)病毒,可能是由于肉牛感染病毒后表現(xiàn)為持續(xù)性感染或者隱性感染,成為潛在的長期性傳染源[22]。

通過對各腹瀉病毒RT-PCR檢測陽性樣本進(jìn)行遺產(chǎn)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),BVDV陽性樣本屬于BVDV-1e型。據(jù)國內(nèi)外研究報(bào)道,亞洲主要流行BVDV-1m、1n、1o、1p、1q和1v亞型,而歐洲國家主要流行BVDV-1a、1b、1d、1e和1f[23]。一方面說明BVDV在適應(yīng)環(huán)境的過程中表現(xiàn)出高度突變頻率,另一方面說明牛群廣泛的貿(mào)易與引種存在問題,需加大檢查力度。BNoV陽性樣本屬于為GⅢ.2亞型,與已報(bào)道的大多數(shù)中國株和埃及株遺傳進(jìn)化關(guān)系較,提示寧夏地區(qū)存在國內(nèi)和國際兩種病毒傳播途徑[24]。BCoV陽性樣本N基因與法國株同源性較近。由于N基因編碼核衣殼蛋白,其高度保守[5],因此該地區(qū)存在BCoV的國際間傳播途徑,應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)本地區(qū)流行毒株的監(jiān)控。BRV陽性樣本與G1亞型的豬輪狀病毒C95株聚在同一小支上,表明該地區(qū)可能存在感染豬的BRV流行株,演化方向較廣,需要進(jìn)一步擴(kuò)大對當(dāng)?shù)仄渌倚蟮牧餍胁W(xué)調(diào)查。

結(jié)合寧夏地區(qū)肉牛腹瀉病的流行及感染情況,應(yīng)采取綜合措施進(jìn)行防控和進(jìn)化。在環(huán)境衛(wèi)生方面,定時清理牛舍糞便和污水,開展牛舍消毒、進(jìn)出場消毒。在飼養(yǎng)管理方面,提倡牛初乳喂養(yǎng)犢牛,從而獲得母源抗體;病牛及時隔離治療,合理使用抗生素類藥物。在疫苗接種方面,制定合理的疫苗接種方案,將BVDV等疫苗納入待產(chǎn)牛和犢牛的疫苗計(jì)劃中。在病原監(jiān)測方面,加強(qiáng)引種檢疫工作;定期進(jìn)行腹瀉相關(guān)病毒的流行病學(xué)調(diào)查,及時作出相關(guān)疾病的預(yù)警。同時,應(yīng)加快腹瀉病毒流行毒株的分離,篩選出免疫原性好的毒株進(jìn)行疫苗研制。

4 結(jié) 論

本研究對寧夏地區(qū)肉牛腹瀉相關(guān)病毒進(jìn)行RT-PCR檢測與遺傳進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)該地區(qū)肉牛普遍存在腹瀉病毒的感染及混合感染;散養(yǎng)模式下肉牛腹瀉病毒的感染及混合感染情況較規(guī)模化養(yǎng)殖嚴(yán)重;病毒性腹瀉在不同地區(qū)、不同病毒差異明顯;寧夏地區(qū)BVDV流行株為1e亞型,BRV流行株為G1亞型,BNoV流行株為GⅢ.2亞型,BCoV流行株與法國株遺傳進(jìn)化關(guān)系較近。本研究為寧夏肉牛腹瀉疾病的防控提供了參考。