韓坤良,蘭 偉,胡 新,崔亞東,孔祥峰*

(1.阜陽師范大學生物與食品工程學院,阜陽 236037;2.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點實驗室,長沙 410125)

機體內(nèi)氧化-還原水平失衡是眾多疾病的病理生理基礎[1],家禽生產(chǎn)中的大部分問題均與氧化應激有關。隨著產(chǎn)蛋日齡的增加,產(chǎn)蛋后期蛋雞機體內(nèi)發(fā)生代謝紊亂和氧化應激[2],對其生產(chǎn)性能、機體健康和產(chǎn)品質(zhì)量等均會產(chǎn)生不利影響[3]。因此,通過營養(yǎng)手段增強機體的抗氧化性能,對保障蛋雞正常生產(chǎn)具有重要意義。中藥的優(yōu)點包括無有害殘留、毒副作用小和不易產(chǎn)生耐藥性等,可促進動物新陳代謝、增強機體抗氧化能力,是一類綠色飼料添加劑[4]?，F(xiàn)有研究顯示,飼糧添加蒲公英可增加蛋雞血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及總抗氧化能力(T-AOC),降低丙二醛(MDA)含量[5];添加女貞子提取物可顯著降低肉雞肝MDA含量,提高肝SOD活性[6];添加丹參可增加肉雞血清T-AOC,降低MDA含量[7]。筆者以“涼血利尿、祛瘀調(diào)經(jīng)”為組方原則,選用一定比例的益母草、女貞子、蒲公英和丹參等中藥材組方后進行超微粉碎,發(fā)現(xiàn)飼糧添加0.5%丹參+0.25%女貞子+0.25%蒲公英的超微粉后,試驗1～30 d蛋雞產(chǎn)蛋率顯著增加7.56%、料蛋比顯著降低4.98%,31～60 d產(chǎn)蛋率顯著增加4.00%,61～90 d平均日采食量顯著增加6.37%,1～120 d產(chǎn)蛋率顯著增加5.31%;飼糧添加0.3%益母草+0.2%丹參+0.25%女貞子+0.25%蒲公英后,試驗1～30和61～90 d蛋雞平均日采食量分別顯著增加3.91%和6.56%,試驗1～120 d產(chǎn)蛋率顯著增加5.22%[8]。這些復方中藥超微粉是否能夠通過改善產(chǎn)蛋后期蛋雞機體抗氧化性能來發(fā)揮上述效果尚不清楚。因此,本文研究了復方中藥超微粉對產(chǎn)蛋后期蛋雞機體抗氧化性能的影響,并從抗氧化信號通路方面探討其作用機理,為其作為飼料添加劑用于蛋雞生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、分組及飼養(yǎng)管理

試驗選用216只307日齡的健康新楊黑羽蛋雞隨機分為3組,每組8個重復,每個重復9只。試驗開始前各組產(chǎn)蛋率和體重均無顯著差異。對照組飼喂基礎飼糧,試驗組分別在基礎飼糧中添加復方1(0.5%丹參+0.25%女貞子+0.25%蒲公英)、復方2(0.3%益母草+0.2%丹參+0.25%女貞子+0.25%蒲公英)的超微粉。試驗所用中藥購自阜陽藥材加工廠。中藥復方制劑超微粉碎后過300目篩,其主要成分為多糖、多酚、黃酮、氨基酸、脂肪酸、微量元素和色素等物質(zhì)[6,9]。基礎飼糧參照NRC(1994)蛋雞營養(yǎng)需要配制,其組成及營養(yǎng)水平見表1。預試期7 d,正試期120 d。試驗期間每天光照16 h,自由飲水,每天喂食2次(09:00、15:00)。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets (air-dry basis) %

1.2 樣品采集與處理

分別于試驗第60和120天,每組隨機選取8只體重相近且健康狀態(tài)良好的蛋雞,禁飼12 h(不禁飲水)后稱重,翅靜脈采血5 mL,肝素抗凝,3 500 r·min-1離心10 min分離血漿樣品-20 ℃保存,用于氧化-抗氧化指標測定;頸動脈放血處死,采集肝組織樣品,液氮速凍后-80 ℃保存,用于氧化-抗氧化指標測定及相關基因表達量的分析。

1.3 血漿與肝氧化-抗氧化指標測定

稱取肝組織0.100 0 g,加入9倍冰冷的PBS溶液,置于EP管中研磨,2 500 r·min-1離心10 min,取上清液。取血漿和肝組織勻漿上清液,采用ELISA試劑盒(上海滬宇生物科技有限公司)測定GSH-Px、CAT和SOD活性,采用生化試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定MDA含量和T-AOC,按照試劑盒說明書在酶標儀(Infinite M200 PRO)上測定。

1.4 肝組織相關基因表達水平檢測

取肝組織液氮研磨,TRIzol法提取總RNA,用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計測定總RNA濃度,用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞生物工程有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以β-actin基因為內(nèi)參,用PCR儀(LightCycler? 480II,Roche)檢測抗氧化相關基因的mRNA表達水平。20 μL反應體系包括:2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1),cDNA 0.8 μL,ddH2O 8.4 μL。PCR反應條件為:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火/延伸30 s,40個循環(huán)。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表2。用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR所用引物序列Table 2 Primer sequences used for real-time fluorescence quantitative PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016整理后采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法進行多重比較。結(jié)果以“平均值±標準差”表示。P<0.05為差異顯著,0.05≤P<0.10為有變化趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 復方中藥超微粉對蛋雞血漿氧化-抗氧化指標的影響

由表3可知,試驗第60天,復方1組和2組血漿SOD活性和MDA含量顯著低于對照組(P<0.05);試驗第120天,復方2組血漿CAT活性和MDA含量顯著高于對照組(P<0.05),復方1組血漿CAT活性和MDA含量顯著低于復方2組(P<0.05)。

表3 復方中藥超微粉對蛋雞血漿氧化-抗氧化指標的影響Table 3 Effects of compound Chinese herb ultrafine powder on plasma oxidant-antioxidant indexes of laying hens

2.2 復方中藥超微粉對蛋雞肝組織氧化-抗氧化指標的影響

由表4可知,試驗第60天,與對照組相比,復方1組和2組肝組織GSH-Px、SOD和CAT活性以及T-AOC顯著增加(P<0.05),復方1組肝組織MDA含量顯著降低(P<0.05);與復方1組相比,復方2組肝組織GSH-Px活性和T-AOC顯著增加、SOD和CAT活性顯著降低(P<0.05)。試驗第120天,與對照組相比,復方1組和2組肝組織GSH-Px、SOD和CAT活性顯著增加(P<0.05),復方1組MDA含量顯著降低(P<0.05);與復方1組相比,復方2組肝組織GSH-Px活性顯著增加、CAT活性顯著降低(P<0.05)。

表4 復方中藥超微粉對蛋雞肝組織氧化-抗氧化指標的影響Table 4 Effects of compound Chinese herb ultrafine powder on liver oxidant-antioxidant indexes of laying hens

2.3 復方中藥超微粉對蛋雞肝組織抗氧化相關基因mRNA表達量的影響

由圖1可知,試驗第60天,與對照組相比,復方1組蛋雞肝組織NQO1和GST的mRNA表達量顯著上調(diào)(P<0.05),復方2組肝組織GSH-Px2、GSH-Px3、GSH-Px4、SOD2、SOD3、TXNRD1、TXNRD3、NQO1和HO-1的mRNA表達量顯著上調(diào)、SOD1的mRNA表達量顯著下調(diào)(P<0.05);與復方1組相比,復方2組肝組織GSH-Px2、GSH-Px3、GSH-Px4、SOD2、SOD3、TXNRD1、TXNRD3、NQO1和HO-1的mRNA表達量顯著上調(diào),CAT和GST的mRNA表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。試驗第120天,與對照組相比,復方2組肝組織Nrf2和GSH-Px2的mRNA表達量顯著上調(diào)、GSH-Px1的mRNA表達量顯著下調(diào)(P<0.05);與復方1組相比,復方2組肝組織Nrf2、GSH-Px2、TXNRD1和TXNRD3的mRNA表達量顯著上調(diào)(P<0.05)。

A. 試驗第60天肝抗氧化相關基因mRNA表達量;B.試驗第60天肝抗氧化相關信號通路基因mRNA表達量;C.試驗第120天肝抗氧化相關基因mRNA表達量;D.試驗第120天肝抗氧化相關信號通路基因mRNA表達量。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)A. mRNA expression of liver antioxidant-related gene on day 60; B. mRNA expression of liver antioxidant related signaling pathway gene on day 60; C. mRNA expression of liver antioxidant related genes on day 120; D. mRNA expression of liver antioxidant related signaling pathway genes on day 120. Bars with different letters mean significant difference (P<0.05)圖1 復方中藥超微粉對蛋雞肝組織抗氧化相關基因mRNA表達量的影響Fig.1 Effect of compound Chinese herb ultrafine powder on the liver mRNA expression of antioxidant related genes in laying hens

3 討 論

MDA是氧化應激的標志物,其含量反映了機體氧化損傷的程度;GSH-Px、SOD和CAT等抗氧化酶是機體抗氧化損傷的第一道防線,它們可共同反映機體抗氧化的潛力[10]。本試驗中,飼糧添加中藥復方2后血漿CAT活性顯著增加,添加中藥復方1和2后血漿MDA含量呈先降低后升高趨勢,說明試驗前期機體抗氧化性能增強,試驗后期蛋雞自由基產(chǎn)生較多,可能與試驗后期蛋雞體內(nèi)抗氧化酶類活性下降、自由基累積引起脂質(zhì)過氧化[11]、損傷細胞功能[12]有關。有報道表明,飼糧添加蒲公英[5]和益母草[13]可增加蛋雞血漿GSH-Px、CAT、SOD和T-AOC水平,降低MDA含量。這與本試驗結(jié)果不盡一致,可能與中草藥的配伍和添加劑量有關,具體原因還需要進一步研究。

肝組織的抗氧化指標是反映蛋雞機體健康狀況的重要指標[14-15]。本試驗中,飼糧添加中藥復方1和2后肝組織GSH-Px、SOD、CAT活性和T-AOC均有所增加、MDA含量有所降低,說明肝組織清除自由基的能力增強,可能是因為益母草[16]、女貞子[17]、蒲公英[18]和丹參[19]等中藥中含有的多糖、黃酮類物質(zhì)可有效提高動物機體的抗氧化水平。張金漢等[20]報道,飼糧添加女貞子等中藥可顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋雞肝組織T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT活性,降低MDA含量;洪玲玲等[6]研究表明,飼糧添加女貞子可增加肉雞肝組織SOD活性、降低肝組織MDA含量,這與本研究結(jié)果一致。

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1(Keap1)/核因子E2相關因子2(Nrf2)/抗氧化反應元件(ARE)信號通路可抵抗機體的氧化應激反應,正向調(diào)控下游相關抗氧化蛋白酶的合成,被認為是機體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路[21];GPXs和TXNRD是動物體內(nèi)兩種重要的抗氧化系統(tǒng)[22],GST、HO-1和NQO 1均是必不可少的解毒酶,在清除體內(nèi)ROS等有害物質(zhì)中發(fā)揮重要作用[23]。本試驗中,飼糧添加中藥復方1第60天肝NQO1的mRNA表達量顯著上調(diào),添加中藥復方2第60天肝GSH-Px2、GSH-Px3、GSH-Px4、SOD2、SOD3、TXNRD1、TXNRD3、NQO1和HO-1的mRNA表達量顯著上調(diào),與肝組織GSH-Px活性的增加趨勢一致;添加中藥復方2第120天蛋雞肝組織Nrf2和GSH-Px2的mRNA表達量顯著上調(diào),與肝組織中T-AOC、GSH-Px和CAT等抗氧化酶活性的增加趨勢一致,提示機體的抗氧化性能增強。這可能是因為益母草[16]、女貞子[17]、蒲公英[18]和丹參[19]等中藥中的黃酮類物質(zhì)能夠激活Keap1/-Nrf2/ARE、Nrf2/HO-1信號通路[24],增強動物機體的抗氧化能力[25]。

4 結(jié) 論

綜上所述,在本試驗條件下,飼糧添加由益母草、丹參、女貞子和蒲公英組成的復方中藥超微粉可通過增加血漿和肝組織抗氧化酶活性、激活肝組織相關抗氧化信號通路增強蛋雞的抗氧化能力,且兩個復方對機體抗氧化能力的調(diào)控作用具有靶標特異性。