李在文,李 響,李小偉,李 飆,江明鋒*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,成都 610041;2.四川省龍日種畜場(chǎng),紅原 624401)

麥洼牦牛是乳肉兼用的高原型地方品種[1],乳蛋白質(zhì)含量高,具有穩(wěn)定的遺傳特性,對(duì)高寒牧區(qū)有著良好的適應(yīng)性,是我國(guó)珍稀的地方遺傳資源[2]。麥洼牦牛是全國(guó)21個(gè)牦牛地方優(yōu)良品種之一,列入《四川家畜家禽品種志》和《牛品種志》[1]。改革開放后,川西北高原牧區(qū)推廣草場(chǎng)聯(lián)產(chǎn)責(zé)任承包制極大的促進(jìn)了牧區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,同時(shí)由于包產(chǎn)到戶導(dǎo)致麥洼牦牛群體變小,牧戶養(yǎng)殖牦牛近交系數(shù)上升,麥洼牦牛繁殖性能和生產(chǎn)性能快速下降,最終導(dǎo)致品種退化[3]。為了對(duì)麥洼牦牛進(jìn)行提純復(fù)壯,四川省龍日種畜場(chǎng)于2004年組建了純黑(毛色純黑)、粉嘴(毛色純黑,鼻唇部毛色為白色)和弗洛(出生時(shí)毛色為黑,隨著年齡增長(zhǎng)逐漸變白)3個(gè)核心群進(jìn)行麥洼牦牛保種選育[4]。

育種場(chǎng)擁有準(zhǔn)確的系譜對(duì)保證育種工作的正常開展、實(shí)施保種選育方案具有十分重要的意義[5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,已有多種方法對(duì)系譜不清的選育群體進(jìn)行系譜重建。各種DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)植物選育群體的系譜建立,能夠快速且準(zhǔn)確地構(gòu)建群體的系譜,有利于更精確的計(jì)算育種值、近交系數(shù)和親緣系數(shù)等育種參數(shù),使育種工作更加高效[6-8]。DNA測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,使獲取大量SNPs信息變得更加便宜和便捷[9]?；蚪M測(cè)序、基因芯片等高通量檢測(cè)技術(shù)在家畜近交系數(shù)、親緣關(guān)系及遺傳結(jié)構(gòu)等研究中得到了廣泛應(yīng)用[10-12],為家畜的系譜重建、育種和保種奠定了更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2011年Elshire等[13]開發(fā)了GBS技術(shù),與其他高通量測(cè)序技術(shù)相比,該技術(shù)具有步驟簡(jiǎn)單、快速、可重復(fù)性高和成本低等特點(diǎn)。目前,在群體遺傳學(xué)、遺傳圖譜構(gòu)建和親緣關(guān)系鑒定等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[14-16]。

受技術(shù)及經(jīng)濟(jì)條件限制,牦牛選育過(guò)程中往往面臨系譜不全甚至缺乏的情形,嚴(yán)重影響了牦牛育種進(jìn)程,導(dǎo)致牦牛缺乏高產(chǎn)優(yōu)良品種,我國(guó)僅有大通牦牛和和阿仕坦牦牛兩個(gè)培育品種[17]。在麥洼牦牛育種過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了系譜信息完整度較低,缺少關(guān)鍵親屬關(guān)系信息等問(wèn)題,嚴(yán)重遲滯了牦牛育種計(jì)劃的制定和執(zhí)行。本課題組以龍日種畜場(chǎng)的3個(gè)麥洼牦牛保種群為研究對(duì)象,進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序[18],通過(guò)獲得的SNPs分析3個(gè)保種群的親緣關(guān)系及近交程度,并嘗試重新構(gòu)建完整的系譜為后續(xù)的保種和育種工作服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2020年6月在四川省龍日種畜場(chǎng)進(jìn)行,以麥洼牦牛保種群為研究對(duì)象,從全黑群(QH)、粉嘴群(FZ)和弗洛群(FL)3個(gè)保種群中隨機(jī)選取406頭各年齡段的麥洼牦牛(具體數(shù)量見表1)。頸外靜脈采血,EDTA抗凝,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 3個(gè)保種群麥洼牦牛數(shù)量統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistics of the number of Maiwa yaks in the 3 preserved populations

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采用天根生物科技(北京)的血液DNA提取試劑盒,對(duì)全部血樣進(jìn)行DNA提取,采用Qubit?2.0測(cè)定DNA濃度,同時(shí)用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 參照文庫(kù)構(gòu)建方法[19],用MseI限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)檢測(cè)合格的DNA進(jìn)行酶切處理,在酶切片段兩側(cè)加上帶有barcode的接頭,然后PCR擴(kuò)增,再混合擴(kuò)增產(chǎn)物,選取所需片段建立文庫(kù)。構(gòu)建的文庫(kù)使用Qubit? 2.0進(jìn)行初步定量,稀釋至1 ng·μL-1后使用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行庫(kù)檢[20]。插入片段長(zhǎng)度符合預(yù)期后,采用q-PCR對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度>2 nmol·L-1),保證文庫(kù)質(zhì)量[21]。庫(kù)檢合格,依據(jù)不同文庫(kù)的有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求混池,隨后進(jìn)行Illumina Hi-seq PE150測(cè)序[22]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

1.3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控及SNP檢測(cè) 將測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件(Illumina Hi-seq測(cè)序平臺(tái))轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列,質(zhì)控后獲得有效序列。從NCBI獲得野牦牛Bosmutus(PRJNA221623)參考基因組,使用比對(duì)軟件Broadband Wireless Access (BWA)(參數(shù)為mem-t4-k32-M)[23]將獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行對(duì)比。采用SAMTOOLS[24]軟件檢測(cè)所有SNPs,根據(jù)以下條件過(guò)濾SNP位點(diǎn):測(cè)序深度>3×,缺失率<20%,最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)>0.05。獲得高質(zhì)量SNP位點(diǎn),用于后續(xù)研究。

1.3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 利用GCTA[25]軟件和R語(yǔ)言包(ggbiplot)基于個(gè)體間SNP的差異,進(jìn)行PCA分析;采用TreeBest1.9.2[26]計(jì)算遺傳距離矩陣,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 近交系數(shù)的計(jì)算 基于個(gè)體間SNP差異,采用GCTA軟件計(jì)算全部個(gè)體的近交系數(shù)(FIS)。將個(gè)體的近交水平分為以下4種近交程度[27]:①血親程度FIS≥1/8;②近親程度1/8≥FIS≥1/32;③中親程度1/32≥FIS≥1/128;④遠(yuǎn)親程度FIS≤1/128。

1.3.4 親緣系數(shù)計(jì)算及親緣關(guān)系G矩陣 基于血緣同源(identity-by-descent,IBD)信息,利用GCTA軟件計(jì)算所有個(gè)體間的親緣系數(shù)后用R version 3.6.3[28]進(jìn)行聚類分析,并用pheatmap 1.0.12軟件包繪制出406×406的矩陣。將親緣系數(shù)按其大小分為親子、全同胞、半同胞等不同的關(guān)系。

1.3.5 親緣關(guān)系分析及整理方法 由于麥洼牦牛多為兩年一胎或三年兩胎[29],當(dāng)二者年齡差小于3時(shí)必為同代,當(dāng)年齡差大于3則需要進(jìn)一步親屬關(guān)系判定。根據(jù)兩兩之間的親緣系數(shù)和年齡差,初步判定其親緣關(guān)系,具體判定條件見表2。

表2 親緣關(guān)系判定條件Table 2 Kinship determination condition

根據(jù)上述判定條件,用Excel 2016整理親緣系數(shù),并進(jìn)行性別、年齡、樣本編號(hào)及親緣系數(shù)等數(shù)據(jù)的處理。根據(jù)表2的條件,在Excel平臺(tái)中利用Visual Basic編輯器設(shè)置一個(gè)宏代碼,利用該宏代碼實(shí)現(xiàn)判定和整理歸納親緣關(guān)系信息的自動(dòng)化。

1.3.6 家系構(gòu)建 根據(jù)《畜禽遺傳資源保種場(chǎng)保護(hù)區(qū)和基因庫(kù)管理辦法》[30]要求,構(gòu)建家系要求在3個(gè)世代內(nèi)沒有血緣關(guān)系,則不同家系間親緣系數(shù)應(yīng)小于0.062 5。通過(guò)PLINK v1.90軟件計(jì)算個(gè)體間親緣關(guān)系,并利用最長(zhǎng)距離法進(jìn)行聚類分析。根據(jù)群體進(jìn)化樹的結(jié)果,利用MEGA v7軟件建立體現(xiàn)個(gè)體遺傳距離的聚類圖,以此進(jìn)行保種群的家系構(gòu)建。

育種工作中通常以優(yōu)良種公牛進(jìn)行較大規(guī)模的配種。尤其在推行人工授精的育種場(chǎng),優(yōu)良種公牛擁有較多的后代數(shù)量往往有利于獲得更好的遺傳進(jìn)展。因此,本研究對(duì)公牦牛血統(tǒng)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。從保種群中選取4～8歲的公牦牛,并在保種群進(jìn)化樹圖中標(biāo)出這些公牦牛所在位置。根據(jù)MAF和缺失率進(jìn)行SNP過(guò)濾,統(tǒng)計(jì)個(gè)體間的遺傳距離,并根據(jù)NJ法進(jìn)行聚類分析,繪制出公牦牛進(jìn)化樹圖。

1.3.7 家系驗(yàn)證分析 為檢驗(yàn)構(gòu)建的家系效果,將個(gè)體按照構(gòu)建的家系分組并進(jìn)行遺傳多樣性分析,基于SNP采用GCTA軟件計(jì)算每個(gè)個(gè)體的FIS、He、Ho,并將家系內(nèi)個(gè)體的He、Ho、FIS取平均值作為每個(gè)家系的He、Ho、FIS。為衡量家系間的遺傳分化程度,用R語(yǔ)言包計(jì)算家系間的群體遺傳分化系數(shù)(FST)和群體遺傳距離(DR)。FST的取值范圍在0～1,FST=0～0.05:群體間遺傳分化可忽略不計(jì);FST=0.05～0.15:群體間存在中等程度的遺傳分化;FST=0.15～0.25:群體間存在較高程度的遺傳分化;FST≥ 0.25:群體間遺傳分化程度極高,不同群體間的等位基因已固定。

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA提取

提取全部樣本血液基因組DNA,DNA濃度范圍在40～120 ng·μL-1,經(jīng)電泳檢測(cè)(圖1)后發(fā)現(xiàn)DNA條帶整齊,無(wú)拖尾。表明提取的DNA符合試驗(yàn)要求。

M為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);S為標(biāo)準(zhǔn)品;1～15為樣品原液M is Trans 2 k plus; S is standard; 1-15 are samples stock solution圖1 部分牦牛樣本基因組DNA電泳圖Fig.1 Genomic DNA electrophoresis of partial yak samples

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出與質(zhì)控

本研究獲得有效堿基數(shù)279.21～2 456.34 Mb,共產(chǎn)生327.517 Gb原始測(cè)序序列,平均為806.69 Mb;過(guò)濾后共產(chǎn)生327.512 Gb有效序列,平均為806.68 Mb。堿基檢測(cè)錯(cuò)誤率為0.04%～0.06%,平均為0.04%;Q20質(zhì)量的堿基占比93.83%～97.58%,平均為95.73%;GC堿基含量為36.56%～40.28%,平均為38.88%;獲得有效讀長(zhǎng)數(shù)1.94～17.08 Mb,平均為5.60 Mb;有效讀長(zhǎng)比對(duì)到參考基因上的比例為92.6%～99.68%,平均為98.75%;測(cè)序深度為5.65×～31.64×,平均為14.33×,平均覆蓋度為3.46%。表明本次測(cè)序所獲數(shù)據(jù)可滿足后續(xù)分析要求。

2.3 SNP檢測(cè)

利用SAMTOOLS軟件檢測(cè)獲得數(shù)據(jù)的SNP位點(diǎn),共鑒定出1 628 805個(gè)SNPs位點(diǎn),經(jīng)質(zhì)控得到126 122個(gè)高質(zhì)量SNPs位點(diǎn)。獲得的高質(zhì)量SNPs與參考基因組序列進(jìn)行對(duì)比分析,圖2為質(zhì)控SNP位點(diǎn)數(shù)目及基因組序列長(zhǎng)度,可看出SNP的數(shù)目隨基因組序列片段長(zhǎng)度的增加而增加,SNP分布相對(duì)均勻。

豎軸表示基因組序列長(zhǎng)度,曲線表示SNPs數(shù)目The vertical axis indicates the genome sequence length and the curve indicates the number of SNPs圖2 質(zhì)控SNPs位點(diǎn)數(shù)與基因組序列片段長(zhǎng)度變化趨勢(shì)圖Fig.2 Variation trend of SNPs number and genome sequence length

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 PCA分析 經(jīng)計(jì)算PC1、PC2的貢獻(xiàn)率分別為4.75%、2.72%。由圖3可知,406頭麥洼牦牛聚成不同類群,FL群聚類緊密,與另外兩群部分個(gè)體聚在一起;QH群和FZ群存在明顯的分層,群內(nèi)個(gè)體分布不均勻,QH群部分個(gè)體脫離群體與FZ群聚在一起。

圖3 406頭麥洼牦牛PCA分析Fig.3 PCA analysis of 406 Maiwa yaks

2.4.2 群體進(jìn)化樹分析 從聚類分析NJ樹(圖4)可以看出,保種群可分為兩大支,其中一大支由QH群聚類形成,有個(gè)體與FZ群和FL群聚類在一起;另一大支由FL和FZ群組成,分化過(guò)程中FZ群?jiǎn)为?dú)形成一支,FL群也分離出一小支,但FL群部分個(gè)體與QH群和FZ群聚在一起。

淺灰色.QH群;黑色.FL群;深灰色.FZ群Light grey. QH;Black. FL;Dark grey. FZ圖4 406頭麥洼牦牛系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 406 Maiwa yaks

2.5 G矩陣分析

本研究利用GCTA軟件計(jì)算得到164 836個(gè)親緣關(guān)系對(duì),并繪制出保種群的親緣關(guān)系G矩陣,見圖5。圖中紅色對(duì)稱軸表示每個(gè)樣本與其本身親緣系數(shù),白色大多聚在對(duì)稱軸附近。左上角有兩個(gè)白色方塊構(gòu)成的矩形區(qū)域,表示群落間的親緣關(guān)系較近,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)區(qū)域個(gè)體均屬于QH群和FL群,這與群體進(jìn)化樹分析結(jié)果一致;右下角僅有少量白色方塊,表示個(gè)體間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。右上角零星散落的少許白色方塊可能是近交導(dǎo)致的部分個(gè)體親緣系數(shù)過(guò)大。

矩陣的右側(cè)和下側(cè)顯示樣本編號(hào),每個(gè)小方塊表示兩個(gè)個(gè)體的親緣關(guān)系,紅色方塊表示該樣本與本身的親緣系數(shù),白色表示個(gè)體間親緣關(guān)系較近,藍(lán)色表示個(gè)體間無(wú)親緣關(guān)系The right and lower sides of the matrix show the samples number, each small square indicates the affinity of two individuals, red squares indicate the affinity coefficient between that sample and itself, white squares indicate close affinity between individuals, blue squares indicate no affinity between individuals圖5 保種群G矩陣圖Fig.5 Conserved group G matrix visualization results

通過(guò)GCTA軟件計(jì)算所有個(gè)體的近交系數(shù)(FIS),根據(jù)“1.3.3”判定個(gè)體的近親程度,以此驗(yàn)證親緣關(guān)系分析的可靠性。經(jīng)統(tǒng)計(jì),保種群共有11個(gè)血親程度個(gè)體,84個(gè)近親程度個(gè)體,121個(gè)中親程度個(gè)體,剩下190個(gè)遠(yuǎn)親程度個(gè)體。

2.6 親緣關(guān)系分析及結(jié)果整理

按照“1.3.5”中的方法判定保種群的親緣關(guān)系,共鑒定出134個(gè)全同胞關(guān)系,912個(gè)半同胞關(guān)系,136個(gè)疑似親子關(guān)系或全同胞關(guān)系,520個(gè)疑似半同胞關(guān)系或叔侄關(guān)系,205個(gè)疑似半同胞關(guān)系或叔侄關(guān)系或祖孫關(guān)系。由于麥洼牦牛多為兩年一胎或三年兩胎,對(duì)年齡在3歲之內(nèi)(同代)的親緣關(guān)系判定的準(zhǔn)確性較高,可直接判定出全同胞和半同胞關(guān)系,相關(guān)結(jié)果可直接用于保種選育。而另外幾種親緣關(guān)系(兩代及以上)的判定需要進(jìn)一步的遺傳分析。

2.7 家系構(gòu)建

2.7.1 保種群家系構(gòu)建 麥洼牦牛保種群的聚類如圖6所示。根據(jù)《畜禽遺傳資源保種場(chǎng)保護(hù)區(qū)和基因庫(kù)管理辦法》,將龍日種畜場(chǎng)麥洼牦牛劃分為12個(gè)家系,從右至左分別命名為G1～G12。從圖6可以看出,大部分家系中的個(gè)體數(shù)量及位置分布較為均勻,但G5、G6、G8和G11家系的遺傳距離較遠(yuǎn),聚在該家系的個(gè)體數(shù)目較少。

縱坐標(biāo)表示個(gè)體間遺傳距離,橫坐標(biāo)表示每個(gè)樣本編號(hào),序號(hào)代表家系編號(hào)The vertical coordinate indicates the genetic distance between individuals, the horizontal coordinate indicates each sample number, and the serial number represents the family line number圖6 麥洼牦牛家系聚類圖Fig.6 Cluster diagram of Maiwa yaks

2.7.2 公牦牛家系構(gòu)建 公牦牛分布進(jìn)化樹如圖7A所示,其黑色標(biāo)記表示公牦牛。從中可以直觀看出麥洼公牦牛在保種群中分布比較均勻,但與群體進(jìn)化樹分析對(duì)比,有28頭公牦屬于QH群,超過(guò)半數(shù);有10頭公牦牛屬于FZ群;FL群僅有4頭公牦牛。

A. 42頭麥洼公牦牛分布情況;B. 42頭麥洼公牦牛聚類圖:圖右側(cè)為公牦牛個(gè)體編號(hào);圖左側(cè)兩條豎線分別表示親緣系數(shù)為0.062 5、0.125 0,與聚類圖交叉即分為一個(gè)家系A(chǔ). Distribution of 42 Maiwa male yaks; B. Pedigree clustering of 42 Maiwa male yaks: On the right side of the picture is the individual number of male yak; The two vertical lines on the left side of the figure indicate the kinship coefficients of 0.062 5 and 0.125 0, respectively, crossing with the cluster diagram is divided into a family圖7 42頭麥洼公牦牛分析結(jié)果Fig.7 Results of analysis of 42 Maiwa male yaks

公牦牛聚類如圖7B所示,當(dāng)親緣系數(shù)為0.062 5時(shí),可將42頭麥洼公牦牛劃分成3個(gè)血統(tǒng),其中QH118與QH119各成一種血統(tǒng)。當(dāng)親緣關(guān)系設(shè)為0.125 0時(shí),可將42頭麥洼公牦牛劃分成12個(gè)血統(tǒng)。從該結(jié)果中可知,FL群的公牦牛有2種血統(tǒng),FZ群的公牦牛有3種血統(tǒng),而QH群的公牦牛有7種血統(tǒng)。在排除個(gè)體數(shù)量較少的血統(tǒng)后,發(fā)現(xiàn)QH群的血統(tǒng)組成最完善,可分為6種血統(tǒng),且個(gè)體數(shù)量較多。

2.8 家系驗(yàn)證分析

由表3可知,保種群平均FIS為0.021 3,G5、G6、G8、G11家系FIS均高于保種群平均FIS,表明這些家系近交程度較高,其中G8家系的FIS最大,為0.060 7;G10家系的FIS最小,為0.011 1。保種群12個(gè)家系的Ho=0.288 9～0.305 5,He=0.307 4～0.307 6,12個(gè)家系的Ho均低于He。

表3 12個(gè)家系的多樣性分析Table 3 Diversity analysis of 12 families

家系間遺傳分化(FST)和遺傳距離(DR)見表4,可知保種群的FST在0.007～0.092,G5與G8家系的遺傳分化程度最小(FST=0.007),G4與G12家系的遺傳分化程度最大(FST=0.092)。G5家系的平均FST最小(FST=0.027),與G4成中等遺傳分化程度;G4家系的平均FST最大(FST=0.065),與G2、G3家系遺傳分化程度較小,與其他各家系均是中等遺傳分化程度。

表4 遺傳分化系數(shù)(FST)(對(duì)角線下)和遺傳距離(DR)(對(duì)角線上)Table 4 F-statistic (below diagonal) and genetic distance (above diagonal)

3 討 論

研究表明,SNP位點(diǎn)數(shù)是親緣關(guān)系估計(jì)準(zhǔn)確性的主要限制因素[31],而GBS技術(shù)可以短時(shí)間內(nèi)獲得大量SNPs位點(diǎn)。本研究經(jīng)GBS測(cè)序并嚴(yán)格質(zhì)控后檢測(cè)出126 122個(gè)SNPs,麥洼牦牛系譜SNP芯片的制備可以此為基礎(chǔ)。PCA圖中個(gè)體空間直線距離與個(gè)體遺傳關(guān)系成正比[32]。PCA分析中FZ和QH群分布不均勻,有分化趨勢(shì),這與鐘光輝等[33]關(guān)于血液蛋白質(zhì)多態(tài)性研究結(jié)果不符。其原因可能是龍日種畜場(chǎng)在育種過(guò)程中引入優(yōu)良個(gè)體,以緩解麥洼牦牛在封閉選育中出現(xiàn)的近交系數(shù)上升。群體系統(tǒng)進(jìn)化樹分析中,大部分QH群個(gè)體聚類在一起,FL群小部分個(gè)體聚類緊密,表明QH和FL群的保種效果較好。其中FL群與另外兩群的部分個(gè)體親緣關(guān)系較近,形成較混亂的分支,這可能是由于龍日種畜場(chǎng)會(huì)從后備群挑選優(yōu)秀種公牛補(bǔ)充進(jìn)核心選育群,出現(xiàn)部分血緣交叉和個(gè)體離群現(xiàn)象。該結(jié)果與紀(jì)會(huì)等[34]的研究結(jié)果類似,表明GBS測(cè)序方法同樣適用于麥洼牦牛遺傳關(guān)系分析,同時(shí)表明當(dāng)前麥洼牦牛不同保種群之間出現(xiàn)了明顯的分離,還存在一定的基因交流。

本研究基于獲得的SNPs用GCTA軟件計(jì)算所有個(gè)體的近交系數(shù)和親緣系數(shù)并構(gòu)建G矩陣,獲得了所有個(gè)體的親屬關(guān)系。根據(jù)近交系數(shù)發(fā)現(xiàn),保種群有近1/4個(gè)體的近交系數(shù)較高,這些個(gè)體會(huì)嚴(yán)重干擾親緣關(guān)系分析及判定,同時(shí)也不利于未來(lái)保種選育工作。通過(guò)對(duì)親緣關(guān)系矩陣的分析,QH群和FL群都存在一個(gè)親緣關(guān)系較近的群體,這與群體進(jìn)化樹分析結(jié)果一致。張金鑫等[35]和Islam等[36]也構(gòu)建了G矩陣,說(shuō)明利用親緣關(guān)系對(duì)基因組選擇分子育種工作有顯著效果。根據(jù)獲取的164 836個(gè)親緣系數(shù)對(duì),運(yùn)用宏代碼依據(jù)親緣系數(shù)的大小進(jìn)行親屬關(guān)系的判定,迅速獲得了全同胞與半同胞關(guān)系和二代及三代內(nèi)的親屬關(guān)系,但年齡段大于3歲以上的親屬關(guān)系判定準(zhǔn)確率不高,該方法與趙書民等[37]在鑒定人類親屬關(guān)系時(shí)所使用的方法相似。為提高生產(chǎn)效益,成年牛會(huì)與不同異性個(gè)體交配形成多個(gè)半同胞個(gè)體,當(dāng)半同胞個(gè)體數(shù)量大于等于4時(shí),同胞關(guān)系數(shù)量會(huì)大于同胞個(gè)體數(shù),因此本研究中鑒定出的912個(gè)半同胞關(guān)系和520個(gè)疑似半同胞關(guān)系或叔侄關(guān)系數(shù)量大于保種群數(shù)量406。本研究根據(jù)親緣系數(shù)和年齡已經(jīng)能夠進(jìn)行家系分群,并初步判定出群體中的疑似親子關(guān)系或全同胞關(guān)系。在后續(xù)系譜構(gòu)建過(guò)程中,只需對(duì)這些個(gè)體進(jìn)行親子鑒定即可構(gòu)建準(zhǔn)確的系譜。

本研究根據(jù)《畜禽遺傳資源保種場(chǎng)保護(hù)區(qū)和基因庫(kù)管理辦法》的規(guī)定將麥洼牦牛劃分為12個(gè)家系,與郝鑫宇等[38]研究結(jié)果相似,表明利用親緣系數(shù)可以劃分出不同的家系。進(jìn)一步解析公牦牛血統(tǒng)分布,當(dāng)親緣系數(shù)劃分為0.062 5時(shí),可劃分為3個(gè)血統(tǒng),其中兩個(gè)血統(tǒng)僅有1頭牦牛,這2頭牦牛可能是來(lái)自其他地區(qū)的優(yōu)良個(gè)體。經(jīng)詢問(wèn)證實(shí)龍日種畜場(chǎng)于2018年從群外引進(jìn)3頭優(yōu)秀牦牛個(gè)體,這2頭公牦?？赡軄?lái)自這3頭公牛。當(dāng)親緣系數(shù)劃分為0.125 0時(shí),可劃分為12個(gè)血統(tǒng),其中QH群可分為7個(gè)家系。當(dāng)親緣系數(shù)增加時(shí)血統(tǒng)數(shù)量也隨之增加,這與王起山等[39]的研究結(jié)果相似,表明可根據(jù)遺傳育種工作的實(shí)際需要來(lái)劃分公牦牛血統(tǒng)。

為驗(yàn)證12個(gè)家系的構(gòu)建效果,本研究對(duì)12個(gè)家系進(jìn)行遺傳多樣性分析。當(dāng)Ho低于He,則群體存在近交;當(dāng)Ho高于He,則群體可能曾經(jīng)導(dǎo)入外血[40]。本研究中12個(gè)家系的Ho均比He低,表明12個(gè)家系內(nèi)均存在一定的近交,其中G5、G6、G8的Ho較小,表明近交程度較高。G11家系僅由2頭1歲的QH群牦牛組成,G5、G6、G8家系中混雜著不同的表型,家系內(nèi)存在一定的近交和基因交流,與劉彬等[12]的研究結(jié)果相似,表明近交和基因交流是采用群體繼代選育法的必然結(jié)果。G1和G4家系個(gè)體均來(lái)自QH群,遺傳分化程度較高,可作為QH群保種工作中的重點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng),這與馬麗娜和馬青[41]、趙志達(dá)等[42]和王繼英等[43]的研究結(jié)果類似。

本項(xiàng)目探究了龍日種畜場(chǎng)麥洼牦牛的親屬關(guān)系,從基因組層面初步判定了同代、二代和三代的親屬關(guān)系,完善了麥洼牦牛系譜。但部分個(gè)體間的確切關(guān)系未知,本課題組將進(jìn)一步開發(fā)更為簡(jiǎn)潔的系譜重建方法對(duì)牦牛系譜進(jìn)行重建,以幫助目前開展的牦牛育種工作。

4 結(jié) 論

為厘清龍日種畜場(chǎng)選育群的系譜,本研究利用GBS技術(shù)獲得的SNPs構(gòu)建了親緣關(guān)系G矩陣,通過(guò)Excel軟件自動(dòng)判定了保種群的親屬關(guān)系,并劃分了12個(gè)家系,為后續(xù)系譜重建奠定了基礎(chǔ)。為準(zhǔn)確判定復(fù)雜的二代及三代親屬關(guān)系,應(yīng)分析多態(tài)信息含量(PIC)、非父排除率(CEP)等數(shù)據(jù),進(jìn)行親子鑒定,逐步完善個(gè)體系譜資料,為遺傳資源的開發(fā)利用和新品種(品系)的人工選育提供理論基礎(chǔ)。