成 昭,徐 玥,梁 飛,鄭 蕾,何 昊,李 根

(1.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,陜西 西安 710021;2.西安萊伯瑞生物工程有限公司,陜西 西安 710116)

機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性自由基,廣泛參與生命體內(nèi)的各種氧化-還原反應(yīng)[1-2]。自由基氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)認(rèn)為,氧化-還原路徑中的自由基處于動(dòng)態(tài)平衡,自由基過(guò)量時(shí),可能引發(fā)氧化-還原反應(yīng)失衡[3-5],從而導(dǎo)致自由基在機(jī)體內(nèi)過(guò)量積累,進(jìn)而攻擊細(xì)胞與結(jié)締組織,造成細(xì)胞損傷[6-7],引發(fā)組織與器官功能紊亂,致使機(jī)體衰老。為了維持生命體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)代謝平衡,機(jī)體依賴于各種抗氧化劑完成自由基清除。其中,具有還原性的小分子氫能夠有效結(jié)合氧化路徑中相關(guān)自由基,如羥基自由基等;同時(shí),還原性氫具有快速透皮及快速轉(zhuǎn)運(yùn)特性,可加快機(jī)體代謝速度,達(dá)到抗氧化、抗衰老的功效[8-10]。天然來(lái)源的珊瑚鈣,能夠以其微孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行氫儲(chǔ)存[11-12]。儲(chǔ)氫珊瑚鈣作為一種微孔氫緩釋材料,能夠延長(zhǎng)還原性氫的使用間隔與有效適用時(shí)間,保證經(jīng)緩釋路徑給出的微量氫被充分利用,為研究人員開發(fā)微孔釋氫的抗氧化材料提供了新思路。

在此,作者通過(guò)對(duì)天然微孔材料珊瑚鈣進(jìn)行儲(chǔ)氫與活化,制備氫化珊瑚鈣,并分別與硼氫化鋰(LiBH4)、輔酶Q10(Q10)、抗壞血酸(VC)等抗氧化性組分進(jìn)行復(fù)配,制備復(fù)配氫化珊瑚鈣,對(duì)其釋氫、抗氧化增效及細(xì)胞毒性進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

碳酸鈣、氫化鈣、珊瑚鈣、鋅粒、硫酸(70%)、硼氫化鋰(LiBH4)、輔酶Q10(Q10)、抗壞血酸(VC)、DPPH試劑(2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(MTT),化學(xué)純;N,N-二甲基亞砜(DMSO),色譜純,上海阿拉丁生化科技公司。

UV-1700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津制作所;STA200型熱重法-差示掃描量熱法同步熱分析儀,日本日立制作所;U-LH 100 hG IX73型倒置熒光顯微鏡,日本奧林巴斯公司;1510 Mwltiskan Go型多功能酶聯(lián)檢測(cè)儀,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 氫化珊瑚鈣及復(fù)配氫化珊瑚鈣的制備

精密稱取0.005 0 g珊瑚鈣,通過(guò)足量鋅粒與稀硫酸的制氫反應(yīng),同步實(shí)現(xiàn)制氫與珊瑚鈣儲(chǔ)氫過(guò)程,充分反應(yīng)4 h,得到氫化珊瑚鈣。

分別稱取氫化珊瑚鈣及抗氧化性組分LiBH4、Q10、VC各0.005 0 g,進(jìn)行等質(zhì)量復(fù)配,30 ℃攪拌下充分反應(yīng)4 h,得到復(fù)配氫化珊瑚鈣,即氫化珊瑚鈣-LiBH4、氫化珊瑚鈣-Q10、氫化珊瑚鈣-VC。

1.3 熱重分析

稱取氫化珊瑚鈣5 mg,在氮?dú)夥諊?以20 ℃·min-1的速率進(jìn)行升溫,在30～795 ℃范圍內(nèi)測(cè)定氫化珊瑚鈣的熱重曲線,分析其儲(chǔ)氫含量與氫緩釋性能[13-15]。

1.4 紫外可見(jiàn)吸收光譜分析

出射狹縫與入射狹縫寬度均為1 nm,掃描波段為350～600 nm,測(cè)定珊瑚鈣、釋氫活性物質(zhì)氫化鈣[8]、氫化珊瑚鈣及其復(fù)配物的紫外可見(jiàn)吸收光譜,分析復(fù)配氫化珊瑚鈣的特征光譜吸收,進(jìn)一步通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)研究復(fù)配物的抗氧化增效作用。

1.5 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法測(cè)定氫化珊瑚鈣及復(fù)配氫化珊瑚鈣的體外細(xì)胞毒性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞株HepG2,配制密度為5×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液,加入到96孔板中,使每孔細(xì)胞數(shù)約8 000～10 000個(gè),將梯度濃度(1 000、500、250、125、62.5、31.25,μg·mL-1)的氫化珊瑚鈣及復(fù)配氫化珊瑚鈣溶液依次加入到96孔板中,溶劑對(duì)照為0.1%DMSO,每組設(shè)置2個(gè)平行孔;將孔板置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)終止前,每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1),培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液;然后每孔加入150 μL DMSO,測(cè)定490 nm處吸光度(OD),按下式計(jì)算HepG2細(xì)胞增殖抑制率(%):

2 結(jié)果與討論

2.1 氫化珊瑚鈣的儲(chǔ)氫含量

測(cè)定30～795 ℃范圍內(nèi)氫化珊瑚鈣的熱重曲線,并對(duì)失重率進(jìn)行進(jìn)一步分析,得到釋氫失重曲線,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 氫化珊瑚鈣在30～795 ℃(a)、33.75～52 ℃(b)范圍內(nèi)的熱重曲線Fig.1 Thermogravimetric curves of coral calcium hydride in range of 30-795 ℃(a) and 33.75-52 ℃(b)

由圖1可知,氫化珊瑚鈣在52～563 ℃范圍內(nèi)無(wú)其它失重;563 ℃后,珊瑚鈣骨架逐漸坍塌(圖1a)。氫化珊瑚鈣的釋氫失重段處于33.75～52 ℃范圍內(nèi)(圖1b),其儲(chǔ)氫含量約為0.02%。

2.2 復(fù)配氫化珊瑚鈣的紫外可見(jiàn)吸收光譜(圖2)

圖2 單組分(a)、復(fù)配珊瑚鈣(b)、復(fù)配氫化鈣(c)及復(fù)配氫化珊瑚鈣(d)的紫外可見(jiàn)吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of single components(a),complexed coral calcium(b),complexed calcium hydride(c),and complexed coral calcium hydride(d)

由圖2可知,珊瑚鈣、氫化鈣、氫化珊瑚鈣及其復(fù)配物均保持基本一致的紫外可見(jiàn)吸收,珊瑚鈣及其復(fù)配物的吸收峰集中于519 nm(圖2b),而具有釋氫活性的氫化鈣及其復(fù)配物、氫化珊瑚鈣及其復(fù)配物的吸收峰集中于427～429 nm(圖2c、d);經(jīng)過(guò)儲(chǔ)氫活化過(guò)程,氫化珊瑚鈣與珊瑚鈣的特征吸收峰分別位于427 nm、519 nm處,位置差異顯著;氫化珊瑚鈣的特征吸收峰與釋氫活性物質(zhì)氫化鈣(λmax=428 nm)具有一定的相似性;此外,復(fù)配氫化珊瑚鈣的吸收峰強(qiáng)度出現(xiàn)差異,主要是由于,氫化珊瑚鈣釋氫效應(yīng)對(duì)單組分LiBH4、Q10、VC的抗氧化增效作用不同。經(jīng)儲(chǔ)氫與活化,制備的氫化珊瑚鈣表現(xiàn)出與釋氫活性物質(zhì)氫化鈣相似的光學(xué)吸收,初步證明氫化珊瑚鈣具有一定的釋氫效果。

2.3 復(fù)配氫化珊瑚鈣對(duì)DPPH自由基的清除能力及抗氧化增效作用

基于復(fù)配氫化珊瑚鈣對(duì)516 nm處DPPH自由基特征吸收峰的抑制作用,評(píng)價(jià)復(fù)配氫化珊瑚鈣的氫緩釋、自由基清除與抗氧化性能[16-17]。通過(guò)紫外可見(jiàn)吸收光譜法分別測(cè)定復(fù)配珊瑚鈣、復(fù)配氫化鈣及復(fù)配氫化珊瑚鈣對(duì)DPPH自由基的清除能力,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 復(fù)配珊瑚鈣(a)、復(fù)配氫化鈣(b)及復(fù)配氫化珊瑚鈣(c)的抗氧化性能Fig.3 Antioxidation performance of complexed coral calcium(a),complexed calcium hydride(b),and complexed coral calcium hydride(c)

由圖3可知,復(fù)配珊瑚鈣的紫外可見(jiàn)吸收光譜的吸收峰位置、峰形均與對(duì)照組DPPH自由基無(wú)明顯差異,僅吸收峰強(qiáng)度略有降低(圖3a),說(shuō)明復(fù)配珊瑚鈣與抗氧化性組分的抗氧化性能并無(wú)明顯差異[18-19],抗氧化性組分LiBH4、Q10、VC具有一定的DPPH自由基清除能力,但珊瑚鈣并未對(duì)上述組分產(chǎn)生抗氧化增效作用。而復(fù)配氫化鈣、復(fù)配氫化珊瑚鈣的紫外可見(jiàn)光譜的吸收峰位置、峰形、峰強(qiáng)度均與對(duì)照組DPPH自由基具有顯著差異(圖3b、c),氫化鈣及氫化珊瑚鈣的釋氫效果有效提高了LiBH4、Q10、VC的抗氧化性,表現(xiàn)為復(fù)配氫化鈣及復(fù)配氫化珊瑚鈣對(duì)DPPH自由基的顯著清除能力及抗氧化增效作用,且復(fù)配氫化珊瑚鈣的抗氧化增效作用更優(yōu)。具有釋氫功效的復(fù)配氫化珊瑚鈣與抗氧化性組分的抗氧化性有顯著差異,進(jìn)一步證明了氫化珊瑚鈣的活性氫緩釋作用能夠?qū)崿F(xiàn)快速轉(zhuǎn)運(yùn)、有效清除DPPH自由基,實(shí)現(xiàn)LiBH4、Q10、VC的抗氧化增效。

2.4 復(fù)配氫化珊瑚鈣的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

測(cè)定氫化珊瑚鈣及復(fù)配氫化珊瑚鈣在不同濃度下對(duì)體外HepG2細(xì)胞的24 h細(xì)胞毒性,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 氫化珊瑚鈣及復(fù)配氫化珊瑚鈣對(duì)HepG2細(xì)胞的24 h細(xì)胞毒性Fig.4 Cytotoxicity of coral calcium hydride and complexed coral calcium hydride on HepG2 cells at 24 h

由圖4可知,在梯度濃度(1 000、500、250、125、62.5、31.25,μg·mL-1)下,氫化珊瑚鈣及復(fù)配氫化珊瑚鈣對(duì)體外HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用均不顯著,最大作用濃度1 000 μg·mL-1下,細(xì)胞增殖抑制率低于10%,說(shuō)明經(jīng)天然來(lái)源物質(zhì)修飾得到的氫化珊瑚鈣具有低毒性,對(duì)體外HepG2細(xì)胞毒性較低。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)天然微孔材料珊瑚鈣進(jìn)行儲(chǔ)氫與活化,得到氫化珊瑚鈣,并分別與LiBH4、輔酶Q10、抗壞血酸等抗氧化性組分進(jìn)行復(fù)配,得到復(fù)配氫化珊瑚鈣。熱重分析結(jié)果表明,氫化珊瑚鈣具有一定釋氫效果,其釋氫失重段處于33.75～52 ℃,儲(chǔ)氫含量約為0.02%。紫外可見(jiàn)吸收光譜分析結(jié)果表明,一方面,氫化珊瑚鈣表現(xiàn)出與釋氫活性物質(zhì)氫化鈣相似的紫外可見(jiàn)吸收;另一方面,復(fù)配氫化珊瑚鈣因活性氫緩釋與DPPH自由基清除性能的協(xié)同效應(yīng),實(shí)現(xiàn)了對(duì)硼氫化鋰、輔酶Q10、抗壞血酸的抗氧化增效作用,證明了復(fù)配氫化珊瑚鈣的活性氫緩釋性能與抗氧化性能。此外,復(fù)配氫化珊瑚鈣對(duì)體外HepG2細(xì)胞呈低毒性,是一種生物友好的微孔釋氫與抗氧化材料,對(duì)于活性氫的抗氧化功效與機(jī)制分析、機(jī)體抗衰老等相關(guān)研究具有重要意義。