陳田恬, 黃顯博, 閔瑾雯, 張溢峻, 趙艷, 張慧云, 何韶衡, 孫健△

1錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科, 3變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心(遼寧錦州 121001); 2錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院(遼寧錦州 121001)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種慢性、反復(fù)發(fā)作的炎癥性皮膚病,表現(xiàn)為濕疹性皮損和皮膚瘙癢,多數(shù)伴有血漿中IgE和嗜酸性粒細(xì)胞水平升高。全世界有15%～30%的兒童和2%～10%的成人受到AD的影響[1]。盡管有大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究,但AD的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的最新假設(shè)涉及眾多因素,包括遺傳易感性、環(huán)境因素、免疫功能改變和皮膚屏障功能障礙等[2-3]。先天和適應(yīng)性免疫在AD的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)加重中起了決定性作用。除了經(jīng)典的Th1/Th2失衡引起細(xì)胞因子的分泌異常[4],近年發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)在AD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,AD是效應(yīng)T細(xì)胞(effector T cells,Teffs)和Treg穩(wěn)態(tài)被破壞的結(jié)果[5]。以Foxp3表達(dá)為特征的Treg是有效的T細(xì)胞激活免疫調(diào)節(jié)劑,以產(chǎn)生白細(xì)胞介素-10(IL-10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等抗炎癥因子為特征,通過(guò)直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA-4)以及分泌TGF-β和IL-10來(lái)抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌,從而增強(qiáng)免疫耐受,維持免疫穩(wěn)態(tài)。有研究表明Treg細(xì)胞在控制皮膚損傷引起的炎癥和過(guò)敏原特異性免疫反應(yīng)方面至關(guān)重要,是AD樣皮膚炎癥的重要抑制因子[6]。Treg細(xì)胞最具特征的亞群是胸腺來(lái)源Treg細(xì)胞(tTreg細(xì)胞)和外周Treg細(xì)胞(pTreg細(xì)胞)或誘導(dǎo)Treg細(xì)胞(iTreg細(xì)胞)[7],雖然這兩個(gè)Treg亞群來(lái)源不同,但它們具有相同的細(xì)胞標(biāo)記CD4+CD25+Foxp3+,并且都具有抑制活性[8-9]。此外,在Treg家族中還存在 CD8+Treg細(xì)胞和IL-17+Treg細(xì)胞[10-11]。近年來(lái),許多研究探討了AD和Treg細(xì)胞亞群的關(guān)系,但是出現(xiàn)了相互矛盾的結(jié)果[12-13]。目前根據(jù)AD患者是否有IgE的升高和是否患有其他特應(yīng)性疾病將AD分為內(nèi)源性AD和外源性AD[14]。外源性AD是發(fā)病率高的典型類型,以高水平的血清總IgE為特征,伴有個(gè)人或家族性的特應(yīng)性疾病史(如過(guò)敏性鼻炎、哮喘、過(guò)敏性結(jié)膜炎)以及食物和吸入性過(guò)敏原特異性sIgE。內(nèi)源性AD與外源性AD具有類似的臨床表型,但血清IgE水平正常,無(wú)特應(yīng)性病史,且缺乏過(guò)敏原特異性sIgE[15]。本研究分別采集內(nèi)源性和外源性AD患者的外周血標(biāo)本,探討Treg細(xì)胞亞群在內(nèi)源性AD和外源性AD患者的表達(dá)特征,為探索AD的發(fā)病機(jī)制和新的治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022年6—12月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的 AD 患者36例(表1),其中內(nèi)源性AD患者18例,外源性AD患者18例。男6例,女30例,平均年齡(37.44±14.70)歲。

表1 各組臨床資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合特應(yīng)性皮炎Williams診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)無(wú)其他系統(tǒng)性疾病;(3)近2周內(nèi)未用過(guò)系統(tǒng)性糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和抗組胺藥。

AD分型標(biāo)準(zhǔn):(1)內(nèi)源性AD(iAD):血清總IgE<150 kU/L(散射比濁法)、體外特異性IgE陰性、過(guò)敏原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陰性且不合并其他特應(yīng)性疾病(如變應(yīng)性鼻炎、過(guò)敏性哮喘和食物過(guò)敏等)的AD為iAD。(2)外源性AD(eAD):血清總IgE>150 kU/L(散射比濁法)、體外特異性IgE陽(yáng)性、過(guò)敏原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽(yáng)性及合并其他特應(yīng)性疾病的AD為eAD[16]。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床資料不全者;(2)免疫功能異常者。

選取同期在本院體檢的健康者15例為對(duì)照組,無(wú)過(guò)敏性疾病史,男4例,女11例,平均年齡(23.43±4.23)歲。各組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(202316)。

1.2 主要儀器與試劑 FACS Verse流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;FITC偶聯(lián)抗人CD8抗體、PE偶聯(lián)抗人CCR6抗體、Alexa647偶聯(lián)抗人Foxp3抗體、PE/Cy7偶聯(lián)抗人IL-10抗體、PerCP/Cy5.5偶聯(lián)抗人IL-17抗體和Cytofix /Cytoperm破膜/固定試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司;PHA、離子霉素、高爾基體阻斷劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;PBS購(gòu)自中國(guó)SolARbio公司;淋巴細(xì)胞分離液Lymphoprep購(gòu)自挪威AXIS-SHIELD公司。

1.3 方法

1.3.1 提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC) 分別取各組研究對(duì)象外周血2 mL于含EDTA抗凝劑的采血管中,在10 mL離心管中將外周血和生理鹽水1∶1混勻,將淋巴細(xì)胞分離液加入10 mL帶蓋離心管中,再在其上緩慢疊加混勻的2倍體積的稀釋血液,室溫800g離心25 min后,吸出置于1～3層之間的灰白色云霧層液體,即為PBMC,置于新的離心管中,用生理鹽水洗滌細(xì)胞,250 g離心10 min,獲得細(xì)胞沉淀,重懸于1640培養(yǎng)液中,即得到PBMC懸液。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)分析 向提取好的外周血PBMC中加入淋巴細(xì)胞激活劑(PHA,離子霉素,高爾基體阻斷劑),37℃孵育 4 h 后加入FcR阻斷劑,室溫避光孵育15 min;A組實(shí)驗(yàn)加入PerCP偶聯(lián)抗人CD4抗體、FITC偶聯(lián)抗人CD25抗體進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物染色。然后對(duì)細(xì)胞固定、破膜,加入Alexa647偶聯(lián)抗人FoxP3抗體和PE-Cy7偶聯(lián)抗人IL-10抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物染色。B組實(shí)驗(yàn)加入FITC偶聯(lián)抗人CD8抗體、PE偶聯(lián)抗人CCR6抗體進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物染色。然后對(duì)細(xì)胞固定、破膜,加入Alexa647偶聯(lián)抗人FoxP3抗體、PE-Cy7偶聯(lián)抗人IL-10抗體和PerCP-Cy5.5偶聯(lián)抗人IL-17抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物染色。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物的表達(dá),Diva軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。Treg細(xì)胞首先被定義為淋巴細(xì)胞門(mén)內(nèi)的單細(xì)胞。A組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比及其表達(dá)IL-10的百分比;B組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD8+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞百分比及其表達(dá)IL-10的百分比。

2 結(jié)果

2.1 AD患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例降低 與對(duì)照組相比較,內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1、2。并且內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者外周血IL-10+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3、4。內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者幾組數(shù)據(jù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注:HC: 對(duì)照組; eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組

注:HC: 對(duì)照組; eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組;*與對(duì)照組比較P<0.01

注:HC: 對(duì)照組; eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組

注:HC: 對(duì)照組; eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組;*與對(duì)照組比較P<0.01

2.2 AD患者外周血CD8+Foxp3+Treg細(xì)胞比例降低 與對(duì)照組相比較,內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者外周血CD8+Foxp3+Treg占CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖5、6。并且內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者外周血IL-10+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD8+T淋巴比例明顯低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖7、8。內(nèi)源性AD組和外源性AD組患者幾組數(shù)據(jù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注:HC: 對(duì)照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組

注:HC: 對(duì)照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組;*與對(duì)照組比較P<0.01

注:HC: 對(duì)照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組

注:HC: 對(duì)照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組;*與對(duì)照組比較P<0.01

2.3 內(nèi)源性AD患者外周血IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞比例增高 內(nèi)源性AD組外周血IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比比對(duì)照組、外源性AD組明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);外源性AD組外周血IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖9、10。

注: HC: 對(duì)照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組

注: HC: 對(duì)照組;eAD:外源性AD組;iAD:內(nèi)源性AD組;*與對(duì)照組比較P<0.05;△與外源性AD組比較P<0.05

3 討論

AD是一種基于多種臨床表現(xiàn)的慢性瘙癢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病。近年來(lái),在AD的發(fā)病機(jī)制的各種假說(shuō)中,免疫功能的改變占據(jù)了重要地位。

Treg細(xì)胞功能缺失或受到抑制而導(dǎo)致機(jī)體對(duì)過(guò)敏原的免疫耐受力降低可能是AD發(fā)病的重要機(jī)制[4]。AD根據(jù)免疫機(jī)制被分為內(nèi)源性AD和外源性AD兩種類型[14]。外源性AD表現(xiàn)為T(mén)h2的免疫反應(yīng),內(nèi)源性AD患者中Th17活化程度要高于外源性AD患者[15]。

Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng),在許多自身免疫、過(guò)敏和炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[17]。Treg細(xì)胞可通過(guò)抑制Teffs的活性和增殖來(lái)防止過(guò)度的免疫反應(yīng),從而增強(qiáng)免疫耐受,維持免疫穩(wěn)態(tài)。因此,Treg細(xì)胞對(duì)于維持外周耐受性、預(yù)防自身免疫性疾病和限制炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。Treg細(xì)胞在AD發(fā)生、發(fā)展中的作用越來(lái)越引起人們的關(guān)注,但對(duì)于AD患者中Treg細(xì)胞的具體類型、數(shù)量及確切功能尚不清楚,既往對(duì)AD患者Treg細(xì)胞的研究[12-13]結(jié)果也存在爭(zhēng)議。

CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞是最具特征的Treg細(xì)胞,在人類中,CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞占外周血CD4+細(xì)胞總數(shù)的5%～15%[18]。CD4+CD25+Foxp3+Tregs參與調(diào)節(jié)過(guò)敏原特異性免疫反應(yīng),以及抑制抗原提呈細(xì)胞(APC)、效應(yīng)T細(xì)胞和肥大細(xì)胞功能[19]。IL-10是一種主要由Treg細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎和免疫抑制細(xì)胞因子,它可以抑制Th1、Th2及Th17細(xì)胞,抑制炎癥反應(yīng),減少炎癥期間的組織損傷[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn),AD患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比及IL-10+Foxp3+Treg細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組,而內(nèi)源性AD和外源性AD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明CD4+CD25+Foxp3+Treg及IL-10+Foxp3+Treg細(xì)胞比例降低,引起免疫抑制能力減弱,導(dǎo)致了AD疾病的發(fā)生、發(fā)展,并且在內(nèi)源性AD和外源性AD中都有參與,對(duì)于Th2、Th17引起的免疫反應(yīng)均有抑制功能。

CD8+Treg細(xì)胞作為一種新的Treg亞型,同樣高水平表達(dá)常見(jiàn)的Treg關(guān)鍵標(biāo)記Foxp3,并在維持自身耐受中發(fā)揮重要作用,獨(dú)立于CD4+T細(xì)胞,誘導(dǎo)CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞向Th17轉(zhuǎn)化[22]。本研究發(fā)現(xiàn)CD8+Foxp3+Treg及IL-10+Foxp3+Treg細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組,而內(nèi)源性AD和外源性AD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明CD8+Foxp3+Treg細(xì)胞在AD的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要的作用,并且在內(nèi)源性AD和外源性AD中都有參與。

IL-17是Th17標(biāo)志性的促炎性細(xì)胞因子,主要表現(xiàn)為強(qiáng)大的募集和激活中性粒細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)炎癥。在炎癥條件下,具有抑制功能的Treg細(xì)胞保留了分泌IL-17的可塑性,并失去了抑制功能[23]。也有研究表明IL-17+Foxp3+細(xì)胞優(yōu)先由記憶CCR6+T細(xì)胞產(chǎn)生,包括Treg和傳統(tǒng)T細(xì)胞。IL-17+Foxp3+T細(xì)胞是功能性Treg細(xì)胞群[24]。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性AD患者外周血IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照組和外源性AD組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明IL-17+Foxp3+細(xì)胞在內(nèi)源性AD的發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)主導(dǎo)地位,與Klonowska等[25]報(bào)道相一致,并有可能是IL-17細(xì)胞因子通過(guò)負(fù)性調(diào)控TSLP免疫通路阻斷Th2細(xì)胞因子作用,最終抑制內(nèi)源性AD中IgE的產(chǎn)生。內(nèi)源性AD以低水平IgE和Th17激活為特征[26]。

本研究證實(shí)了外周血中Treg細(xì)胞亞群及相應(yīng)細(xì)胞因子分別在內(nèi)源性AD和外源性AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。明確AD亞型的發(fā)病機(jī)制,有益于基于靶向的免疫治療和研發(fā)新的治療靶點(diǎn)。但Tregs如何調(diào)控效應(yīng)細(xì)胞及其靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)還有待于進(jìn)一步研究。

利益相關(guān)聲明:所有作者聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明:陳田恬負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)、論文撰寫(xiě);黃顯博、閔瑾雯、張溢峻負(fù)責(zé)臨床資料收集、數(shù)據(jù)整理;趙艷負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析;張慧云、何韶衡負(fù)責(zé)獲取研究經(jīng)費(fèi)、技術(shù)或材料支持和指導(dǎo)性支持;孫健負(fù)責(zé)論文設(shè)計(jì)、論文審核校對(duì)。全體作者都閱讀并同意最終的文本。