林 洋,秦淑杰,崔亞微,,朱海明,顧 湘,王效禹,劉 艷,趙 斌,劉明春,韓業(yè)東,曹艷子*

(1.大連三儀動(dòng)物藥品有限公司,遼寧大連 116036;2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),遼寧沈陽 110061;3.大連市農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法大隊(duì),遼寧大連 116001;4.義縣種畜禽監(jiān)督管理站,遼寧義縣 121000;5.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,遼寧沈陽 110033)

近年來,隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展,人畜爭(zhēng)糧、飼料轉(zhuǎn)化率低、環(huán)境污染等問題已成為影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的瓶頸問題,尋找新的抗生素替代品成為亟待解決的問題。據(jù)報(bào)道貝萊斯芽孢桿菌可以改善動(dòng)物機(jī)體腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)[1]。Feedap等[2]報(bào)道貝萊斯芽孢桿菌可用作飼料添加劑,其發(fā)酵產(chǎn)生的胞外抗菌物質(zhì)可以抑制大腸桿菌、沙門氏桿菌和痢疾桿菌等致腹瀉病原菌的生長(zhǎng),且抗逆性好;貝萊斯芽孢桿菌能抑制黃曲霉孢子生長(zhǎng)、禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)[3-4];貝萊斯芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門菌有拮抗效果[5];貝萊斯芽孢桿菌能提高豬的平均日增重,降低發(fā)病率,促進(jìn)生長(zhǎng)性能的提高[6];貝萊斯芽孢桿菌胞外產(chǎn)物能抑制大腸埃希菌的活性。葉淼[7]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌可以提高蛋雞的產(chǎn)蛋率、平均日采食量、蛋殼強(qiáng)度,增加蛋黃重量,降低血清中的促胰液素和膽囊收縮素含量。王在貴等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌制劑可以提高鵝、雛雞的免疫器官指數(shù),提高免疫效果,大幅度提升家禽的生長(zhǎng)性能。這暗示該菌對(duì)于預(yù)防雞的食源性病原菌具有較好的應(yīng)用潛力。由于該菌可產(chǎn)生不同酶類,因此在抑菌、提高家禽生產(chǎn)性能以及作為抗生素替代物方面具有很大的潛能。筆者將對(duì)分離的貝萊斯芽孢桿菌作為飼料添加劑,研究其對(duì)肉雞生產(chǎn)性能和體內(nèi)霉菌毒素代謝的影響,旨在為該菌在畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物。白羽肉雞(45 000羽,健康雛雞),購自山東某規(guī)?；怆u養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2菌株與試材。貝萊斯芽孢桿菌BLS-1,由大連三儀生物工程研究所保藏。可溶性淀粉購自濰坊盛泰藥業(yè)有限公司;玉米赤霉烯酮(ZEN)、嘔吐毒素(DON)、黃曲霉毒素(AFB1)和伏馬毒素(FB)ELISA檢測(cè)試劑盒均購自北京億森寶生物科技有限公司。

1.1.3主要設(shè)備。便攜式pH計(jì)(型號(hào)為Seven2Go),梅特勒托利多科技(中國(guó))有限公司;離心機(jī)(型號(hào)為TGL16B型),上海安亭科學(xué)儀器廠;電子天平(型號(hào)為BS210S),北京泰克儀器有限公司;超純水機(jī)(型號(hào)為UP900),韓國(guó)Human公司;管式離心機(jī)(型號(hào)為GQ75-J),遼陽中聯(lián)制藥機(jī)械有限公司;酶標(biāo)儀(型號(hào)為FC),賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法。整個(gè)飼養(yǎng)期均飼喂常規(guī)飼料。對(duì)照組正常飼喂,每日飲水中添加可溶性淀粉200 g,試驗(yàn) Ⅰ 組1 t飲用水含BLS-1菌200×1010CFU,試驗(yàn)Ⅱ組1 t飲用水含BLS-1菌100×1010CFU,每日添加飲用水中飼喂,常規(guī)免疫。

1.2.2日糧組成。雛雞(1～21日齡)、中雞(22-35日齡)、大雞(36-42日齡)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1～2。

表1 不同日齡肉雞的日糧組成

表2 不同日齡肉雞的營(yíng)養(yǎng)水平

1.2.3試驗(yàn)動(dòng)物及其分組。試驗(yàn)在山東某規(guī)模化肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行,試驗(yàn)期42 d,隨機(jī)分為對(duì)照組、試驗(yàn) Ⅰ 組、試驗(yàn) Ⅱ 組,每組15 000 羽,共3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)5 000 只雞。

1.2.4檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.4.1生長(zhǎng)性能的測(cè)定。在試驗(yàn)初分點(diǎn)取樣測(cè)定整群初重(圖1),共取2次,每點(diǎn)選取20只雞,統(tǒng)計(jì)整群重量;試驗(yàn)?zāi)w重按最終整群出欄重量記錄。試驗(yàn)期間,認(rèn)真記錄各組雞只死淘情況及飼料投放情況(記錄投放飼料重量及下次投放前剩余飼料重量),試驗(yàn)雞禁食12 h后測(cè)定并記錄空腹初體重;以組別為單位,記錄耗料量;每周試驗(yàn)結(jié)束后回收全部剩余飼料并記錄回收料重;統(tǒng)計(jì)整個(gè)試驗(yàn)期試驗(yàn)雞耗料量,即每只雞每天消耗飼料的平均重量;在整個(gè)試驗(yàn)期間注意觀察各組雞的體況,詳細(xì)記錄死亡情況,包括死亡日期、死亡只數(shù)和組別等;試驗(yàn)結(jié)束后,計(jì)算各組消耗飼料平均重量、試驗(yàn)?zāi)┢骄w重、死淘率、料肉比及平均日增重。

圖1 四點(diǎn)取樣法示意Fig.1 Four-point sampling method

計(jì)算公式如下:消耗飼料平均重量(kg/只)=(投料重-回收料重)/只數(shù)×飼養(yǎng)天數(shù);試驗(yàn)?zāi)┢骄w重(kg/只)=試驗(yàn)?zāi)┱后w重/試驗(yàn)?zāi)┐婊铍u數(shù);死淘率(%)=(試驗(yàn)初存活雞只數(shù)-試驗(yàn)?zāi)╇u只數(shù))÷試驗(yàn)?zāi)╇u只數(shù)×100%;料肉比=消耗飼料均重/增重均重;平均日增重(kg)= (試驗(yàn)?zāi)w重-試驗(yàn)初體重)/測(cè)定天數(shù)。

1.2.4.2糞便中霉菌毒素含量的測(cè)定。整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi),各組分別于1、7、14、21、28、35和42日齡雞舍內(nèi)不同位點(diǎn)取試驗(yàn)動(dòng)物排泄新鮮糞便約500 g,樣品取出后冷凍保存,分批次對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行40～50 ℃烘干,用粉碎機(jī)破碎后置于密封袋待測(cè)。利用ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)糞便樣品中黃曲霉毒素(AFB1)、伏馬毒素(FB)、嘔吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量進(jìn)行檢測(cè),確定不同時(shí)間段霉菌毒素代謝后排出情況。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。采用Microsoft Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同水平貝萊斯芽孢桿菌制劑對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理方式開展試驗(yàn),添加不同水平貝萊斯芽孢桿菌制劑對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響見表3。

表3 不同水平貝萊斯芽孢桿菌制劑對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知,試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組的試驗(yàn)?zāi)┢骄w重顯著高于對(duì)照組(P<0.05),死淘率和料肉比顯著低于對(duì)照組(P<0.05);試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組平均日增重顯著高于對(duì)照組(P<0.05);3組間消耗飼料平均重量差異不顯著(P>0.05)。

2.2 添加不同水平貝萊斯芽孢桿菌制劑對(duì)肉雞糞便中霉菌毒素含量的影響取樣后的糞便經(jīng)過干燥、粉碎后測(cè)定其霉菌毒素含量,添加不同水平貝萊斯芽孢桿菌制劑對(duì)肉雞糞便中霉菌毒素含量的影響見表4。

表4 不同水平貝萊斯芽孢桿菌制劑對(duì)肉雞糞便中霉菌毒素含量的影響

如表4所示:7～42日齡,試驗(yàn)Ⅰ組肉雞糞便樣品中黃曲霉毒素(AFB1)的含量低于對(duì)照組;7～21日齡,試驗(yàn)Ⅰ組肉雞糞便中嘔吐毒素(DON)含量低于對(duì)照組;14～42日齡試驗(yàn)Ⅰ組肉雞糞便中玉米赤霉烯酮(ZEN)含量低于對(duì)照組。

3 討論

3.1 貝萊斯芽孢桿菌制劑對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響在畜禽養(yǎng)殖中降低生產(chǎn)成本非常重要,而提高生長(zhǎng)性能和飼料消化率能有效降低生產(chǎn)成本。芽孢桿菌在腸道中定殖后能分泌各種消化酶,產(chǎn)生各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)小腸蠕動(dòng),改善腸道功能[8-9]。陳龍等[10]開發(fā)一種貝萊斯芽孢桿菌157,通過工藝優(yōu)化后產(chǎn)出的內(nèi)切纖維素酶(CMcase)產(chǎn)量高且對(duì)pH具有良好的穩(wěn)定性,可作為飼料添加劑用于畜禽養(yǎng)殖。鐘麗娟等[11]研究發(fā)現(xiàn)飼用貝萊斯芽孢桿菌可產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶等多種酶,具有良好的生物安全性,在生物飼料領(lǐng)域具有較大的開發(fā)潛力。結(jié)合已有文獻(xiàn)對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的產(chǎn)酶情況進(jìn)行研究,初步證實(shí)此菌在提高飼料消化率及生產(chǎn)性能、降低料肉比方面具有較大的潛力。該研究結(jié)果表明試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組每只肉雞整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)消耗飼料平均重量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05);試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組試驗(yàn)?zāi)┢骄w重約2.5 kg,與對(duì)照組差異顯著(P<0.05);試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組肉雞死淘率與對(duì)照組差異顯著(P<0.05),死淘率比對(duì)照組分別降低3.00和1.30百分點(diǎn);試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組料肉比分別為1.77和1.80,比對(duì)照組分別降低0.08和0.05;試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組平均日增重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

該研究結(jié)果表明飼料中添加貝萊斯芽孢桿菌能夠提高肉雞生長(zhǎng)性能,降低料肉比。張靜博等[12]研究發(fā)現(xiàn)在肉雞飼料中添加枯草芽孢桿菌可以降低平均日采食量,提高肉雞的生產(chǎn)性能。葉淼[7]研究發(fā)現(xiàn)添加貝萊斯芽孢桿菌在蛋雞飼料中能夠在一定程度上替代飼用抗生素使用。以上研究結(jié)果均表明芽孢桿菌在家禽養(yǎng)殖中具有提高生產(chǎn)性能的作用以及替代抗生素使用的潛力。貝萊斯芽孢桿菌作為一株新開發(fā)應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖的菌株,具有強(qiáng)耐受性。

關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌對(duì)肉雞養(yǎng)殖的影響研究報(bào)道較少,此菌可產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物(如酶、抗菌物質(zhì)、植物激素等)[7]。貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的酶類可作為外源酶,協(xié)助內(nèi)源酶對(duì)飼料的消化吸收,同時(shí)可產(chǎn)生抑菌作用。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物可以改善畜禽腸道環(huán)境、提高有益菌的相對(duì)豐度及調(diào)整菌群結(jié)構(gòu),進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的免疫系統(tǒng)[8-9],降低疾病發(fā)生率,由此可見該菌在提高畜禽生產(chǎn)性能、降低疾病感染方面具有一定的研究和應(yīng)用潛力。

3.2 貝萊斯芽孢桿菌制劑對(duì)肉雞糞便中霉菌毒素含量的影響霉菌毒素嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物的健康,大多數(shù)霉菌隨著畜禽的采食而進(jìn)入體內(nèi),其產(chǎn)生的霉菌毒素30 min內(nèi)就會(huì)釋放到消化道中。小腸是營(yíng)養(yǎng)成分的主要吸收地點(diǎn)。霉菌毒素會(huì)破壞消化道完整的屏障結(jié)構(gòu),損傷消化道黏膜,嚴(yán)重影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在腸道內(nèi)的吸收,并為病原微生物入侵機(jī)體打開大門,進(jìn)而影響機(jī)體健康。霉菌毒素對(duì)谷物和飼料的污染以及對(duì)膳食暴露的風(fēng)險(xiǎn)和毒素限量標(biāo)準(zhǔn)等,也受到世界有關(guān)部門和科研機(jī)構(gòu)的高度重視,研究人員對(duì)霉菌及其毒素給動(dòng)物生產(chǎn)和人類健康帶來的不良影響做了大量研究。霉菌毒素對(duì)肉雞養(yǎng)殖的影響包括生長(zhǎng)遲緩、對(duì)免疫系統(tǒng)及機(jī)體各系統(tǒng)的損傷嚴(yán)重等[12-14]。目前貝萊斯芽孢桿菌的分離及其對(duì)霉菌毒素降解的研究尚處于初級(jí)階段,尋找一種高效、安全、環(huán)保的霉菌毒素生物降解方法成為研究熱點(diǎn)[11,15]。

利用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒每周檢測(cè)糞便樣本中4種毒素的含量,發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)Ⅰ組14～21日齡雞糞便樣品黃曲霉毒素(AFB1)、嘔吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量比對(duì)照組低,表明飼喂添加該菌劑能夠降低霉菌毒素對(duì)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)代謝的影響。這與王曉敏等[16]的研究結(jié)果相一致。王明清等[17]分離篩選出一株貝萊斯芽孢桿菌,其胞外上清液、菌懸液和胞內(nèi)液分別能降解90.6%、19.6%和12.8%的AFB1,而筆者通過體外臨床試驗(yàn)證實(shí)了貝萊斯芽孢桿菌菌劑對(duì)AFB1的降解能力。賴根生等[18]研究發(fā)現(xiàn)可降解DON的貝萊斯芽孢桿菌在1 μg/mL的DON下?lián)u瓶發(fā)酵16 h對(duì)DON的降解率達(dá)82.63%,可與乳酸菌協(xié)同去除飼料中的嘔吐毒素。曹榮耀等[4]從豬腸道中分離出一株貝萊斯芽孢桿菌,其發(fā)酵上清液在72 h內(nèi)能降解76.7%的DON。筆者通過添加貝萊斯芽孢桿菌制劑的肉雞體外臨床試驗(yàn),從實(shí)際臨床角度證實(shí)了貝萊斯芽孢桿菌制劑對(duì)霉菌毒素的降解能力。7～42日齡,試驗(yàn)Ⅰ組肉雞糞便樣品中黃曲霉毒素(AFB1)的含量低于對(duì)照組,可見飼喂該菌劑能減少黃曲霉毒素在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的代謝排出量,原因可能是該菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)黃曲霉毒素發(fā)揮了降解作用。1、7、21、28、42日齡試驗(yàn)Ⅱ組肉雞糞便中的伏馬毒素(FB)含量低于對(duì)照組,飼喂該菌劑對(duì)肉雞糞便中伏馬毒素(FB)的作用效果需要進(jìn)一步驗(yàn)證。7～21日齡,試驗(yàn)Ⅰ組肉雞糞便中嘔吐毒素(DON)含量低于對(duì)照組,說明該菌劑可能具有降低嘔吐毒素代謝量的作用。14～42日齡試驗(yàn)Ⅰ組肉雞糞便中玉米赤霉烯酮(ZEN)含量低于對(duì)照組。

該試驗(yàn)中測(cè)定了飼料中4種霉菌毒素的含量,但是試驗(yàn)前后的檢測(cè)值基本一致,故不做考察。對(duì)于該試驗(yàn)中可能存在霉菌毒素殘留于機(jī)體肌肉、臟器及腸道中的問題,該試驗(yàn)所有組別養(yǎng)殖及飼養(yǎng)條件均一致,因此排除了其他因素對(duì)霉菌毒素代謝含量的影響。該研究中飼喂貝萊斯芽孢桿菌可以促進(jìn)肉雞生長(zhǎng),降低死淘率以及對(duì)霉菌毒素代謝的影響,可能是由于微生物發(fā)酵過程中可產(chǎn)生多種酶類,這些酶類可以促進(jìn)生長(zhǎng)、提升免疫力,進(jìn)而促進(jìn)消化吸收,減少動(dòng)物毒素的攝入,進(jìn)而降低通過食物鏈對(duì)人體的損傷和毒性。其降解機(jī)制還需要深入探討,未來通過基因工程及分子生物學(xué)方法構(gòu)建和改造菌株,篩選或克隆出表達(dá)高產(chǎn)降解酶的菌株,以實(shí)現(xiàn)其在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)條件下飼喂貝萊斯芽孢桿菌制劑能夠顯著提高試驗(yàn)肉雞的試驗(yàn)?zāi)┢骄w重,降低肉雞死淘率及料肉比,降低飼養(yǎng)成本,減少黃曲霉毒素(AFB1)、伏馬毒素(FB)、嘔吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)在糞便中的代謝排出量。綜合考慮指標(biāo)效果,推薦試驗(yàn) Ⅰ 組添加BLS-1菌200×1010CFU/t作為最佳用量。