陳繼榮 王佳 顳紓

(湖北醫(yī)藥學院附屬隨州醫(yī)院肝膽胰外科,湖北 隨州 441300)

胰腺癌是一種高致命性的惡性腫瘤,雖然接受過包括手術切除在內的多模式治療的患者的5年生存率超過了20%,但患者的整體生存率仍然較低〔1〕。在胰腺癌治療過程中,化學療法和放射療法的治療效果較差,因此,迫切需要新的治療策略來提高患者的生存率和預后。大量研究發(fā)現天然草藥具有抗腫瘤作用。金絲桃苷具有許多生物學作用,包括心肌保護、抗氧化、抗高血糖、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌等作用〔2～4〕。然而,尚不清楚金絲桃苷在治療胰腺癌中的作用及可能的分子機制。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路是惡性腫瘤轉移中最重要的途徑之一〔5〕。核因子(NF)-κB是一種在調節(jié)腫瘤細胞增殖、侵襲、凋亡和血管生成中起重要作用的核轉錄因子,在許多癌細胞中經常被激活〔6,7〕。此外,NF-κB的活性受到PI3K/Akt信號通路的調控〔5〕。許多實驗結果表明,NF-κB在胰腺癌細胞的生長和增殖中起關鍵作用。NF-κB可通過誘導生長基因的表達直接刺激細胞增殖,并且NF-κB能夠通過抗凋亡作用促進胰腺癌的生長〔8〕。本研究探討金絲桃苷在體內和體外對胰腺癌細胞生長和凋亡的影響,并考察金絲桃苷對PI3K/Akt/NF-κB信號通路的調控作用。

1 材料和方法

1.1細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞系PANC-1和人正常胰腺導管上皮細胞系HPDE6-C7購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心,將PANC-1細胞在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng),培養(yǎng)基中添加胎牛血清(10%)、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 mg/ml),培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.2細胞處理 將金絲桃苷(美國Sigma-Aldrich公司)以1 000 mmol/L的濃度溶于二甲基亞砜(DMSO,終濃度為0.1%,美國Sigma-Aldrich公司)中,并保存在4 ℃下。在完全細胞培養(yǎng)基中用不同濃度(0～500 μmol/L)的金絲桃苷處理60%～70%融合的細胞72 h。用0.1%DMSO處理的細胞作為對照。

1.3細胞計數試劑盒(CCK)-8測定 按照制造商的說明,通過CCK-8試劑盒(日本Dojindo Laboratories公司)測定細胞活力。將細胞以5×103細胞/孔的密度接種在96孔微量滴定板中,每孔含有200 ml培養(yǎng)基及不同濃度〔0(對照)、50、100、200、500 μmol/L〕的金絲桃苷。然后將CCK-8溶液(10 μl)加入每個孔中,并將96板孔在37 ℃下孵育4 h。然后用酶標儀測量不同培養(yǎng)時間段的450 nm波長下的吸光度(OD)。

1.4細胞凋亡測定 按照制造商的說明,使用膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)檢測試劑盒(北京寶賽生物技術有限公司)通過流式細胞術測定細胞凋亡。將細胞用不同濃度的金絲桃苷溶液〔0(對照)、50、100、200、500 μmol/L〕孵育72 h,然后用胰蛋白酶收獲細胞,在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌并計數。計數后,將細胞以1×106個/ml的濃度重懸于結合緩沖液中,然后添加10 μl的Annexin V和5 μl的PI,并且將細胞在室溫下黑暗中孵育15 min。孵育后,通過貝克曼流式細胞儀Epics Altra分析凋亡細胞的百分比。

1.5Western印跡分析 將0 μmol/L和200 μmol/L金絲桃苷溶液處理的細胞在冰冷的PBS中洗滌兩次,在放射免疫沉淀(RIPA)緩沖液(碧云天生物技術研究所)中裂解并勻漿,然后在4 ℃下9 500 r/min離心10 min去除碎片,并根據制造商的說明使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定法確定蛋白濃度。通過在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量蛋白質(50 mg),并電轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉2 h后,與以下一抗在4 ℃下過夜孵育:裂解的胱天蛋白酶(cleaved-caspase)3(1∶500稀釋)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2(1∶1 000稀釋)、Bcl-2相關X蛋白(Bax,1∶500稀釋)、p-Akt(1∶500稀釋,美國Santa Cruz Biotechnology公司)、PI3K(1∶1 000稀釋)、Akt(1∶500稀釋,美國Cell Signaling Technology公司)、NF-κB p65(1∶2 000稀釋,美國Abcam公司)和GAPDH(1∶1 000稀釋,美國Abcam公司)。并與相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶500稀釋,美國Santa Cruz Biotechnology公司)在室溫下孵育1 h。使用增強的化學發(fā)光(ECL)試劑盒進行顯影,GAPDH作為內部對照。

1.6細胞遷移和侵襲測定 通過孔徑為8 μm的24孔Transwell(美國Minipore公司)進行細胞遷移測定。分別將2×105個0 μmol/L 和200 μmol/L金絲桃苷溶液處理的PANC-1細胞加入200 μl DMEM中〔含有1%胎牛血清(FBS)〕,然后添加到上室中,下室加入600 μl DMEM(含有10%FBS)。孵育24 h后,用棉簽除去上室中的未遷移的細胞,并用4%多聚甲醛固定、結晶紫染色,在200倍放大倍數下計數遷移細胞。將上室預先用基質膠(美國BD Biosciences公司)包被,用于測定細胞PANC-1的侵襲能力,其他步驟與遷移實驗相同。

1.7裸鼠腫瘤異種移植模型和治療 雄性BALB/c nu/nu裸鼠(5～7周齡)購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心,體質量20～25 g。將5×106個PANC-1細胞皮下注射到裸鼠的背部建立腫瘤異種移植模型。然后,將裸鼠隨機分為對照組和金絲桃苷組(每組6只),對照組裸鼠腹腔注射200 μl 0.1%DMSO溶劑,金絲桃苷組按照30 mg/kg 的劑量注射200 μl金絲桃苷溶液,持續(xù)注射28 d。每周監(jiān)測1次腫瘤生長,持續(xù)4 w,用游標卡尺測量腫瘤的短徑和長徑,腫瘤體積=0.5×短徑2×長徑。

1.8統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、LSD事后檢驗及t檢驗。

2 結 果

2.1金絲桃苷對胰腺癌細胞活力的影響 與對照組相比,隨著金絲桃苷濃度的升高,PANC-1細胞活力顯著降低,表現為濃度依賴性(P<0.05)。此外,當金絲桃苷濃度為500 μmol/L時,HPDE6-C7細胞活力顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2金絲桃苷對胰腺癌細胞凋亡的影響 與對照組〔(1.23±0.07)%〕相比,不同濃度(50、100、200、500 μmol/L)的金絲桃苷處理PANC-1細胞的細胞凋亡率均顯著升高〔(7.64±0.40)%、(13.26±0.70)%、(16.12±0.85)%、(21.34±1.13)%〕,并且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1。Western印跡分析顯示(圖2),與對照組(1.00±0.05、1.00±0.05、1.00±0.05)相比,200 μmol/L金絲桃苷處理PANC-1細胞中cleaved-caspase 3和Bax蛋白表達顯著升高(3.45±0.15、2.53±0.11,P<0.05),Bcl-2蛋白表達顯著降低(0.44±0.03,P<0.05)。

圖1 流式細胞術測定不同濃度的金絲桃苷對PANC-1細胞凋亡的影響

圖2 Western印跡分析金絲桃苷對PANC-1細胞中cleaved-caspase 3、Bax和Bcl-2表達的影響

2.3金絲桃苷對胰腺癌細胞遷移和侵襲的影響 與對照組〔(100.00±5.30)%〕相比,200 μmol/L金絲桃苷處理PANC-1細胞的細胞遷移率顯著降低〔(23.42±1.24)%,P<0.05〕。與對照組〔(100.00±5.30)%〕相比,200 μmol/L金絲桃苷處理PANC-1細胞的細胞侵襲率顯著降低〔(17.85±0.95)%,P<0.05〕。見圖3。

圖3 Transwells法測定金絲桃苷對PANC-1細胞遷移、侵襲的影響(結晶紫染色,×200)

2.4金絲桃苷對PI3K/Akt/NF-κB信號通路的影響 與對照組(1.00±0.04、1.00±0.05、1.00±0.060、1.00±0.05)相比,200 μmol/L金絲桃苷處理PANC-1細胞中PI3K和NF-κB p65蛋白表達顯著降低(0.24±0.01、0.17±0.01;P<0.05),Akt的磷酸化水平顯著降低(0.21±0.01;P<0.05),Akt蛋白相對表達無明顯變化(0.94±0.04;P>0.05),見圖4。

圖4 Western印跡分析金絲桃苷對PANC-1細胞中PI3K、Akt、p-Akt和NF-κB p65表達的影響

2.5金絲桃苷對體內腫瘤生長的影響 給藥前,對照組體質量為(23.14±1.23)g,金絲桃苷組體質量為(23.09±1.17)g,兩組體質量無顯著差異(P<0.05)。在給藥28 d時,對照組和金絲桃苷組體質量無顯著差異〔(21.73±1.09) vs (21.54±1.20)g,P<0.05〕。在接種PANC-1細胞14 d后,與對照組相比,金絲桃苷組腫瘤體積顯著降低(P<0.001)。見表2。

表2 對照組和金絲桃苷組的腫瘤體積比較

3 討 論

胰腺是具有內分泌和外分泌功能的重要器官。外分泌功能涉及消化酶向小腸的分泌,而內分泌功能涉及激素(包括胰島素、胰高血糖素和生長抑素)的分泌〔9〕。約95%的胰腺癌靶向外分泌功能,而5%靶向內分泌功能。前者是惡性且生長迅速,而后者是良性且生長緩慢。胰腺癌由于具有進展迅速、早期癥狀少、診斷時大多處于晚期、對化學療法的反應差等特征,導致患者的預后非常不理想〔10〕。

越來越多的研究表明,許多中藥可用于誘導細胞凋亡和抑制炎癥反應〔11〕。黃酮類化合物存在于多種水果、植物來源的飲料和蔬菜中,并因其抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用而廣為人知。金絲桃苷屬于一種黃酮類化合物,具有多種生物活性,包括抗炎活性、心肌保護和抗氧化作用〔12〕。本研究結果也證實,金絲桃苷可在體內明顯抑制胰腺癌腫瘤生長。提示金絲桃苷可能對胰腺癌細胞具有抑制作用。

Bcl-2家族的蛋白質在控制細胞凋亡途徑中起著至關重要的作用,其中Bcl-2可減少細胞凋亡,相反,Bax則誘導凋亡〔13〕。此外,caspase-3是細胞凋亡過程中的終末剪切酶,也是一種促凋亡信號分子,cleaved-caspase 3是caspase-3的活化形式。另外,caspase-3的促凋亡作用可被Bcl-2阻斷〔14～16〕。本研究結果說明,金絲桃苷可能通過調控caspase 3、Bax和Bcl-2來發(fā)揮抗凋亡作用。

胰腺癌的高致死率和高轉移性與胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力直接相關。本研究發(fā)現,金絲桃苷處理降低了PANC-1細胞的遷移和侵襲能力。眾所周知,PI3K/Akt信號通路是惡性腫瘤轉移中最重要的傳導途徑之一〔17〕。PI3K/Akt通路在調節(jié)惡性腫瘤的生長和轉移的重要作用已得到充分證明。AKT是P13K的下游靶標,也是一種原癌基因,活化的PI3K可激活蛋白激酶AKT并導致細胞進入分裂周期并開始增殖。本研究結果說明金絲桃苷可能通過抑制PI3K/Akt信號通路來降低胰腺癌細胞的增殖和轉移能力。

此外,PI3K/Akt信號通路的激活可以進一步活化NF-κB〔18〕。NF-κB參與胰腺癌致癌過程的不同階段,并且在許多惡性腫瘤中均有報道〔19〕。 NF-κB誘導基因參與抗凋亡、侵襲、血管生成、轉移和增殖,并且在胰腺癌中起重要的調節(jié)作用〔17〕。大量天然化學活性化合物,例如紫草素、七葉皂苷、雙氫青蒿素、姜黃素、厚樸酚等都可通過調控NF-κB抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡。在細胞質中活化的NF-κB可以轉運到細胞核中并與DNA序列中的特定反應元件結合,并控制與凋亡有關的基因表達〔20〕。本研究結果說明,金絲桃苷可能通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路來發(fā)揮抗腫瘤作用。