杜建航，鮑小剛，許國華，李得見*

（1.復旦大學附屬浦東醫(yī)院骨科，上海 200120；2.海軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院骨科，上海 200003）

骨肉瘤是起源于骨骼的最常見的惡性腫瘤，通常影響青少年和年輕人［1］。盡管原發(fā)性腫瘤可以通過手術切除，但如果不進行輔助化療，最終仍有很高的風險發(fā)生肺轉移［2］。即使手術后進行輔助化療，預計只有2/3 的局部骨肉瘤患者可以治愈，而轉移性或復發(fā)性骨肉瘤患者的長期生存率低于30%［3］。由于無法有效優(yōu)化現(xiàn)有的治療方法以及確定新的活性藥物，使得在過去的30 多年中一直無法改善治療效果。考慮到這些限制，仍需要進一步探索新的治療方法。近年來，免疫療法在各種成人癌癥中顯示出較好的應用前景，包括非細胞疫苗、樹突狀細胞（dendritic cells,DC）疫苗、過繼細胞療法、免疫檢查點抑制劑和聯(lián)合療法等，但其在骨肉瘤中的應用尚未得到開發(fā)。

1 骨肉瘤免疫治療的發(fā)展

一些證據(jù)表明，骨肉瘤可能對基于免疫的治療方法敏感。骨肉瘤的CD8 陽性浸潤淋巴細胞百分比高于其他亞型的肉瘤［4］，并且浸潤程度與生存率呈正相關［5］。骨肉瘤基因組的不穩(wěn)定程度很高，一些腫瘤表達了程序性細胞死亡蛋白1 配體（programmed cell death protein-1 ligand,PD-L1）［6］，表明骨肉瘤對PD-1（programmed cell death protein-1）/ PD-L1 軸抑制劑的潛在敏感性［7，8］。此外，還有許多細胞表面蛋白可能與抗體靶向結合。最近關于米伐木肽的一些實驗結果引人注目。它是細菌細胞壁的類似物，可以觸發(fā)單核細胞和巨噬細胞的活化并改善腫瘤控制。目前米伐木肽已在歐洲獲準用于治療骨肉瘤，部分是基于一項III 期隨機研究顯示接受米伐木肽聯(lián)合常規(guī)化療的骨肉瘤患者的總生存期得到改善［9］。

2 非細胞疫苗

基于肽或病毒的疫苗可以在體內(nèi)將抗原直接呈遞至樹突狀細胞（dendritic cells,DC）。盡管對肽疫苗的評估受到限制，但是針對融合蛋白斷點區(qū)域的早期試驗表明，只有1/16 的患者具有免疫反應并且1 例患者出現(xiàn)了混合臨床反應［10］。病毒疫苗在早期試驗中顯示出了前景，其中1 例患者在應用DC 靶向的慢病毒LV305 治療后，轉移復發(fā)性滑膜肉瘤表現(xiàn)出明顯的消退［11］。該疫苗還正在與NY-ESO-1 和TLR-4（toll-like receptor Toll）激動劑進行聯(lián)合評估。其他HER2 靶向的疫苗策略已在臨床前模型中顯示出了優(yōu)勢，包括對骨肉瘤的犬科研究。與歷史對照組相比，靶向HER2 的利斯特氏菌可降低轉移風險并提高生存率［12］。

另一種非基于細胞的方法涉及直接在腫瘤內(nèi)注射減毒的溶瘤病毒，后者在缺乏固有免疫的腫瘤細胞中優(yōu)先擴增。一旦溶瘤病毒被注射到腫瘤細胞中，它就以與傳統(tǒng)疫苗類似的方式介導炎癥和繼發(fā)的免疫反應，這可能導致腫瘤溶解，并通過表位擴散擴大免疫反應。在最近完成的I 期臨床試驗中，溶瘤HSV1716被用于治療復發(fā)性肉瘤，這可能為新的溶瘤病毒設計和組合方法創(chuàng)造了條件。

3 DC 疫苗

近來已開發(fā)出各種用于晚期肉瘤的細胞免疫療法［13］。用腫瘤裂解物負載的DC 進行治療，顯著增加對細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes,CTL）活性的誘導，并提高了血清γ 干擾素（interferon-γ,IFN-γ）的水平。DC 被用于增強腫瘤特異性免疫反應，因為DC 是主要的抗原呈遞細胞，可在體內(nèi)引發(fā)細胞免疫反應［14］。腫瘤裂解物負載的DC 和冷凍治療的腫瘤再植入可引發(fā)血清IFN-γ 水平升高，肺轉移減少和CD8 陽性T 淋巴細胞數(shù)量增加［14］。Kawano［15］報道了在骨肉瘤小鼠模型中用腫瘤裂解物負載的DC 和抗細胞毒性T 淋巴細胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4）抗體聯(lián)合治療的效果。在這項研究中，用抗CTLA-4 抗體或經(jīng)腫瘤溶解物負載的DC 進行治療，可引起CD8 陽性T 淋巴細胞數(shù)量增加，抑制原發(fā)和轉移性病變的生長，延長生存期，減少調(diào)節(jié)性T 淋巴細胞的數(shù)量，并增加血清IFN-γ 的水平，這些治療方法的結合可增強全身免疫應答。此外，用腫瘤溶解物負載的DC 和抗糖皮質(zhì)激素誘導的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor,GITR）抗體聯(lián)合治療可增強全身免疫反應［16］。一項基于DC 免疫治療的1/2 期臨床試驗中納入了37 例骨和軟組織肉瘤患者［17］，使用腫瘤裂解物，TNF-α（tumor necrosis factor-α）和OK-432 刺激的DC 進行治療，引起IFN-γ 和IL-12 水平升高，而沒有嚴重毒性。在接受臨床反應評估的35 例患者中，有1 例（3%）表現(xiàn)出部分反應，6 例（17%）表現(xiàn)出疾病穩(wěn)定，28 例（80%）表現(xiàn)出疾病進展［17］。

另一方面，一項在13 例骨肉瘤復發(fā)患者中，使用腫瘤溶解物和匙孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）負載的自體DC 疫苗進行的I 期試驗，顯示沒有明顯的毒性，然而12 例患者中，只有2 例表現(xiàn)出對腫瘤的特異性T 細胞免疫反應的誘導。在一項使用腫瘤裂解物和KLH 進行免疫療法I 期研究中，盡管患者沒有臨床反應，但是12 例骨肉瘤復發(fā)患者中有2 例誘導出了針對腫瘤的特異性T 細胞免疫反應［18］。在使用腫瘤裂解物負載的DC 進行免疫治療的I 期研究中，每10 例患有實體瘤的小兒患者中，有5 例表現(xiàn)出疾病控制，而1 例表現(xiàn)出腫瘤消退［19］。Merchant 等［20］報道了62%的轉移性和/或復發(fā)性小兒肉瘤患者接受了自體淋巴細胞，腫瘤溶解產(chǎn)物/ KLH 負載的DC 疫苗或重組人IL7 免疫治療后，表現(xiàn)出T 細胞反應，反應者的生存期延長。在基于DC 免疫療法的臨床研究中，沒有嚴重不良反應的報道。這些研究表明，在復發(fā)性骨肉瘤中DC 疫苗策略是安全的，并且可以使患者產(chǎn)生免疫反應，然而僅在某些患者中可改善臨床療效。為了改善骨肉瘤的細胞免疫療法，需要進一步研究腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen,TAA）聯(lián)合療法和相關的適應證。

4 過繼細胞療法

癌癥疫苗試圖通過抗原呈遞和新T 細胞反應的引發(fā)/擴展來誘導腫瘤免疫反應。相比之下，過繼性細胞療法（adoptive cellular therapy,ACT）規(guī)避了免疫檢查點阻滯（immune checkpoint blockade,ICB）靶向的T 細胞活化步驟和疫苗方法。ACT 利用CD8 陽性CTL 直接給藥。由Steven Rosenberg 等在美國國家癌癥研究所率先采用的早期方法包括將自身腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte,TILs） 分離，離體擴增和向轉移性黑色素瘤患者中輸注。這項早期工作證明了針對腫瘤抗原離體制造的細胞療法具有顯著的臨床反應，并強調(diào)了預處理條件對增強移植細胞群植入和持久性的重要性［21］。

此后開發(fā)出了兩種類型ACT 作為TIL 療法的可行替代品：轉基因T 細胞受體（transgenic T-cell antigen receptor,tgTCR）和嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors,CAR）。兩種方法都利用工程改造的細胞表達具有已知腫瘤抗原識別能力的受體。在內(nèi)源性免疫應答過程中，自身抗原呈遞MHC-I，以誘導CD8 陽性CTL 應答，而MHC-II（major histocompatibility complex）類抗原呈遞則驅動CD4 陽性輔助T 細胞應答。內(nèi)源性抗原在MHC-I 上的呈遞，包括由細胞內(nèi)蛋白質(zhì)突變編碼的腫瘤特異性抗原，使得CTL能夠以MHC 限制性方式識別幾乎任何內(nèi)源性或外源性肽。相反，CAR 是使用來自抗體的細胞外結合域與T 細胞受體的細胞內(nèi)信號傳導域進行融合而工程改造的。由于在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中以CD19 為靶點的治療方法最好地印證了抗體的性質(zhì)，即不需要在MHC 上呈遞，因此能夠對表面抗原進行高親和力識別［22］?；贑AR 的方法已經(jīng)專門針對小兒肉瘤進行了試驗，包括HER2/ GD2 CAR-T 或NK（natural killer）細胞。

骨肉瘤低水平表達HER2，使其對基于抗體的治療方法具有抵抗力，但易于被HER2 CAR 殺傷，如先前在體外和患者來源的異種移植模型中所示［23］。2015 年一項I/II 期試驗以評估HER2 CAR 在19 例診斷為HER2 陽性肉瘤患者中的安全性和有效性：其中16 例骨肉瘤，1 例尤因肉瘤，1 個原始神經(jīng)外胚層腫瘤和1 個增生性小圓形細胞瘤［24］。研究中沒有發(fā)現(xiàn)劑量限制的毒性。盡管有報告稱轉移性結腸癌患者使用HER2-CAR 后會產(chǎn)生嚴重的不良反應［25］，但有學者提出使用較低的CAR 劑量，利用不同的抗原識別和信號傳導域，去除IL-2，及無預處理可改善耐受性［24］。值得注意的是，CAR 治療后3 例患者在1年后仍可緩解，其中1 例表現(xiàn)出明顯的腫瘤內(nèi)壞死，壞死率大于90%。有待確定HER2 CARs 體內(nèi)擴增的增強是否會導致反應的改善［24］。

據(jù)報道神經(jīng)節(jié)苷脂GD2 和GD3 在骨肉瘤細胞上高表達，包括復發(fā)時［26］，使其成為有吸引力的靶標。在其他類型的小兒肉瘤中，似乎GD3 的表達仍高于GD2。靶向GD2 的CARs 在H3-K27M+突變型神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)出顯著的臨床前活性，并且在用誘導型CAR 分子治療的尤因肉瘤模型中顯示出一些抗腫瘤活性［27］。其他臨床前數(shù)據(jù)表明，用GD2 特異性CAR 轉導活化的NK 細胞，可以增強NK 細胞體外裂解EWS 細胞的能力［28］。這些研究的大量數(shù)據(jù)證實了ACT 對小兒肉瘤患者的活性。更好地了解可能產(chǎn)生治療反應的人群有助于使ACT 反應最大化。

5 免疫檢查點抑制劑

如果沒有離體擴增，內(nèi)源性TILs 通常無法抑制腫瘤，因為惡性腫瘤細胞通過檢查點配體抑制免疫反應逃避了免疫監(jiān)視［29］。檢查點抑制劑通過MHC 重新激活T 細胞介導的針對腫瘤抗原的抗腫瘤反應，從而逆轉了這一過程［30］，其中MHC 對新抗原的反應最大，不同于宿主組織上的新抗原。尚未研究證明骨肉瘤中復雜的基因組和染色體不穩(wěn)定性會導致高突變負擔；然而高水平的遺傳不穩(wěn)定可能會產(chǎn)生新表位，這些新表位是免疫介導殺傷的底物，因此對腫瘤可以使用檢查點抑制劑，包括針對CTLA-4，PD-1 和PD-L1［31］。

CTLA-4 是在調(diào)節(jié)性T 細胞和記憶T 細胞上表達的跨膜糖蛋白受體，與DC 上的CD80/86 結合后會導致免疫功能抑制［32］。與健康受試者相比，骨肉瘤患者的CLTA-4 表達增加［33］。PD-1 是在T 細胞上表達的另一種跨膜免疫球蛋白家族成員，在慢性激活的T細胞中表達最高［34］。PD-1 通過抑制CTL 并激活調(diào)節(jié)性T-細胞充當了免疫系統(tǒng)的“制動器”，并且其配體PD-L1 在一部分的骨肉瘤細胞以及骨肉瘤樣本中的免疫細胞中表達［35］。檢查點抑制劑在幾種不同成年癌癥中取得的成功，引起了人們對于其在骨肉瘤治療中的潛在應用的極大興趣。

Merchant 等［36］報道了CTLA-4 抑制劑ipilimumab 在患有復發(fā)性實體瘤的兒童中進行的I 期研究，其中包括8 例患有骨肉瘤的兒童。他們顯示出與成人相似的毒性和藥代動力學，激活和循環(huán)中的CTL 數(shù)量增加，而調(diào)節(jié)性T-細胞數(shù)量沒有增加。然而，沒有觀察到客觀的抗腫瘤反應。肉瘤研究合作聯(lián)盟最近測試了pembrolizumab 用于治療肉瘤，并報告了22例復發(fā)性骨肉瘤患者中的一部分反應（4%）?，F(xiàn)在許多研究正在測試抑制CTLA-4，PD-1 和PD-L1 的各種組合。

6 聯(lián)合療法

可以通過利用免疫療法的特定機制來設計合理的聯(lián)合療法。例如，CTLA-4 和PD-1 影響免疫應答的不同成分。CTLA-4 在CD4 效應子區(qū)的激活中起主要作用，特別是誘導ICOS+Th1 樣CD4 效應子的擴增，而PD-1 主要調(diào)節(jié)CTL 的增殖［37］。PD-1 和CTLA-4 阻斷劑聯(lián)合用于轉移性黑色素瘤的研究已顯示出臨床獲益，其中30%的患者表現(xiàn)出＞80%的腫瘤縮小率，因此FDA（Food and Drug Administration）批準nivolumab 和ipilimumab 用于無BRAF 突變的轉移性黑色素瘤［38］。臨床前的小鼠骨肉瘤轉移模型已顯示，單獨用PD-1 阻斷治療可下調(diào)PD-L1 并上調(diào)CD80 和CD86［39］。在小鼠轉移性骨肉瘤模型中同時阻斷CTLA-4 和PD-L1，可實現(xiàn)對50%小鼠腫瘤擴散的完全控制，從而產(chǎn)生腫瘤免疫力［39］。目前兒童腫瘤小組正在對該疾病的復發(fā)或難治性實體瘤進行I/II 期研究。

鑒于TILs 與抗PD-L1 治療的有效性相關，檢查點抑制劑可能會增加TILs 的活性［40］。這對于骨肉瘤可能尤其有用，因為相比原發(fā)腫瘤，TIL 的密度和PD-L1 在轉移病灶中的表達較高?？紤]到肺轉移是導致骨肉瘤患者死亡的主要原因，TIL 和檢查點抑制劑的聯(lián)合治療是很有吸引力的［41，42］。檢查點抑制劑也可能增加CAR-T 細胞和BiTE 抗體的活性，這可能受到調(diào)節(jié)性T 細胞升高，免疫抑制性細胞因子，基因組不穩(wěn)定，靶抗原表達缺失，引起T 細胞衰竭的抗體形成以及PD-1 上調(diào)的限制［43］。最后基于令人鼓舞的臨床前數(shù)據(jù)，檢查點抑制劑在I 期試驗中也與基因修飾的T 細胞療法和癌癥疫苗相結合。

7 總結與展望

在過去的三十多年中，由于未能找到新的有效藥以及無法優(yōu)化現(xiàn)有藥物的使用方法，因此在改善骨肉瘤患者預后方面的進展受到了限制。骨肉瘤的一些生物學特征表明調(diào)節(jié)免疫應答可能會帶來益處，并且現(xiàn)在的各種治療方法使得免疫治療很受歡迎。然而，免疫系統(tǒng)的復雜性和腫瘤特異性微環(huán)境的細微差別凸顯了這項任務的艱巨性。如常規(guī)化療所見，腫瘤利用多種途徑抵抗免疫療法，這表明需要聯(lián)合治療來實現(xiàn)有意義且持久的反應。目前仍然需要大量的研究進一步闡明現(xiàn)有免疫療法的抗藥性機制，開發(fā)和檢測解決耐藥性的合理聯(lián)合療法，以及探索預測性生物標志物以指導這些療法的合理使用。希望免疫療法可以帶來突破，徹底改變骨肉瘤的治療方法。