任小冬 龔志海 饒偉強 雷勝橋 劉力軍 李秋明

（1.廣東粵北華南虎省級自然保護區(qū)管理處， 廣東 韶關(guān) 512023；2.杭州艾迪康醫(yī)學檢驗中心有限公司， 浙江 杭州 310030）

華南虎Panthera tigris amoyensis是中國特有的虎亞種，曾在中國中南部大部分地區(qū)都有分布，野外已近三十年未有其確切的蹤跡報道。全國現(xiàn)存圈養(yǎng)種群均為20 世紀五六十年代捕獲的6 頭（2 雄4 雌）華南虎的后代?；⒌钠鹪粗髁饔^點認為是200 萬年前起源于中國中南部，發(fā)現(xiàn)于中國河南澠池的古中華虎Panthera tigris palaeosinensis化石，最接近這一原始虎的亞種是華南虎，因為其前傾的眼窩及細小的頭顱等頭骨結(jié)構(gòu)與古中華虎極其相似[1]。因此，華南虎被多數(shù)學者認為是所有虎亞種祖先的直系后代，在虎的亞種分化和遺傳機制方面具有較高的學術(shù)價值。由于現(xiàn)存圈養(yǎng)華南虎種群是一個高度近親的種群，造成遺傳疾病多發(fā)，其種群生育率和幼崽成活率均較低，近期就有一例華南虎染色體變異的G 帶核型報道[2]。華南虎的染色體早在1991 年就有研究[3]，G 帶核型1993 年也曾有報道[4]，并對華南虎和東北虎Panthera tigris altaica的染色體核型進行了對比分析，認為兩個虎亞種G 帶帶型沒有差異。已有的研究表明貓科動物的核型大多數(shù)為2n=38，認為貓科動物G 帶帶型與家貓的完全一致或高度相似[5-6]，核型非常保守。多位國外學者先后繪制了家貓不同分辨率的G 帶模式圖及其染色體分帶命名[7]，雖然華南虎染色體G 顯帶也有研究和報道[2-4]，但華南虎G 帶模式圖未有人進行詳細研究。

染色體是生物細胞中的一個重要組成部分，它是遺傳信息（基因）的主要載體[8]。所謂顯帶染色體是指染色體標本經(jīng)過一定程序處理，并運用特定染料染色，使染色體沿其長軸顯現(xiàn)出明暗或深淺相間的橫行帶紋，稱之為染色體帶，這種染色體帶顯現(xiàn)的技術(shù)，稱為顯帶技術(shù)[9]。染色體顯帶反映了調(diào)節(jié)DNA 復制﹑修復﹑轉(zhuǎn)錄和遺傳重組的基因組功能結(jié)構(gòu)?；驒z測結(jié)果顯示華南虎和東北虎具有顯著的遺傳差異，也確定了與繁殖﹑疾病﹑捕食和代謝相關(guān)的功能基因和調(diào)節(jié)途徑，并表征了與野外生存相關(guān)的功能性基因[10]。華南虎的核型分帶研究對于構(gòu)建華南虎的高密度遺傳連鎖圖譜和QTL 圖譜具有重要作用。

本研究組近期報道了華南虎G 顯帶模式[11]，現(xiàn)結(jié)合R 顯帶技術(shù)對華南虎染色體進行詳細帶型對照，對比華南虎染色體顯帶模式與家貓的異同，能為華南虎的細胞遺傳學研究提供更為詳實的基礎(chǔ)資料，鑒于細胞遺傳學在醫(yī)學上以及在保護瀕危物種方面的重要性，能為未來的華南虎繁育研究和物種保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液 華南虎血液（采集自后肢或尾部靜脈）采自廣東某華南虎繁育研究基地。血樣采集使用肝素鈉抗凝真空采血管，采血后應輕輕顛倒混勻數(shù)次，使抗凝劑與血液充分接觸﹑溶解，防止凝固。血樣采集后在48 h 內(nèi)進行接種，靜脈血樣本在運輸過程中避免劇烈晃動，冷藏（2～8 ℃）或常溫（18～25 ℃）運輸均可，實驗室收到標本當日無法及時接種以及接種后不能馬上培養(yǎng)的標本需冷藏（2～8 ℃）保存。累計采集到8 頭華南虎的血樣，其中雄性6 頭，雌性2 頭。

1.1.2 主要儀器和試劑 OLYMPUS CX41 顯微鏡﹑以色列ASI 染色體核型分析系統(tǒng)﹑美國熱電HEPA CLASS 100 二氧化碳培養(yǎng)箱﹑廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥淋巴細胞培養(yǎng)液﹑舒泰﹑多咪靜﹑咹啶醒﹑肝素鈉抗凝真空采血管等。

1.2 培養(yǎng)方法

分別取0.4 mL 肝素鈉抗凝靜脈血接種于2 瓶淋巴細胞培養(yǎng)液中，混勻后置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)完成后加入40 ug/mL 的秋水仙素20 uL，作用80 min 后收獲淋巴細胞，收獲步驟為：培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管，離心去上清，加入0.075 mol/L KCL 低滲，37 ℃水浴，離心去上清，細胞預固定，細胞固定，再次細胞固定。吸取固定好的細胞懸液 5～6 滴均勻滴于冰玻片上，過火，80℃烤片1 h（R 顯帶時不用烤片），分別進行胰酶G 顯帶和R 顯帶處理，Giemsa 染色。在低倍鏡下尋找良好染色體分裂相，用高倍油鏡觀察選取染色體形態(tài)清晰﹑分散良好﹑背景干凈的中期分裂相，并進行顯微攝影。

1.3 帶型分析方法

G 顯帶和R 顯帶樣本各選取10 個分散良好﹑染色深淺適宜﹑顯帶清晰的中期分裂相進行計數(shù)和測量，分別計算相對長度﹑臂比值和著絲粒指數(shù)的均值及標準差。并用染色體核型分析系統(tǒng)進行拍片﹑存檔。根據(jù)以著絲粒位置進行分類的方法[12]確定染色體形態(tài)。主要根據(jù)相對長度﹑臂比值及著絲粒指數(shù)等進行染色體形態(tài)劃分，本文采用臂比值均值作為確定形態(tài)依據(jù)，臂比值大于1 而小于1.67 的為中部著絲粒染色體（m）﹑臂比值大于1.67 而小于3.0 的為亞中部著絲粒染色體（sm）﹑臂比值大于3.0 而小于7.0 的為亞端著絲粒染色體（st）﹑臂比值大于7.0 的為端著絲粒染色體（t），性染色體X 是中著絲粒染色體（m），性染色體Y 是亞中著絲粒染色體（sm）。依據(jù)《ISCN2013》[13]（人類細胞遺傳學國際命名體制）對華南虎的染色體帶型進行分組分類和分析對比，并按照分析結(jié)果繪出華南虎各條染色體帶型模式圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 華南虎染色體形態(tài)特征及帶數(shù)

依照染色體相對長度大小遞減排列，常染色體依次為1～18，性染色體分別為X 和Y（表1）。其中，常染色體中帶數(shù)最多的為24 條帶，帶數(shù)最少的為6 條帶；性染色體中X 染色體為12 條帶，Y染色體是相對長度最短也是帶數(shù)最少的染色體，僅3 條帶。所有染色體中7 號和8 號的長度和形態(tài)都極為近似，區(qū)別僅為7 號染色體比8 號染色體短臂靠近著絲粒位置多一條淺染帶。

表1 華南虎染色體核型形態(tài)特征及帶數(shù)Table 1 Karyotype morphological characteristics and banding number of South China tiger

從G 帶結(jié)果來看，華南虎各條染色體均具有獨特的帶型特征，華南虎雌性和雄型的常染色體帶型沒有區(qū)別，性染色體能明顯區(qū)分華南虎的性別（圖2～3）。

圖1 雄性華南虎染色體G 顯帶Fig.1 Chromosome G banding of male South China tiger

圖2 雌性華南虎染色體G 顯帶Fig.2 Chromosome G banding of female South China tiger

2.2 華南虎G 帶模式、G 帶和R 帶比較

經(jīng)對華南虎的G 帶[11]和R 帶進行帶型研究初步形成了華南虎的G 帶核型，19 對染色體都能顯示出較為細致的帶紋。從帶型上來看，同源染色體帶紋基本一致，帶紋在每一對染色體上的數(shù)目和分布具有明顯的特征。不同長度的染色體具有不同的帶紋，一般染色體長度越長帶紋越多。各條染色體分帶模式根據(jù)G 帶帶紋分布制作而成，R帶作為輔助手段校正著絲粒和帶紋的分布，將華南虎染色體G 帶模式﹑G 帶和R 帶分別進行對照（圖3）。

圖3 華南虎G 帶模式、G 帶和R 帶對照Fig.3 South China tiger G banding karyotype pattern、G banding and R banding contrast

2.3 華南虎G 帶命名方法

與華南虎相近的貓科動物中已有人對家貓的染色體帶型進行了命名[14]，其命名規(guī)則參考了人類細胞遺傳學國際命名體制中的染色體分帶的區(qū)﹑帶命名方法，將該方法應用于華南虎染色體帶型研究，方便進行染色體各條帶的定位和比較。人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN）匯聚了染色體專家的智慧，其中的慣例和方法值得借鑒和應用。華南虎1 號染色體帶型命名（圖4）按照ISCN 方法沿染色體的臂從著絲粒開始向遠端連續(xù)標記區(qū)和帶。p 和q 分別用于表示染色體的短臂和長臂，著絲粒區(qū)定義為10，向著短臂部分稱為p10，面向長臂的部分稱為q10。每條臂上與著絲粒相連的部分定義為1，稍遠的區(qū)定義為2，依次類推[13]。作為界標的帶一般認為屬于該界標遠端的區(qū)，并且該帶常被標定位該區(qū)的1 號帶。

圖4 華南虎1 號染色體的區(qū)、帶命名示例Fig.4 Example of nomenclature of chromosome 1 of region and band of South China tiger

在定義一個特定的帶時，需要下列4 個條件：（1）染色體號，（2）臂的符號，（3）區(qū)號，（4）該帶在所屬區(qū)的帶號。這些條件需要連續(xù)列出，中間不要有空格和間斷。例如1p12 表示1 號染色體短臂1 區(qū)2 帶（圖4）。

使用以上方法可以清晰地分辨染色體的每條帶紋的編號，如1q32 表示1 號染色體長臂上3 區(qū)第2 條帶（圖4），在應用中可方便定位染色體每一條帶的大致位置，從而判斷華南虎染色體帶紋是否存在異常，也可以利用該方法將華南虎與東北虎等其他虎亞種的染色體帶紋進行比較，看看兩者在染色體核型帶紋形態(tài)上是否具備顯著差異。對比前人的東北虎染色體G 帶研究[4,15]，顯示其核型與本文華南虎核型分組結(jié)果有個別差異，這種差異可能是測量誤差和計算差異造成。

3 結(jié)論與討論

3.1 華南虎是我國國家一級重點保護野生動物，也是我國特有虎亞種，其已被認為野外滅絕，瀕危程度遠超國寶大熊貓。因貓科動物的核型模式非常保守，家貓的染色體核型在國際上普遍被作為貓科動物的核型模式。家貓的G 帶模式和分帶編號已有報道[7]，將染色體分成6 組和性染色體組。其中A 型（大亞中著絲粒染色體）6 條﹑B 型（大亞端著絲粒染色體）8 條﹑C 型（大中著絲粒染色體）4 條﹑D 型(小亞中著絲粒染色體)8 條﹑E 型（小中著絲粒染色體）8 條﹑F 型（端著絲粒染色體）4 條和性染色體X﹑Y。為方便與家貓的帶型進行比較，圖3 按其順序進行了排列，經(jīng)比較，華南虎與家貓的染色體G 顯帶高度相似，但也存在少部分明顯區(qū)別。如華南虎D3 短臂上存在一條較粗的深染帶，而家貓D3 短臂上只有較淺的深染帶；華南虎F1 著絲粒遠端明顯為淺帶更寬，家貓F1 著絲粒遠端明顯為深帶更寬。

染色體標本片的制備受較多因素影響，實驗材料﹑秋水仙素濃度﹑處理時間﹑低滲溶液種類﹑滴片時溫差等均可對染色體的實際長度﹑相對長度及臂比值產(chǎn)生影響[13]。本文經(jīng)采集多頭華南虎血液培養(yǎng)進行G 顯帶和R 顯帶實驗，帶型經(jīng)多次比對具有一定的代表性，基本可以排除因?qū)嶒炘蛟斐膳c家貓帶型的差異。目前華南虎染色體帶型的研究還處于初級階段，希望能給以后高分辨的帶型研究提供參考，便于以后學者進行華南虎染色體研究時橫向比較某些或某條染色體易位和變異等情況。

3.2 華南虎的G 帶同家貓的分帶高度近似，表明貓科動物在遺傳上的同源性。顯帶方法的分子基礎(chǔ)涉及核苷酸堿基組成﹑相關(guān)蛋白和基因組功能結(jié)構(gòu)，染色體帶的分布決定著某些基因的位置，在染色體核型帶型識別時，這些連續(xù)的染色體帶分布特征具有重要意義。在本研究中，我們對華南虎的G 帶命名方法進行了示意（圖4），對比家貓而言，華南虎的分帶命名的精確性仍有待提高。同家貓染色體帶型[7]比較圖3 中B2﹑B3﹑B4 和E1 及Y 染色體的分類彼此不同，解決這些差異需要使用順序條帶技術(shù)對兩者R 帶和G 帶進行直接比較。本研究成功制備華南虎染色體G 帶和R 帶標本，初步形成華南虎染色體G 帶模式，希望為華南虎等瀕危物種的種群遺傳研究提供參考。