孫亞玲 劉辰 劉賢嫻 牛蘊華 何啟偉 霍雨猛 徐文玲

摘? ? 要：為了建立蘿卜組培過程中種子消毒及培養(yǎng)的簡單有效方法，以蘿卜種子為試材，采用L16（43）正交設(shè)計，開展了植物組培抗菌劑PPM浸泡濃度（1.0%、1.5%、2.0%和3.0%）、浸泡時間（0.0、0.5、2.0和4.0 h）及培養(yǎng)基中PPM濃度（0.0、0.1%、0.3%和0.6%）對蘿卜種子消毒效果及無菌苗生長的研究。結(jié)果表明，PPM浸泡濃度對污染率有顯著影響，對發(fā)芽率、根長、株高和下胚軸長的影響不顯著；PPM浸泡時間對發(fā)芽率、污染率、根長、株高和下胚軸長均有顯著影響；培養(yǎng)基中PPM濃度對污染率、根長、株高和下胚軸長具有顯著影響，對發(fā)芽率無顯著影響。主次效應(yīng)分析表明，培養(yǎng)基中PPM濃度是影響污染率、根長、株高和下胚軸長的最主要因素，PPM浸泡時間影響次之，PPM浸泡濃度影響最小，最優(yōu)組合A2B3C2可使發(fā)芽率達到96.67%，污染率為2.22%，根長為7.00 cm，株高為8.60 cm，下胚軸長為0.73 cm。探索開發(fā)了一套操作簡便、無需沖洗的蘿卜種子消毒方法以及高發(fā)芽率、低污染率的無菌苗培養(yǎng)方法。

關(guān)鍵詞：蘿卜；種子消毒；植物組培抗菌劑；無菌苗

中圖分類號：S631.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2023）09-116-07

Effects of plant preservative mixture （PPM） on seed disinfection and aseptic seedling growth of radish

SUN Yaling1， LIU Chen1， LIU Xianxian1， NIU Yunhua2， HE Qiwei1， HUO Yumeng1， XU Wenling1

（1. Shandong Key Laboratory of Greenhouse Vegetable Biology/Shandong Branch of National Vegetable Improvement Center/Vegetable Science Observation and Experimental Station in Huang-Huai District of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Vegetable Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， Shandong， China; 2. Laizhou Agricultural Comprehensive Development Service Center， Laizhou 261400， Shandong， China）

Abstract： In order to establish a simple and efficient method for seed disinfection and aseptic seedling culture in radish tissue culture， L16 （43） orthogonal design， which including soaking concentration（1.0%、1.5%、2.0% and 3.0%）， soaking time（0.0、0.5、2.0 and 4.0 h） and PPM （plant preservative mixture） concentration（0.0、0.1%、0.3% and 0.6%） in the culture medium， was used to study the disinfection effect of PPM on radish seeds and the growth of steriled seedlings. The results showed that the soaking concentration of PPM exhibited a significant effect on the contamination rate， but was not significant on the germination rate， root length， plant height and hypocotyl length; the soaking time of PPM had significant effect on germination rate， contamination rate， root length， plant height and hypocotyl length; the concentration of PPM added in the medium had a significant effect on the contamination rate， root length， plant height and hypocotyl length， but was not significant on the germination rate. The analysis of primary and secondary effects showed that the PPM concentration in culture medium was the most important factor affecting the contamination rate， root length， plant height and hypocotyl length， followed by the soaking time of PPM， and the soaking concentration of PPM was the smallest. The optimal combination A2B3C2 achieved a germination rate of 96.67%， a contamination rate of only 2.22%， a root length of 7.00 cm， a plant height of 8.60 cm， and a hypocotyl lenth of 0.73 cm. In summary， a set of simple and efficent methods with high germination rate and low contamination rate for radish seed disinfection and aseptic seedling culture are explored and developed.

Key words： Radish; Seed sterilization; Plant preservative mixture; Aseptic seedling

蘿卜（Raphanus sativus L.）為十字花科蘿卜屬一、二年生草本植物，是我國重要的根菜類蔬菜作物，因其具有較高的營養(yǎng)價值和醫(yī)療價值，在世界各地廣泛種植[1-2]。近年來，國內(nèi)學(xué)者相繼開展了蘿卜重要性狀的分子生物學(xué)研究，顯著提升了我國蘿卜遺傳育種水平。蘿卜是典型的再生頑拗型植物，遺傳轉(zhuǎn)化十分困難，關(guān)于蘿卜遺傳轉(zhuǎn)化體系和基因功能實質(zhì)性驗證的研究鮮見報道[1，3-4]。遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立離不開組織培養(yǎng)，相對于其他十字花科蔬菜，由于蘿卜小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)率較低，目前蘿卜組織培養(yǎng)所用的外植體主要來源于種子發(fā)芽后生長4 d左右的無菌苗[5-6]。然而蘿卜種子種皮較薄，在脫粒、晾曬過程中易受傷，且種莢收獲后雨水較多，曬種過程中易受潮發(fā)霉進而使種子內(nèi)部受到微生物（內(nèi)生菌或其他有害微生物）污染，普通的表面消毒方法無法徹底消除污染，從而導(dǎo)致組培過程中污染嚴重，影響后續(xù)試驗。

在以往的研究報道中，蘿卜種子采用的常規(guī)消毒劑多為酒精、次氯酸鈉和氯化汞[7-13]。次氯酸鈉和HgCl2消毒后均需無菌水反復(fù)沖洗3～4遍，否則殘留的消毒劑影響無菌苗的正常生長，其步驟繁瑣，且對種子內(nèi)部微生物的消毒效果不佳。因此，建立簡單、高效的無菌苗培養(yǎng)體系是蘿卜遺傳轉(zhuǎn)化體系中的重要環(huán)節(jié)。

植物組培抗菌劑PPM（plant preservative mixture）是一種廣譜抗微生物制劑，能有效抑制植物組織培養(yǎng)中的微生物污染，且在一定濃度和時間內(nèi)不會影響種子發(fā)芽、愈傷組織增殖和再生。同時，它具有極高的熱穩(wěn)定性，能與培養(yǎng)基一起高壓滅菌，無需反復(fù)沖洗，極大地避免了二次污染，應(yīng)用領(lǐng)域及前景非常廣泛[14-21]。目前采用PPM抗菌劑對種子消毒的研究鮮見報道[22]，更未見該抗菌劑用于蘿卜種子消毒的報道。為此，筆者開展了PPM用于蘿卜種子消毒及無菌苗生長的研究，采用正交試驗優(yōu)化篩選獲得了PPM浸泡濃度、浸泡時間及培養(yǎng)基PPM濃度的最佳組合，以期在此環(huán)節(jié)為蘿卜遺傳轉(zhuǎn)化及開放式組培體系的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2022年6—9月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所進行。所用蘿卜編號為2022-198，由玉娘紅（武漢萊福健農(nóng)業(yè)科技有限公司）選育獲得，該品系早熟、耐熱、紅皮、白肉。植物組培抗菌劑PPM購于北京酷來搏科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 以PPM浸泡濃度（A）、浸泡時間（B）、培養(yǎng)基PPM濃度（C）為因素，每個因素4個水平，按L16（43）正交表（表1）進行正交試驗設(shè)計。共16個處理（處理1為對照組，即浸泡時間為0 h，且培養(yǎng)基未添加PPM），每個處理30粒種子，3次重復(fù)，播于90 mm培養(yǎng)皿上。

無菌苗的獲得：選取顆粒飽滿的蘿卜種子，按照表1的正交設(shè)計，將種子分別浸泡0、0.5、2、4 h后，直接播于1/2 MS培養(yǎng)基（含20 g·L-1蔗糖+10 g·L-1瓊脂粉，pH 5.8）上，培養(yǎng)基按表1處理添加不同濃度的PPM。于溫度為25 ℃、光照時間為16 h·d-1、光照度為2000 lx條件下培養(yǎng)，獲得無菌苗。

1.2.2 測定指標及方法 播種5 d后，統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)、污染種子數(shù)，并用直尺（精度為1 mm）測量根長、株高和下胚軸長度，計算發(fā)芽率和污染率。

發(fā)芽率/%=發(fā)芽種子數(shù)/播種種子數(shù)×100；

污染率/%=污染種子數(shù)/播種種子數(shù)×100；

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016進行統(tǒng)計，以SPSS 19.0進行差異顯著性分析，并采用極差分析各因素的主次效應(yīng)及優(yōu)選組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPM對蘿卜種子消毒效果和無菌苗生長的影響

圖1和表2為蘿卜種子16個不同處理的發(fā)芽及無菌苗生長情況。在所有處理中，處理7的污染率最低，為0，且顯著低于處理1、6、10、11和16，其中處理6、11和16僅進行了PPM浸種處理，無菌苗生長的培養(yǎng)基中均未添加PPM，污染率在30.00%以上，但與培養(yǎng)基中未添加PPM的處理1（污染率65.56%）相比，污染率顯著降低。而處理5、9和13均未進行浸種消毒，僅在培養(yǎng)基中添加了PPM，污染率在2.00%～4.00%。浸種與培養(yǎng)基中同時使用PPM的處理2、3、4、7、8、10、12、14、15，其污染率在0～6.67%。由以上結(jié)果可知，蘿卜種子單獨采用PPM浸種處理，其污染率最高可達51.11%，無法滿足組培的需求，而在培養(yǎng)基中同時使用PPM，處理7、4和12可以使污染率降低至小于2.00%。從發(fā)芽率來看，未使用PPM的處理1最高，為100.00%，且處理1、2、3、5、6、7、8、9、13、14、15之間差異不顯著，發(fā)芽率均高于95.55%，處理1發(fā)芽率僅顯著高于4、10、11、12、16處理。上述低污染率且高發(fā)芽率的PPM處理組合2、3、5、7、8、9、13、14、15均可用于蘿卜種子消毒培養(yǎng)且不影響種子的萌發(fā)。

蘿卜幼苗的生長發(fā)育根據(jù)根長、株高、下胚軸長3個指標進行統(tǒng)計分析，其對照均為處理1。由表2可知，處理2、5、6、8、11、12、15的根長均顯著長于對照，處理2的根最長，為8.00 cm；處理6、11、12、15的株高顯著高于對照，處理6的株高最高，為8.80 cm。處理2、5、7、8、11、12、15、16的下胚軸長均顯著長于對照，處理2下胚軸最長，為0.83 cm。以上結(jié)果表明，處理11、12、15的根長、株高和下胚軸長均顯著高于對照。

因此，蘿卜種子在適宜濃度的PPM溶液中浸泡后，直接播種于含合適濃度的PPM培養(yǎng)基中萌發(fā)生長，可獲得高發(fā)芽率、低污染率，且生長指標最優(yōu)的無菌苗。綜合發(fā)芽率、污染率、根長、株高和下胚軸長，從處理11、12、15中初步篩選出發(fā)芽率最高的處理15，即3.0% PPM浸泡2 h后播種于PPM濃度為0.1%的1/2 MS培養(yǎng)基中，作為蘿卜種子消毒及無菌苗培養(yǎng)的初篩最優(yōu)組合（表2）。

2.2 各因素對消毒效果和無菌苗生長指標的影響

從表3方差分析結(jié)果可知，PPM浸泡濃度僅對污染率有顯著影響，對發(fā)芽率、根長、株高和下胚軸長的影響不顯著；浸泡時間對發(fā)芽率、污染率、根長、株高和下胚軸長均具有顯著影響；培養(yǎng)基PPM濃度對污染率、根長、株高和下胚軸長有顯著影響，對發(fā)芽率的影響不顯著。

2.3 各因素主次效應(yīng)分析

極差（R）可反映各因素對指標所產(chǎn)生的主次效應(yīng)，極差值越大，即該因素越重要，因此通過極差分析可推斷最優(yōu)處理組合。由表4可知，影響蘿卜種子發(fā)芽率的3個因素極差排序為B（15.00）＞A（3.33）＞C（1.67），即浸泡時間是影響蘿卜種子發(fā)芽的最主要因素，PPM浸泡濃度的影響次之，培養(yǎng)基PPM濃度的影響最小。影響污染率、根長、株高和下胚軸長3個因素的極差排序均為C＞B＞A，即培養(yǎng)基PPM濃度是影響蘿卜污染率、根長、株高和下胚軸長的最主要因素，浸泡時間的影響次之，PPM浸泡濃度的影響最小。

根據(jù)主次分析結(jié)果及K值確定了各因素的最優(yōu)組合。發(fā)芽率最優(yōu)組合為A2B1C3，即將干種子直接點播于含PPM為0.3%的1/2MS培養(yǎng)基中。污染率最優(yōu)組合為A3B3C2，即2% PPM浸泡2 h，培養(yǎng)基PPM濃度為0.1%。根長、株高和下胚軸長最優(yōu)組合為A2B3C2，即1.5% PPM浸泡2 h，培養(yǎng)基PPM濃度為0.1%。在蘿卜種子組織培養(yǎng)過程中，污染率和發(fā)芽率滿足試驗需求的情況下，應(yīng)選擇對根長、株高和下胚軸長等各指標影響差異不顯著的處理作為最優(yōu)處理。按照此標準，綜合主次效應(yīng)結(jié)果并根據(jù)K值獲得本研究中蘿卜種子消毒、發(fā)芽及無菌苗生長的理論最優(yōu)處理為A2B3C2，即1.5% PPM浸泡2 h，培養(yǎng)基PPM濃度為0.1%。

為進一步驗證理論最優(yōu)處理A2B3C2對蘿卜種子消毒和無菌苗生長的影響，處理A2B3C2、初篩處理15和次氯酸鈉處理（1%NaClO消毒10 min，無菌水沖洗4次）進行比較試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，次氯酸鈉處理的污染率顯著高于處理15和理論最優(yōu)處理A2B3C2，3個處理間的發(fā)芽率、根長、株高和下胚軸長無顯著差異（表5）。最終確定1.5% PPM對蘿卜種子浸泡2 h后，播于含0.1% PPM的1/2MS培養(yǎng)基上可獲得最優(yōu)效果，其發(fā)芽率為96.67%，污染率為2.22%，根長7.00 cm，株高8.60 cm，下胚軸0.73 cm。

3 討論與結(jié)論

研究表明，PPM活性成分可以滲透真菌或細菌細胞壁，抑制檸檬酸循環(huán)和電子傳遞鏈等中心代謝循環(huán)中的關(guān)鍵酶活性，并有效抑制培養(yǎng)基中單糖和氨基酸向真菌細胞壁的運輸[18，21]，但關(guān)于單獨將PPM抗菌溶液用于蘿卜種子消毒及無菌苗培養(yǎng)的研究未見報道。筆者綜合研究了PPM浸泡濃度、浸泡時間和培養(yǎng)基中PPM濃度3個因素對蘿卜種子消毒及無菌苗生長發(fā)育的影響。

PPM浸泡濃度對發(fā)芽率、根長、株高和下胚軸長的影響無顯著差異，表明蘿卜種子對PPM耐受性較強；但其對污染率的影響顯著，表明了浸種液中高濃度的PPM可以有效抑制微生物生長[18]。由于高濃度的PPM抗菌溶液浸種2 h不影響蘿卜幼苗的生長發(fā)育，因此針對不同批次及來源的原始污染未知的蘿卜種子，高濃度的PPM浸種可以盡可能地為防止污染提供保障，最終在最優(yōu)組合的篩選中，仍然選擇了同時進行PPM浸種和培養(yǎng)基中添加PPM的試驗設(shè)計。

浸泡時間對消毒效果和無菌苗的生長均具有顯著影響，特別是對污染率的影響，表明PPM需要較長的時間才能滲入組織內(nèi)部，進而達到消毒和抑制污染的目的。上述結(jié)果與孫亞玲等[22]在洋蔥種子消毒培養(yǎng)上的研究相似。但本試驗浸種時間的設(shè)計不同于孫亞玲等[22]對洋蔥種子長達24～48 h的浸種時間，這與蘿卜種子長時間浸種會導(dǎo)致種苗腐爛和死亡的發(fā)芽特性有關(guān)[22-23]。因此，利用PPM浸種消毒不同作物的種子，要根據(jù)作物種子的特性，選擇合適的浸種時間，否則會造成窒息爛種。

研究表明，在離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加一定濃度的PPM可以有效控制污染，如果濃度過高，在抑制污染的同時也會對外植體的生長發(fā)育產(chǎn)生抑制，因此在應(yīng)用于不同的作物時需要進行PPM合適濃度的篩選，前人已對甜瓜、煙草、矮牽牛、積雪草（Centella asiatica）、蕓香科枸橘（Poncirus trifoliata）和粗皮檸檬（Citrus jambhiri）、洋蔥、橡膠樹進行了相關(guān)的研究[14，17-18，22，24]。本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加PPM顯著影響根長、株高和下胚軸長，理論最優(yōu)組合A2B3C2的測試結(jié)果顯示，PPM濃度為0.1%時可有效抑制污染，且其發(fā)芽和生長指標與次氯酸鈉處理相比無顯著差異。

關(guān)于培養(yǎng)基中適宜濃度的PPM對外植體的促生作用也有相關(guān)的文獻報道。孫亞玲等[22]的研究表明，用pH值為2的PPM溶液浸泡洋蔥種子可以顯著提高洋蔥種子4 d的發(fā)芽勢至75.83%，其發(fā)芽率在8 d內(nèi)即可達最大，為92.65%。成鏡等[24]的研究表明，0.65 mL·L-1的PPM對橡膠樹次生體細胞胚發(fā)生有促進作用，出胚率增加18.1%。筆者研究中的最優(yōu)組合A2B3C2蘿卜種子的發(fā)芽率與次氯酸鈉處理相比無顯著差異，而PPM是否對蘿卜組培苗的再生以及遺傳轉(zhuǎn)化具有促進作用，仍需進一步的試驗驗證。

筆者通過正交試驗獲得了蘿卜種子消毒培養(yǎng)的簡單有效方法，即1.5% PPM浸泡蘿卜種子2 h，播于含PPM濃度為0.1%的1/2MS培養(yǎng)基上，這為種子作物的無菌苗培養(yǎng)，以及開放式組培體系的建立提供了技術(shù)支持。

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