孫玉鳳，葛卓琦，李銀洛，白雪，林淑嫻, ，陳琦*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025

2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550025

3.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002

據(jù)2021 年國際糖尿病聯(lián)合會數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前世界上有5.37 億20～79 歲的成年人患有糖尿病，而我國患病人數(shù)高達(dá)1.4 億，居世界首位，預(yù)計(jì)2045年將達(dá)到1.74 億[1]。糖尿病作為代謝性疾病之一，可導(dǎo)致多器官損傷，糖尿病心臟病變則是糖尿病患者死亡的主要原因[2-3]。而糖尿病心肌病是多種病因?qū)е碌囊环N疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且在糖尿病心臟病變中，具有較高的發(fā)病率和嚴(yán)重的不良預(yù)后，備受人們關(guān)注[4]。目前臨床上還未有針對該病的治療及預(yù)防的藥物，故尋求新的治療技術(shù)和方法迫在眉睫。

近年來，隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中藥及其單體成分在糖尿病心肌病的治療中發(fā)揮了重要作用，特別是中藥及活性成分新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)很有可能成為治療糖尿病引起心肌病變的重要靶標(biāo)。黃芩是唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi 干燥根，具有瀉火燥濕、解毒寧心等功效，據(jù)2021 年版《糖尿病心肌病病癥結(jié)合診療指南》強(qiáng)烈推薦其用于治療中度糖尿病心肌病及熱毒熾盛引起的心律失常[5-6]。黃芩中含有黃芩素、黃芩新素、黃芩苷、漢黃芩素、漢黃芩苷等黃酮類化合物，具有降低血糖、抗炎、抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡等作用[7-11]。黃芩有效成分被廣泛應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治中，能有效改善糖尿病并發(fā)的心肌缺血和抑制心肌纖維化[12]。因此，黃芩有效成分在糖尿病心肌病防治方面有著廣闊的空間，需要進(jìn)一步開發(fā)和探索。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從整體角度預(yù)測藥物與疾病之間的相互作用，揭示藥物成分、靶點(diǎn)、疾病之間復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[13]，分子對接則通過受體蛋白與配體藥物分子之間的相互作用來分析、預(yù)測其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法[14]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，挖掘黃芩活性成分及治療糖尿病心肌病的主要靶點(diǎn)、相關(guān)通路，闡明黃芩治療糖尿病心肌病潛在的作用機(jī)制，為黃芩治療糖尿病心肌病提供細(xì)胞分子層面的參考。

1 材料與方法

1.1 黃芩潛在活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，https://tcmsp-e.com）以“黃芩”為關(guān)鍵詞檢索黃芩中的化學(xué)成分及對應(yīng)靶點(diǎn)，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 篩選該藥的活性成分，并獲取各成分相應(yīng)的靶點(diǎn)[15]。對于無法獲得的靶點(diǎn)則通過SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch）數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行補(bǔ)充。

1.2 疾病靶點(diǎn)的篩選

通過人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM（http://www.omim.org/）、疾病相關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫GeneCards（https://www.genecards.org/）以“diabetic cardiomyopathy”為關(guān)鍵詞，進(jìn)行人類基因檢索。合并2 個數(shù)據(jù)庫糖尿病心肌病疾病靶點(diǎn)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后，得到糖尿病心肌病疾病靶點(diǎn)。

1.3 靶標(biāo)蛋白基因名的確定及活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

在蛋白數(shù)據(jù)庫 UniProt（https://www.uniprot.org/）中下載人類全基因名稱與黃芩成分對應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，得到相應(yīng)靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化的基因名稱。與SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫檢索到的靶點(diǎn)進(jìn)行綜合，去重得到成分靶點(diǎn)。將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)輸入 Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在線平臺，得到交集靶點(diǎn)，即黃芩抗糖尿病心肌病的作用靶點(diǎn)。將黃芩活性成分及交集靶點(diǎn)對應(yīng)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件（http://www.cytoscape.org/）構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將1.3 項(xiàng)下得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String（https://cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫中，選擇“Multiple proteins”，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，選擇最小交互打分值為0.4 隱藏離散蛋白，導(dǎo)出PPI 網(wǎng)絡(luò)分析“TSV”格式文件。將該文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件中，并借助軟件分析工具對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，根據(jù)degree 值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，并篩選degree 值靠前的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。

1.5 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路分析

將1.3 項(xiàng)下的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫，通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，進(jìn)行GO 富集分析及KEGG 代謝通路富集分析，其中GO 分析包括生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF），并用微生信在線工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）將其結(jié)果可視化。最后利用Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建其“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接

選取Cytoscape 3.9.0 軟件分析結(jié)果degree 值前10 位的黃芩有效成分與潛在作用靶點(diǎn)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索下載小分子“mol2”格式文件和在PDB（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載大分子分辨率高的3D 結(jié)構(gòu)，并保存分析“pdb”格式文件，導(dǎo)入PyMOL 2.4.1 軟件對蛋白配體移除水分子、小分子配體，再將其導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.7 軟件對大分子蛋白進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷并設(shè)置為原子類型。最后選中所有活性位點(diǎn)，通過AutoDock Tools 1.5.7 設(shè)置對接盒子進(jìn)行分子對接，最后采用PyMOL 2.4.1軟件對結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 黃芩活性成分及靶點(diǎn)的篩選

利用檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 進(jìn)行篩選，共得到36 個活性成分，見表1。通過TCMSP 和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫共收集到2 828 成分靶點(diǎn)進(jìn)行綜合，剔除重復(fù)及無標(biāo)準(zhǔn)靶點(diǎn)后得到513 個黃芩活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)。

表1 黃芩活性成分Table 1 Active ingredients of Scutellaria baicalensis

2.2 糖尿病心肌病潛在靶點(diǎn)預(yù)測

以“diabetic cardiomyopathy”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫分別檢索糖尿病心肌病的相關(guān)靶點(diǎn)，并采用微生信在線繪圖，分別獲得474、1 131 個疾病靶點(diǎn)。去除92 個重復(fù)靶點(diǎn)，合并去重得到1 513 個潛在靶點(diǎn)。

2.3 黃芩活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選出的活性成分與該成分對應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件中，分析得到活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)包含171 節(jié)點(diǎn)，2 180 條邊，其中形狀越大表示其degree值越高，相互作用越強(qiáng)。表明該成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)越多、靶點(diǎn)與成分之間的相互作用越強(qiáng)、成分越核心，體現(xiàn)了黃芩多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

圖1 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Active component-target network

2.4 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)篩選與靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Venny 2.1.0 繪制黃芩活性成分靶點(diǎn)與糖尿病心肌病靶點(diǎn)的交集，得到151 個共同靶點(diǎn)，見圖2。并將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 在線網(wǎng)絡(luò)平臺，設(shè)置置信度＞0.4，進(jìn)行分析，下載TSV 格式文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，該圖包括151 個節(jié)點(diǎn)，2 300 條邊，其中節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，代表其degree 值越大，連線越粗代表蛋白間的相互作用越強(qiáng)。根據(jù)degree 值、中介系數(shù)中心性、接近度中心性得到蛋白激酶B1（Akt1）、腫瘤壞死因子（TNF）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）等10 個靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，見表2。

圖2 活性成分-糖尿病心肌病靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of active component-diabetic cardiomyopathy targets

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network

表2 核心靶點(diǎn)信息Table 2 Information of key targets

2.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析

運(yùn)用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫，對共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，得到775 條BP 條目、86 條CC 條目和167 條MF 條目，根據(jù)分析將各類GO 功能富集按P值進(jìn)行排序，取排名前10 位的條目進(jìn)行作圖，見圖4。其柱狀圖越高，則靶點(diǎn)在該通路上所富集的靶標(biāo)蛋白越多，說明這條通路更重要。

圖4 GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

結(jié)果可見，BP 主要涉及對絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)正調(diào)節(jié)、基因表達(dá)的正向調(diào)控、藥物反應(yīng)、絲裂原活化蛋白激酶活性的正向調(diào)節(jié)等；CC 主要集中受體復(fù)合物、質(zhì)膜、膜筏、高分子配合物及胞外區(qū)等；MF 主要體現(xiàn)酶結(jié)合位點(diǎn)、相同蛋白的結(jié)合、RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子活性及蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。

KEGG 通路分析得到169 條信號通路，以P值大小為篩選標(biāo)準(zhǔn)，取排名前30 位的信號通路，運(yùn)用微生信在線繪制氣泡圖，見圖5。可見該基因主要涉及癌癥（基因數(shù)48）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（基因數(shù)34）、癌癥中的蛋白多糖（基因數(shù)29）、晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE，基因數(shù)28）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt（基因數(shù)31）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK，基因數(shù)28）等相關(guān)通路。其中有10 條與糖尿病心肌細(xì)胞損傷有關(guān)。圖中橫坐標(biāo)代表基因比率，縱坐標(biāo)代表通路；氣泡越大表示在該通路上富集的基因數(shù)量越多，顏色越深表示P值越小、富集的顯著性越高。將篩選出的主要成分、作用靶點(diǎn)、信號通路與疾病，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0，得到“活性成分-交集靶點(diǎn)-信號通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)路，見圖6，圖中共有162 節(jié)點(diǎn)、1 326 條邊，由圖可知，黃芩治療糖尿病心肌病是通過該藥中的36 個活性成分作用30 條主要通路和94 個靶點(diǎn)基因的結(jié)果。

圖5 KEGG 通路富集分析（前30 位）Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis（top 30）

圖6 黃芩成分-靶點(diǎn)-通路-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Compounds-targets-pathways network of Scutellaria baicalensis

2.6 分子對接

選擇degree 值前10 位的黃芩活性成分（表3）與degree 值排名前4 位的作用靶點(diǎn)，即Akt1、TNF、GAPDH、白細(xì)胞介素-6（IL-6）。利用AutoDock 1.5.7軟件進(jìn)行分子對接并打分，見圖7。一般認(rèn)為，若結(jié)合能在-5.0 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）以下時(shí)，說明此成分與對接靶點(diǎn)蛋白結(jié)合性較好，若結(jié)合能在-7.0 kcal/mol 以下時(shí)，則表明對接的兩則具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[16]，是與疾病靶點(diǎn)結(jié)合較好的活性成分。結(jié)果顯示，40 組配體化合物-受體蛋白對接結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，其中小于-8.0 kcal/mol 的有19 組，約占48%，表明本研究中所預(yù)測的活性成分可與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白穩(wěn)定結(jié)合并發(fā)揮治療糖尿病心肌病的作用。將上述對接結(jié)果用PyMOL 2.4.1軟件對其進(jìn)行可視化分析，見圖8。如圖所示，活性成分黃芩素與關(guān)鍵靶點(diǎn)Akt1、TNF、GAPDH、IL-6 等的結(jié)合能均小于-8 kcal/mol，表明結(jié)合能力較強(qiáng)、結(jié)合構(gòu)象較穩(wěn)定。

圖7 黃芩核心成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能熱圖Fig.7 Thermal map of binding energy between core components and core targets of Scutellaria baicalensis

圖8 黃芩素分子對接圖Fig.8 Molecular docking diagram of baicalein

表3 黃芩10 種核心成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)Table 3 Characteristic parameters of network nodes of 10 core components of Scutellaria baicalensis

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對黃芩活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)信號通路及其抗糖尿病心肌病作用機(jī)制等進(jìn)行探討，并對其活性成分與相關(guān)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18 及符合類藥性五原則篩選，共篩選出36 種活性化合物和151 個潛在黃芩治療糖尿病心肌病的疾病靶點(diǎn)。通過“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)：漢黃芩素（wogonin）、黃芩素（baicalein）、表小檗堿（epiberberine）、黃芩新素（skullcapflavone II）等化合物可能在黃芩治療糖尿病心肌病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中漢黃芩素和黃芩素，分別對應(yīng)48、44 個靶基因。有研究表明，黃酮類化合物漢黃芩素和黃芩素均具有降血糖的作用[17]。漢黃芩素可以抑制葡萄糖吸收、肝臟中糖的生成及調(diào)節(jié)糖代謝過程中限速酶的表達(dá)等途徑，降低血糖，并改善氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而抑制高血糖導(dǎo)致的損傷[18-19]。黃芩素能抑制NF-κB 信號通路和游離脂肪酸釋放，減少炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，調(diào)節(jié)糖代謝，增強(qiáng)胰島素敏感性信號激活，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，對高脂導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用[20]。

本研究共獲得黃芩活性成分作用靶點(diǎn)與糖尿病心肌病疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)151 個，這151 個靶點(diǎn)可能是黃芩抗糖尿病心肌病的潛在靶點(diǎn)。PPI 網(wǎng)絡(luò)及分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩抗糖尿病心肌病的核心靶點(diǎn)有Akt1、TNF、GAPDH、IL-6 等，主要參與細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥、分化等BP，可能是黃芩抗糖尿病心肌病主要靶點(diǎn)。Akt1 與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 信號傳遞密切相關(guān)，可通過控制葡萄糖的攝取發(fā)揮調(diào)控血糖的作用[21]。TNF 可通過促進(jìn)胰島素受體底物1（ISR-1）的絲氨酸磷酸化來降低胰島素所涉及信號的傳導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)胰島素抵抗的產(chǎn)生[22]。TNF-α 是TNF 通路中最關(guān)鍵的效應(yīng)分子，TNF-α 可通過調(diào)控位于脂肪以及肌肉細(xì)胞的胰島素受體，減少葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成[23]。GAPDH 是一種非常豐富的糖酵解酶，它是介導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡的主要細(xì)胞內(nèi)信使。研究表明，氧化GAPDH 將S-谷胱甘肽基化轉(zhuǎn)移到核蛋白Sirtuin-1 上，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24]。IL-6 在病程早期可通過促進(jìn)胰島素產(chǎn)生，導(dǎo)致高胰島素血癥；晚期則可通過抑制細(xì)胞表面葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT-4）活性及誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號抑制因子（SOCS-3）蛋白表達(dá)增多，干擾胰島素信號傳導(dǎo)通路，從而促進(jìn)糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[25]。有研究表明，黃芩素能減少高糖誘導(dǎo) HK-2 細(xì)胞中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）含量及TNF-αmRNA 和p-Akt、TNF-α 蛋白等的表達(dá)，對腎小管上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用[26]。黃芩素還可以通過抑制IL-6、TNF-α、IL-1β 等炎癥因子表達(dá)，改善肥胖小鼠體脂及胰島素抵抗的作用，調(diào)節(jié)異常糖脂代謝[27]。因此，以上靶點(diǎn)可能在黃芩及其活性成分治療糖尿病心肌病中發(fā)揮同等重要的作用。

隨后，本研究對黃芩抗糖尿病心肌病病變作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集和KEGG 富集分析。結(jié)果表明，其BP 主要涉及MAPK 級聯(lián)正調(diào)節(jié)、基因表達(dá)的正向調(diào)控、藥物應(yīng)答、絲裂原活化蛋白激酶活性的正向調(diào)節(jié)、PI3K 信號的陽性調(diào)控反應(yīng)等；CC 主要集中受體復(fù)合物、細(xì)胞膜、膜筏等；MF 主要體現(xiàn)酶結(jié)合位點(diǎn)、相同蛋白的結(jié)合及配RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。KEGG 富集通路表明，黃芩抗糖尿病心肌病信號通路涉及AGERAGE 信號通路、內(nèi)分泌抵抗、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路、TNF 信號通路等。其中排名最前的AGE-RAGE 信號通路在糖尿病及其并發(fā)癥聯(lián)系十分密切，主要與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，能激活Janus 激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子（JaK-STAT）、PI3K-Akt、MAPK 等信號通路，并促進(jìn)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激的發(fā)生[28]。炎癥在糖尿病心肌病的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用，糖尿病患者體內(nèi)的炎癥因子（TNF-α、IL-1、IL-6）和細(xì)胞因子及趨化因子的升高，促進(jìn)炎癥聯(lián)級的發(fā)生，加重了胰島素的抵抗作用，導(dǎo)致糖尿病患者代謝紊亂[29]，使心細(xì)胞肥大、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加、成纖維細(xì)胞增殖和膠原的生成[23]，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，左心室收縮、舒張功能障礙。TNF-α 是TNF 通路中最關(guān)鍵的效應(yīng)分子，參與誘發(fā)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等過程[23,25,27]。近年研究表明，HIF-1α 及其下游的其他靶分子如內(nèi)皮型一氧化氮合酶、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 等，均可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增多，調(diào)節(jié)糖尿病患者血管生成，參與VEGF 的調(diào)控紊亂共同導(dǎo)致糖尿病心肌I/R 時(shí)側(cè)支循環(huán)血管生成障礙[30-31]。因此，結(jié)合分子對接和KEGG 代謝通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩活性成分可能通過參與調(diào)控葡萄糖的獲取、減少炎癥因子分泌、改善胰島素信號通絡(luò)，發(fā)揮抗糖尿病心肌病作用。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接相結(jié)合的方法來探討黃芩抗糖尿病心肌病的活性成分、靶點(diǎn)及其作用機(jī)制，證明了黃芩通過多靶點(diǎn)、多成分和多途徑的相互作用治療糖尿病心肌病。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突