高冉冉，李雯莉，王瑩，曹陽*

1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 急救·創(chuàng)傷中心，新疆 烏魯木齊 830011

2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 醫(yī)務(wù)部醫(yī)務(wù)管理科，新疆 烏魯木齊 830011

慢性乙型肝炎表現(xiàn)為乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性，高發(fā)病于中國和東南亞等地區(qū)[1]。慢性乙型肝炎的病程發(fā)展包括纖維化進展、肝硬化形成和肝細胞癌（HCC）發(fā)展等嚴重危害[2]。乙型肝炎病毒（HBV）可與宿主免疫相互作用，產(chǎn)生持續(xù)存在和再激活[3]。盡管目前的直接抗病毒療法在控制HBV 復制和肝硬化方面有一定療效，但停藥后復發(fā)率高，需要終身給藥[4]。此外，治療性疫苗接種治療和免疫治療也常用于HBV 感染群體的治療[5-6]。傳統(tǒng)中藥及其復方有作用靶點多和不良反應(yīng)少的特點，可能在聯(lián)合治療慢性乙型肝炎中有明顯的優(yōu)勢，常見的聯(lián)合治療慢性乙型肝炎的中藥復方有扶正化瘀湯、安絡(luò)化纖丸和五靈膠囊等[7-8]。五靈膠囊由柴胡、靈芝、丹參、五味子4 味中藥組成，可以修復受損肝細胞[9]。HPLC 指紋圖譜分析顯示五靈膠囊中主要成分有丹酚酸B、柴胡皂苷A、五味子醇甲、五味子甲素、丹參酮ⅡA、五味子乙素等[10]。五靈膠囊自上市以來廣泛用于慢性乙型肝炎的治療，聯(lián)合抗病毒藥物可以降低患者血清肝纖維化指標和肝生化指標[11-12]。然而五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的機制尚未完善，需要進一步研究和探索。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合分子對接技術(shù)通過數(shù)據(jù)庫的匯總和收集揭示五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的主要活性成分、靶標和機制，為臨床五靈膠囊的應(yīng)用和慢性乙型肝炎的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 五靈膠囊的活性成分和靶點篩選

采用 TCMSP（http://tcmspw.com/）、ETCM（http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）和BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm/）數(shù)據(jù)庫篩選五靈膠囊成分和靶點。以口服生物度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 作為五靈膠囊中活性成分的篩選標準。隨后采用Uniprot（https://www.uniprot.org/）對五靈膠囊相關(guān)靶點進行標準化，合并3 個數(shù)據(jù)庫獲得五靈膠囊的活性成分和侯選靶點。

1.2 慢性乙型肝炎疾病靶點的收集

慢性乙型肝炎疾病靶點采用GeneCards（https://www.genecards.org/）、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、DisGeNET（https://www.Dis genet.org/）數(shù)據(jù)庫分別搜索“chronic hepatitis B”關(guān)鍵詞獲得。

1.3 五靈膠囊治療慢性乙型肝炎核心靶點篩選

將五靈膠囊的活性成分靶點與3 個數(shù)據(jù)庫得到慢性乙型肝炎的靶點共同取交集，得到五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的潛在靶點，即共同靶點。隨后將交集靶點上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.stringdb.org/）構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）。采用Cytoscape 軟件繪制交集靶標網(wǎng)絡(luò)圖以及五靈膠囊活性成分與交集靶點的網(wǎng)路圖，綜合2 個網(wǎng)絡(luò)圖得到五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的活性成分和核心靶標。

1.4 基因本體（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

采用Oebiotech 平臺（https://cloud.oebiotech.cn/task/）進行GO 和KEGG 富集，獲得相關(guān)生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）和相關(guān)通路。篩選P＜0.05 的GO 和KEGG 條目繪制條形圖和氣泡圖。

1.5 分子對接分析

為了驗證活性成分與對應(yīng)靶標的結(jié)合強弱，采用MOE 軟件對上述篩選得到的五靈膠囊活性成分和核心靶標進行分子對接。分別從PubChem 和PDB數(shù)據(jù)庫獲得成分和靶標的3D 結(jié)構(gòu)。將核心靶標刪除水分子和進行質(zhì)子化后，分別與對應(yīng)的活性成分進行對接，獲得結(jié)合能以及對接的2D 和3D 結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 五靈膠囊活性成分和靶點

篩選后得到五靈膠囊成分107 種和靶標398個。來源于柴胡的活性成分有13 種，靈芝活性成分有26 種，丹參活性成分有59 種，五味子活性成分有7 種。另外黃芩苷（baicalin）、長管貝殼杉素A（longikaurin A）為共有成分。

2.2 五靈膠囊治療慢性乙型肝炎核心靶點

從GeneCard、NCBI、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫分別獲得慢性乙型肝炎靶標10 911、278、415 個，3 個數(shù)據(jù)庫與五靈膠囊389 個靶標取交集，繪制韋恩圖，見圖1。其中五靈膠囊與3 個數(shù)據(jù)庫共有靶標有29個，包括雌激素受體（ESR1）、過氧化物酶體增殖激活受體（PPARG）、人絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）、一氧化氮合酶（NOS2）等。

圖1 五靈膠囊與慢性乙型肝炎交集靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of intersection target between Wuling Capsules and chronic hepatitis B

2.3 核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

構(gòu)建五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的29 個靶標的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。在PPI 圖中越靠近中心的靶標與其他靶標相關(guān)性越強，可能在五靈膠囊治療慢性乙型肝炎中越關(guān)鍵。核心靶標網(wǎng)絡(luò)圖中采用degree 值進行排序，degree 值越高則在五靈膠囊治療慢性乙型肝炎中可能越重要。最終得到五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的交集靶標有抑癌基因TP53（degree＝26）、白細胞介素-6（IL-6，degree＝26）、腫瘤壞死因子（TNF，degree＝26）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG，degree＝25）等。

圖2 29 個交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network graph of 29 intersection targets

2.4 五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的成分–靶點網(wǎng)絡(luò)圖

依據(jù)五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的29 個靶標，從五靈膠囊107 種活性成分中篩選與29 個靶標相對應(yīng)的成分為五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的活性成分，共得到44 種活性成分，見表1。采用Cytoscape構(gòu)建44 種五靈膠囊活性成分和29 個慢性乙型肝炎交集靶標的網(wǎng)絡(luò)圖。如圖3 所示，采用成分和靶標的degree 值進行排序，得到五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的主要活性成分有來源于柴胡的槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）；來源于靈芝的靈芝酸Z（ganodermic acid Z）、靈芝醇F（ganoderiol F）；來源于五味子的戈米辛R（gomisin R）；來源于丹參的二氫丹參酮內(nèi)酯（dihydro tanshinlactone）、木犀草素（luteolin）和丹參酮ⅡA（tanshinone ⅡA）等。相關(guān)成分較多的靶標主要有ESR1（degree＝33）、PPARG（degree＝13）、NOS2（degree＝11）、維生素D 受體（VDR，degree＝8）、TNF（degree＝7）等。

表1 五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的44 種活性成分Table 1 44 Active ingredients of Wuling Capsules in treatment of chronic hepatitis B

圖3 44 種五靈膠囊活性成分與29 個交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of 44 active ingredients of Wuling Capsules and 29 intersection targets

2.5 GO 和KEGG 富集結(jié)果

將29 個五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的核心靶點進行GO、KEGG 富集分析，結(jié)果見圖4、5。五靈膠囊發(fā)揮抗慢性乙型肝炎功效主要通過調(diào)控生物黏附（biological adhesion）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）和細胞殺傷（cell killings）等BP；抗氧化活性（antioxidant activity）、催化活性（catalytic activity）和酶調(diào)節(jié)劑活性（enzyme regulator activity）等MF；以及細胞連接（cell junction）、細胞部分（cell part）和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）等CC。五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的靶標主要富集于IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）和Th17 細胞分化（Th17 cell differentiation）和TNF 信號通路（TNF signaling pathway）等。其中在IL-17 信號通路中，κ 輕肽基因增強子核因子抑制因子 α（NFKBIA）、MAPK14 可以激活炎癥因子IL-6、TNFα、趨化因子2（CCL2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等。

圖4 GO 富集條形圖Fig.4 GO enrichment bar graph

圖5 KEGG 富集氣泡圖Fig.5 KEGG enriched bubble diagram

2.6 五靈膠囊活性成分與核心靶點分子對接結(jié)果

將ESR1、白細胞介素-1β（IL-1β）、MMP-9、NFKBIA、NOS2、PPARG、TP53、TNF 與成分靶標網(wǎng)絡(luò)圖中對應(yīng)的成分進行分子對接。如圖6 所示，共得到26 組對接，采用熱圖展示各組對接的結(jié)合能，結(jié)合能小于-5 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）均表示成分和靶標容易結(jié)合。如圖7 所示，五靈膠囊活性成分與核心靶標間結(jié)合力較強。

圖6 分子對接熱圖Fig.6 Molecular docking heat map

圖7 分子對接圖Fig.7 Molecular docking diagrams

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學分析表明，五靈膠囊中有44 種活性成分作用于29 個治療慢性乙型肝炎的核心靶點，其中主要成分包括異鼠李素、山柰酚、槲皮素、黃芩苷、靈芝酸R、靈芝醇F、丹參酮ⅡA、異丹參酮Ⅱ、木犀草素、戈米辛R、隱丹參酮等。有研究通過分析五靈膠囊的藥效作用成分發(fā)現(xiàn)五味子甲素（schisandrin A）、五味子乙素（schisandrin B）、隱丹參酮（crytotanshinone）和丹參酮ⅡA是可以阻止肝細胞免受D-氨基半乳糖誘導的損傷[13]，改善肝功能指標[14]。五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的成分-靶標網(wǎng)絡(luò)圖顯示，隱丹參酮主要調(diào)控TNF 和STAT3 靶標，丹參酮ⅡA作用于MMP-9、NFKBIA、TP53，表明五靈膠囊的主要藥效成分有丹參酮ⅡA、隱丹參酮、五味子乙素、靈芝酸R 和黃芩苷等。

目前，五靈膠囊及其活性成分治療慢性乙型肝炎已有相關(guān)的研究報道。五味子丙素（schisandrin C）可以激活鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激因子（STING）通路降低HBV 小鼠模型中乙肝病毒e、c、s 抗原（HBeAg、HBcAg、HBsAg）和HBV-DNA 水平[15]。黃芩苷的苷元成分黃芩素能顯著調(diào)控HBV 野生型細胞株HepG2.2.15 的HBsAg和HBeAg，且黃芩苷和恩替卡韋聯(lián)合治療對抗病毒治療（核苷類似物NAs）耐藥HBVrtM204V/rtLl80M轉(zhuǎn)染的肝癌HepG2 細胞有更顯著的作用[16]。山柰酚和槲皮素處理可以降低TNF-α 刺激的L02 正常肝細胞中活化的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）蛋白水平，增加磷酸化-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）、磷脂酰肌醇三羥基激酶（PI3K）和B細胞淋巴瘤-xL（Bcl-xL）蛋白的表達；抑制LX2 肝星形細胞的增殖，上調(diào)促凋亡因子Bax 和cleaved caspase-8 蛋白水平，從而改善慢性乙型肝炎引起的肝纖維化[17]。木犀草素的衍生物木犀草素-7-O-葡萄糖苷對HBsAg 的抑制率高達77.4%，可以減弱HBV誘導的細胞內(nèi)活性氧積累和線粒體損傷[18]。此外，龍柴方具有明顯的抗HBV 活性且抑制病毒復制，與其主要活性成分異鼠李素等有關(guān)[19]。臨床研究同樣發(fā)現(xiàn)五靈膠囊聯(lián)合替諾福韋酯治療慢性乙型肝炎有效率提高，肝纖維化指標改善，HBeAg 和HBVDNA 轉(zhuǎn)陰率明顯提高[20]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析發(fā)現(xiàn)五靈膠囊治療慢性乙型肝炎的主要活性成分為異鼠李素、山柰酚、槲皮素、黃芩苷、靈芝酸R、靈芝醇F、丹參酮ⅡA、異丹參酮Ⅱ、木犀草素和戈米辛R，核心靶點為ESR1、IL-1β、MMP-9、NFKBIA、NOS2、PPARG、TP53 和TNF。表明五靈膠囊活性成分可以抑制HBV 復制，參與增殖、氧化和炎癥功能發(fā)揮治療慢性乙型肝炎功效。

五靈膠囊可以通過改善炎癥因子、膠原和基質(zhì)金屬蛋白等緩解慢性乙型肝炎及肝纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，五靈膠囊可以明顯改善四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化，具體表現(xiàn)為血清炎癥因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 含量降低，而且肝臟組織中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）陽性率降低，膠原蛋白及NF-κB 表達下調(diào)[21]。五靈膠囊還能改善脂多糖誘導的大鼠原代枯否細胞中的炎癥因子MCP-1、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、NOS 水平，并能夠抑制NF-κB 通路蛋白（TNFRⅠ、NF-κBs 亞蛋白、IκKβ、IκB）以及ERK通路的活化[22-23]。此外，五靈膠囊具有降解基質(zhì)金屬蛋白（MMP-3、MMP-9、MMP-13）及其抑制因子（TIMPs）發(fā)揮緩解大鼠慢性肝損傷和抗肝纖維化的功效[24]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)五靈膠囊治療慢性乙型肝炎與炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF、NOS2、MMP-9、NFKBIA 等靶標的調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，五靈膠囊通過異鼠李素、山柰酚、槲皮素等活性成分調(diào)控ESR1、IL-1β、MMP-9 等核心靶點治療慢性乙型肝炎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突