陳偉紅，錢大益，馮 丹，2

（1.伊犁師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 伊犁哈薩克自治州 835000；2.伊犁師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院污染物化學(xué)與環(huán)境治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 伊犁哈薩克自治州 835000）

近些年來，因世界范圍內(nèi)的環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，水質(zhì)環(huán)境也遭到了很大破壞。中國(guó)環(huán)境問題也極為嚴(yán)峻，在工廠污水被排放到江河湖海的過程中，會(huì)使水體微生物群落發(fā)生很大變化，水體自然降解污染物的能力不斷削弱。為了進(jìn)一步提升環(huán)境保護(hù)效率，更好地滿足國(guó)家環(huán)境管理需求，通過開展水質(zhì)環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)，可根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果，掌握水質(zhì)環(huán)境中的微生物分布情況，并在此基礎(chǔ)上開展水體污染防治和水質(zhì)環(huán)境質(zhì)量評(píng)估。因此，研究微生物檢測(cè)技術(shù)在水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用與質(zhì)量控制措施，可有效提升水質(zhì)環(huán)境保護(hù)的有效性和科學(xué)性水平，保障水質(zhì)安全。

1 水體微生物及微生物檢測(cè)技術(shù)概述

1.1 水體微生物

迄今為止，微生物是人類發(fā)現(xiàn)最早且分布最為廣泛的生物類群，其主要特征是個(gè)體微小、種類較多，主要包括微生物、病毒及小型的原生生物等，在人們?nèi)粘Ｉ钪邪l(fā)揮著十分重要的作用。實(shí)際上，微生物主要是在演變過程中影響自然環(huán)境，同時(shí)再加上自身的進(jìn)化過程，進(jìn)而對(duì)地球化學(xué)循環(huán)過程、區(qū)域氣候演變、動(dòng)植物進(jìn)化等產(chǎn)生不同程度的影響。在自然界物質(zhì)循環(huán)以及能量流動(dòng)中均有微生物參與的身影，其發(fā)揮著積極作用，同樣的在水生生態(tài)系統(tǒng)中，微生物也是不可或缺的一部分，針對(duì)水體中難以分解的復(fù)雜有機(jī)物，可以借助于微生物的力量進(jìn)行降解處理，進(jìn)而凈化水質(zhì)和保護(hù)水生生態(tài)系統(tǒng)。

1.2 微生物檢測(cè)技術(shù)

顧名思義，微生物檢測(cè)技術(shù)就是通過研究微生物與水體中其他生物之間的反應(yīng)，反映水環(huán)境中的水質(zhì)情況[1]。該過程涉及到了環(huán)境分析學(xué)、物理檢測(cè)學(xué)和生物檢測(cè)學(xué)。對(duì)于微生物檢測(cè)技術(shù)來說，其可以對(duì)常規(guī)物理和化學(xué)反應(yīng)測(cè)試中的缺陷進(jìn)行有效彌補(bǔ)。在實(shí)際的應(yīng)用中，雖然微生物檢測(cè)技術(shù)不能對(duì)水污染的具體程度進(jìn)行量化表達(dá)，只能在化學(xué)檢測(cè)中起到輔助性作用，但是處理水污染的效果明顯，且在水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)中發(fā)揮著十分重要的作用[2]。

2 微生物檢測(cè)技術(shù)在水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

2.1 多管發(fā)酵法檢測(cè)技術(shù)

多管發(fā)酵法是大腸桿菌檢測(cè)的常見方法，主要是根據(jù)大腸桿菌可以發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的原理，在乳糖蛋白胨發(fā)酵的基礎(chǔ)上來判斷大腸桿菌數(shù)量，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性較高。這種檢測(cè)方法的主要流程為：①制備培養(yǎng)基和染色劑。其中培養(yǎng)基中的物質(zhì)是乳糖與蛋白胨組成的混合物，可培養(yǎng)大腸桿菌，發(fā)酵作用較好。選擇革蘭氏染色劑可有效識(shí)別大腸桿菌，方便對(duì)其進(jìn)行觀察。②做好乳糖蛋白胨滅菌工作。操作過程需選擇在無菌環(huán)境下，在混合水樣與乳糖蛋白胨后，為了形成良好的發(fā)酵條件，需將環(huán)境溫度控制在37 ℃。發(fā)酵中應(yīng)處理好產(chǎn)酸、產(chǎn)氣工作，并將其連接到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)皿中，根據(jù)顏色變化來判斷菌群數(shù)量。③做好復(fù)發(fā)酵使用工作，統(tǒng)計(jì)每升水樣的大腸桿菌。為了提升檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用多支發(fā)酵管，保證有充足的實(shí)驗(yàn)數(shù)量。④評(píng)估大腸桿菌數(shù)量，統(tǒng)計(jì)菌群數(shù)量。選擇多管發(fā)酵法檢測(cè)技術(shù)所需時(shí)間較長(zhǎng)，可增強(qiáng)大腸桿菌檢測(cè)精確度，使檢測(cè)效果得到保障。

2.2 濾膜法檢測(cè)技術(shù)

在選用濾膜法進(jìn)行檢測(cè)的過程中，過濾器需選用微孔薄膜替代，通過將細(xì)菌過濾到濾膜上，進(jìn)而達(dá)到檢測(cè)菌群，統(tǒng)計(jì)具體數(shù)量的目的。通常情況下，在檢測(cè)大腸桿菌時(shí)選用濾膜法的頻率較高，且檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性較高，可以對(duì)水質(zhì)環(huán)境中的細(xì)菌群數(shù)量進(jìn)行確定，還能有效統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)量。濾膜法檢測(cè)流程主要為：①對(duì)濾膜進(jìn)行滅菌處理，以消滅細(xì)菌。濾膜滅菌的方法是在純水中煮沸15 min 左右，以達(dá)到初步濾除細(xì)菌的目的，然后選擇酒精燈來火焰滅菌，以進(jìn)行二次殺菌。②選擇濾膜過濾水樣，在負(fù)壓0.5 MPa 下選擇過濾器進(jìn)行過濾，確保濾膜表面附著有菌群，以有效統(tǒng)計(jì)菌群數(shù)量。③在培養(yǎng)基上貼濾膜，避免兩者之間有氣泡出現(xiàn)，否則會(huì)降低整個(gè)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。以大腸桿菌為例，應(yīng)保證培養(yǎng)溫度在37 ℃左右，時(shí)間維持在24 h。④做好菌落著色和鏡檢工作。結(jié)合染色深度可判斷菌群密度，選擇鏡檢方式來統(tǒng)計(jì)菌群，并對(duì)濾膜上的菌落總數(shù)進(jìn)行確定。濾膜法在雜質(zhì)含量較少水源的檢測(cè)中應(yīng)用得較為廣泛，檢測(cè)流程方便快捷，可快速檢測(cè)水質(zhì)環(huán)境，進(jìn)而有效統(tǒng)計(jì)菌群數(shù)量。

2.3 PCR 檢測(cè)技術(shù)

PCR 檢測(cè)技術(shù)主要是檢測(cè)特定微生物，進(jìn)而判斷微生物種類。這種檢測(cè)方法的特點(diǎn)主要有3 點(diǎn)：①特異性強(qiáng)。可在模板DNA 的基礎(chǔ)上有效識(shí)別微生物，可定性判斷微生物種類，準(zhǔn)確性較高。②靈敏度高。最小檢測(cè)率可達(dá)到3 個(gè)細(xì)胞，在少量細(xì)胞檢測(cè)中使用頻率較高，可對(duì)目標(biāo)進(jìn)行有效識(shí)別，進(jìn)而有效檢驗(yàn)微生物[3]。③便捷性好。檢測(cè)操作流程簡(jiǎn)單，可快速檢測(cè)。

由于檢測(cè)中選用了DNA 聚合酶，可以降低同位素的使用，對(duì)環(huán)境影響程度隨之下降。PCR 檢測(cè)原理主要選用了聚合酶鏈反應(yīng)，可有效識(shí)別指定DNA 片段，在檢測(cè)中應(yīng)避免PCR 產(chǎn)物出現(xiàn)熱變性，否則會(huì)影響整個(gè)酶的活性，進(jìn)而降低整個(gè)DNA 片段的識(shí)別能力。選擇PCR 檢測(cè)技術(shù)所需時(shí)間短，只需要數(shù)個(gè)小時(shí)就能完成。PCR 檢測(cè)技術(shù)是有效識(shí)別微生物的方法，可準(zhǔn)確識(shí)別大腸桿菌、沙門氏菌等，靈敏度較高。在選擇PCR檢測(cè)技術(shù)時(shí)，應(yīng)將DNA 作為模板，以有效檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)微生物，根據(jù)兩者的匹配情況來識(shí)別DNA，檢測(cè)結(jié)果較為可靠，在微生物檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)較為明顯[4]。

2.4 平皿計(jì)數(shù)法檢測(cè)技術(shù)

平皿計(jì)數(shù)法可以有效統(tǒng)計(jì)微生物數(shù)量，在檢驗(yàn)的過程中需要在菌群自身生理特征的基礎(chǔ)上進(jìn)行，可有效提升檢測(cè)精度。平皿檢測(cè)法操作過程簡(jiǎn)單、方便，在對(duì)微生物數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)最為常見，且檢測(cè)結(jié)果具有較強(qiáng)的可靠性水平。該檢測(cè)方法為：①選擇10 倍稀釋方式來達(dá)到稀釋菌落的目的，將稀釋液劃分成若干等分，并將其在相同培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。在實(shí)際培養(yǎng)中需控制好環(huán)境溫度，保證溫度條件良好，以增強(qiáng)培養(yǎng)菌群效果。②統(tǒng)計(jì)平皿中菌群數(shù)量，并對(duì)菌落情況進(jìn)行檢驗(yàn)，以提升菌群統(tǒng)計(jì)效果，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)平皿計(jì)數(shù)。③評(píng)估最終檢測(cè)結(jié)果。為了提升最終檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性水平，需嚴(yán)格對(duì)比各個(gè)平皿中的檢測(cè)結(jié)果。需要注意的是，應(yīng)在無菌條件下稀釋樣品，做好平皿的滅菌工作，保證稀釋條件良好。無菌操作需要達(dá)到完全滅菌，并做好鑷子、剪刀等實(shí)用器械的消毒工作。應(yīng)選擇具有代表性的采樣，否則很難反映水質(zhì)環(huán)境中的微生物情況。生理鹽水作為主要的稀釋液，在避免細(xì)菌表面遭受損壞的同時(shí)，還能防止檢測(cè)中的細(xì)胞損傷，進(jìn)而起到稀釋的作用。

3 微生物檢測(cè)在水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)中質(zhì)量控制措施

3.1 樣品采集質(zhì)量控制

該階段質(zhì)量控制主要表現(xiàn)在：①在水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)微生物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，應(yīng)備齊采集微生物樣品的無菌采樣玻璃容器。隨著時(shí)間和空間的變化，許多水體也會(huì)發(fā)生改變，應(yīng)使用科學(xué)有效的方法對(duì)采樣規(guī)劃進(jìn)行制定。為了提升水樣采集的代表性，采樣的過程中應(yīng)選擇固定取水點(diǎn)。②在對(duì)湖庫(kù)、河流等地表水樣品進(jìn)行采集的過程中，可以用手緊握瓶子下部，向水中插入帶塞采樣瓶，采樣瓶的位置距離水面10～15 cm 處最為適宜，保證瓶口與水流方向保持一致，將瓶塞拔掉，確保瓶?jī)?nèi)有樣品灌入后迅速將瓶塞蓋上，之后則從水中取出采樣瓶[5]。③若選擇龍頭裝置對(duì)樣品進(jìn)行采集，在采集樣品之前，需要將龍頭擰到最大位置處，在放水時(shí)間達(dá)到3～5 min 時(shí)，及時(shí)關(guān)閉龍頭，選擇70%～75%體積分?jǐn)?shù)的酒精擦拭或者將火焰燃燒3 min 以達(dá)到對(duì)龍頭消毒的目的，隨后開足龍頭，放水1 min 后，將水管內(nèi)的滯留雜質(zhì)徹底清除。在采樣的過程中，需對(duì)水流速度進(jìn)行有效控制，并小心接入到瓶中。④在對(duì)地表水、廢水及一定深度的樣品進(jìn)行采集的過程中，可優(yōu)先選用能進(jìn)行滅菌操作的專用采樣裝置。應(yīng)保證水量是瓶?jī)?nèi)容量的80%，方便檢驗(yàn)中可以將其充分混合均勻；采樣時(shí)可以直接進(jìn)行采樣，針對(duì)已經(jīng)滅菌后的采樣瓶，禁止直接選擇水樣進(jìn)行刷洗，禁止手指和其他物品直接與瓶口進(jìn)行接觸，防止瓶口被污染，采樣時(shí)禁止對(duì)水底沉積物進(jìn)行攪拌，在對(duì)管網(wǎng)水樣品進(jìn)行采集之前，需要將龍頭表面利用火焰灼燒3～5 s，之后將其放水5～10 min，以對(duì)水龍頭進(jìn)行消毒。水樣保存的主要作用是減緩微生物繁殖速率，此時(shí)可以通過低溫冷藏的方式對(duì)水樣進(jìn)行保存，在將全部水樣采集后，應(yīng)在2 h 內(nèi)全部送回實(shí)驗(yàn)室。在運(yùn)輸過程中，應(yīng)對(duì)玻璃容器進(jìn)行固定，防止樣品容器傾倒而造成樣品溢出。

3.2 樣品實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量控制

樣品實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量控制主要包含實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制和培養(yǎng)基質(zhì)量控制2 個(gè)方面。前者應(yīng)保證實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)條件良好，防止灰塵、溫度對(duì)其的影響，可以優(yōu)先選用集中式空調(diào)。在減少雜菌污染的同時(shí)，還能使培養(yǎng)箱持續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行，減少培養(yǎng)基、天平受潮等問題。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的壁墻和地面均要選用指定材料，確保其可以防滲水、表面光滑，方便清潔和消毒工作。工作臺(tái)表面應(yīng)具有防透水、抗腐蝕、光滑無縫等性能，還要保證工作臺(tái)高度適宜和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣清潔。可以選用沉降菌或浮游菌、懸浮粒子數(shù)或細(xì)菌總數(shù)（涂抹法）對(duì)空氣和臺(tái)桌面的清潔度進(jìn)行檢測(cè)[6]。在每次的培養(yǎng)基配制完成后，應(yīng)將培養(yǎng)基名稱、pH 值、配制日期、配制人、配制數(shù)量、滅菌溫度、培養(yǎng)基中是否存在不穩(wěn)定性物質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)記錄。

3.3 生物樣品檢測(cè)及其結(jié)果評(píng)價(jià)質(zhì)量控制

微生物樣品檢測(cè)質(zhì)量控制。在接種工作未開始前，為了確保水中的細(xì)菌可以均勻分布，應(yīng)充分搖勻水樣。在稀釋水樣時(shí)，應(yīng)沿著管壁將水樣小心加進(jìn)去，防止與管內(nèi)稀釋液直接接觸，避免吸管尖外側(cè)部分粘附到檢驗(yàn)液中。水樣稀釋完成后，需要將水樣注入到已經(jīng)滅菌后的培養(yǎng)皿中，可將水樣從皿側(cè)中添加進(jìn)去，禁止將培養(yǎng)皿蓋全部揭開，最后則將吸管直接立起確保樣品流空。為了排出剩余的液體，應(yīng)在皿底干燥部位將吸管尖擦拭一下，禁止直接吹出。為了避免片狀菌落產(chǎn)生，在向平皿加入水樣后，需要將適宜溫度下的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾倒入培養(yǎng)皿中，并及時(shí)混合均勻，30 min 后培養(yǎng)基將會(huì)完全凝固，之后則對(duì)平皿進(jìn)行翻轉(zhuǎn)、倒置進(jìn)行培養(yǎng)。

微生物樣品檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)質(zhì)量控制。微生物樣品檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)質(zhì)量控制內(nèi)容包括：①度量操作方法精密度。從某特種型式的水樣中，將最先15 個(gè)陽性水樣挑選出來，并進(jìn)行雙樣分析。針對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)進(jìn)行分析，若是任意一雙樣結(jié)果中有一者為零的情況，將其加上1 后將對(duì)數(shù)值計(jì)算出來。之后取出例行水樣中的10%開展雙樣分析。如果計(jì)算差較大，說明化驗(yàn)精密度下降，此時(shí)需要將之前精密度檢查后的分析結(jié)果否定，找出原因后繼續(xù)分析。②無菌性檢查。在每次實(shí)驗(yàn)開展的過程中，均需要選用滅菌水作為水樣，并分別對(duì)培養(yǎng)基、濾膜、稀釋水、沖洗用水、玻璃器皿和器具無菌性情況進(jìn)行檢查，若是侵染了雜菌，需要否定選擇該材料開展實(shí)驗(yàn)獲取的數(shù)據(jù)。每次實(shí)驗(yàn)中需至少對(duì)一個(gè)水樣開展重復(fù)性分析，原則上針對(duì)10%水樣的多人操作實(shí)驗(yàn)室，需要將重復(fù)分析工作做好，也就是對(duì)至少一個(gè)陽性水樣開展平行分析。

4 結(jié)論

綜上所述，微生物檢測(cè)具有專業(yè)性和復(fù)雜性特征，將其應(yīng)用到水質(zhì)環(huán)境檢測(cè)中，可有效助力對(duì)水污染的治理。因此，需對(duì)水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)全過程加強(qiáng)質(zhì)量控制，防止某一環(huán)節(jié)出錯(cuò)從而影響最終檢測(cè)結(jié)果。為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，需對(duì)微生物監(jiān)測(cè)步驟進(jìn)行規(guī)范，提升監(jiān)測(cè)人員綜合素質(zhì)，并加大監(jiān)督力度，確保實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)條件與監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)相符，確保實(shí)驗(yàn)分析工作可以順利開展。