周灝溦,陸振華,付婷,賀真,孔祥宇,李怡君,張維璐,邵中軍*

(1包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū) 包頭014040;2空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍隊(duì)防疫與流行病學(xué)教研室,特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安710032)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。CHB感染者的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase,ALT)突然升高至正常值上限的10倍以上被稱(chēng)為“慢性乙型肝炎急性發(fā)作”。CHB急性發(fā)作是乙型肝炎肝病進(jìn)展的重要原因之一。有研究顯示,14%的失代償期肝硬化是由CHB急性發(fā)作導(dǎo)致的。

從早期胚胎學(xué)開(kāi)始,肝臟和腸道就有聯(lián)系,在生命早期肝臟作為前腸的一個(gè)芽孢開(kāi)始發(fā)育[2]。研究表明,腸-肝軸在肝病的病因中起著關(guān)鍵作用,當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí),過(guò)量的毒素會(huì)通過(guò)腸道血液轉(zhuǎn)移到肝臟,若超過(guò)肝臟正常的解毒和代謝能力,則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)過(guò)度激活,造成免疫反應(yīng)異常、肝細(xì)胞凋亡和壞死以及器官功能的其他改變,從而導(dǎo)致或加劇慢性肝臟疾病。另一方面,肝臟疾病造成的肝臟損傷也會(huì)導(dǎo)致膽汁酸產(chǎn)量降低,腸道pH值升高,進(jìn)而改變腸道定植微生物的內(nèi)部環(huán)境,造成腸道菌群失調(diào)[3]。因此,本研究應(yīng)用16S核糖體核糖核酸(16S ribosomal ribonucleic acid,16S rRNA)擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)對(duì)CHB急性發(fā)作期患者腸道菌群進(jìn)行分析,探討腸道菌群對(duì)CHB急性發(fā)作患者的影響及其作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2021年4月至9月在空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染科入院治療的20例CHB急性發(fā)作患者的糞便樣本作為病例組(CHB組)。根據(jù)CHB組的年齡、性別和體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)進(jìn)行匹配,最終納入體檢科23例健康人群的糞便樣本作為對(duì)照組。CHB急性發(fā)作期的診斷標(biāo)準(zhǔn)為ALT突然升高至正常值上限的10倍以上[4]。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)過(guò)去1個(gè)月內(nèi)使用抗生素及益生菌;(2)其他HBV感染導(dǎo)致的肝臟疾病;(3)炎癥性腸病、糖尿病及高血壓等影響腸道內(nèi)環(huán)境的其他疾病。

1.2 觀(guān)察指標(biāo)

通過(guò)醫(yī)院病歷檢索系統(tǒng)和調(diào)查問(wèn)卷,收集受試者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)。包括姓名、性別及年齡等人口學(xué)信息;血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、ALT、總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin,DBIL)、間接膽紅素(indirect bilirubin,IBIL)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、總蛋白(total protein,TP)、血小板(platelet,PLT)和凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

1.3 糞便樣本采集、DNA提取及文庫(kù)構(gòu)建

收集受試者入院次日早上6∶30～8∶30自然排出的新鮮糞便標(biāo)本約3～5g于采集管中,采集后立即在-20℃的冰箱中凍存。低溫轉(zhuǎn)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室后,使用天根TIANamp Stool DNA Kit糞便DNA提取試劑盒提取糞便基因組DNA。

1.4 菌群多樣性分析

使用R軟件(4.1.2版本)“GUniFrac”包對(duì)ASVs表格進(jìn)行抽平處理,隨后用“vegan”包對(duì)抽平后的ASVs表格進(jìn)行菌群多樣性的計(jì)算。α多樣性指標(biāo)由Shannon、Simpson、Ace和Chao1指數(shù)進(jìn)行量化描述。使用R語(yǔ)言中“t.test”函數(shù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),分析2組人群在α多樣性上的差異,并用R語(yǔ)言中的“ggplot2”軟件包繪制2組人群之間的α多樣性箱線(xiàn)圖。使用R語(yǔ)言中的“ade4”包,基于加權(quán)UniFrac距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA),比較2組人群間的β多樣性差異,并采用置換多元方差分析對(duì)PCoA結(jié)果進(jìn)行差異分析。

1.5 菌群分類(lèi)組成分析

使用R語(yǔ)言中“ggplot2”軟件包對(duì)2組相對(duì)豐度前10位的菌門(mén)、相對(duì)豐度前15位的菌科及相對(duì)豐度前20位的菌屬進(jìn)行物種組成柱狀圖繪制。使用R語(yǔ)言中“t.test”函數(shù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),分析2組間門(mén)、科和屬水平中具有顯著差異的關(guān)鍵菌群,并繪制差異性箱線(xiàn)圖。

1.6 菌群功能預(yù)測(cè)分析

使用PICRUST2軟件對(duì)菌群代謝通路進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,并使用京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路的注釋。同時(shí)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)2組間所預(yù)測(cè)到的代謝通路進(jìn)行比較,并用R語(yǔ)言中的“ggplot2”軟件包繪制差異代謝通路柱狀圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 2組人群基線(xiàn)資料比較

CHB急性發(fā)作期患者AFP、ALT、AST、GGT、TBIL、DBIL、IBIL及PT均較對(duì)照組顯著升高,TP及PLT均較對(duì)照組顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;表1)。

表1 2組受試者基線(xiàn)資料比較

2.2 CHB急性發(fā)作期患者腸道菌群多樣性分析

Shannon(圖1A)和Simpson(圖1B)指數(shù)用于描述菌群的多樣性,Ace(圖1C)和Chao1(圖1D)指數(shù)用于描述菌群的豐富度。結(jié)果顯示CHB急性發(fā)作期患者腸道菌群多樣性和豐富度均顯著低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。

圖1 2組腸道菌群α多樣性分析

應(yīng)用基于加權(quán)UniFrac距離的PCoA法,對(duì)菌群的β多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明CHB急性發(fā)作期患者和對(duì)照組人群的細(xì)菌群落各自聚類(lèi)(F=4.931,P=0.001;圖2)。2組樣本間的菌群結(jié)構(gòu)相似度較低,CHB急性發(fā)作期患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖2 2組腸道菌群β多樣性PCoA圖

2.3 CHB急性發(fā)作期患者腸道菌群分類(lèi)組成分析

2組患者腸道菌群在門(mén)、科和屬水平上的物種組成詳見(jiàn)圖3。擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)是2組中檢測(cè)到的3種主要菌群,占總體的90.86%(圖3A)。

圖3 2組菌群物種組成柱狀圖

在門(mén)水平上,CHB急性發(fā)作期患者菌群中厚壁菌門(mén)(Firmicutes)的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組,放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖4A)。在科水平上,CHB急性發(fā)作期患者菌群中紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、月形單細(xì)胞菌科(Selenomonadaceae)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceaede)的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組,鏈球菌科(Streptococcaceae)的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖4B)。在屬水平上,CHB急性發(fā)作期患者菌群中另枝菌屬(Alistipes)、類(lèi)桿菌屬(Bacteroides)、布勞特氏菌屬(Blautia)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、小桿菌屬(Dialister)、棲糞桿菌屬(Faecalibacterium)、芽殖菌屬(Gemmiger)、絲狀菌屬(Kineothrix)、巨單胞菌屬(Megamonas)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)11個(gè)菌屬的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組,普雷沃氏菌屬(Prevotella)和韋榮氏球菌屬(Veillonella)的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖4C)。

圖4 2組腸道菌群差異分析

2.4 CHB急性發(fā)作期患者腸道菌群的功能預(yù)測(cè)分析

使用PICRUST2軟件對(duì)樣本的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路的功能注釋分析,結(jié)果顯示CHB急性發(fā)作期患者與聚糖生物合成和代謝以及脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因較對(duì)照組更豐富(P<0.001;圖5)。

圖5 2組腸道菌群功能差異分析

3 討 論

HBV感染在世界范圍內(nèi)流行,據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,全球約有2.57億慢性HBV感染者,約有88.7萬(wàn)人死于HBV感染的相關(guān)性肝臟疾病[5]。CHB急性發(fā)作是CHB的一種特殊類(lèi)型,因其發(fā)病急的特點(diǎn),少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)急性肝功能衰竭,危及生命[6]。肝臟和腸道之間的聯(lián)系是密不可分的,二者通過(guò)“腸-肝軸”相互作用[7]。已有研究表明,慢性HBV感染的相關(guān)性疾病與腸道微生物群的失調(diào)密切相關(guān)[8]。然而,腸道微生物群與CHB急性發(fā)作的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)CHB急性發(fā)作期患者和健康對(duì)照人群腸道菌群的V3～V4區(qū)進(jìn)行分析,對(duì)比2組人群腸道微生物群多樣性及菌群組成的差異,探討CHB急性發(fā)作期患者腸道菌群的變化規(guī)律。

本研究發(fā)現(xiàn),CHB急性發(fā)作期患者和健康對(duì)照者腸道菌群多樣性存在顯著差異。α多樣性研究結(jié)果顯示,CHB急性發(fā)作期患者的菌群多樣性與豐富度均顯著低于對(duì)照組。此外,β多樣性分析結(jié)果也表明,CHB急性發(fā)作期患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)組成與健康對(duì)照人群明顯不同。提示CHB急性發(fā)作期患者的腸道微生態(tài)發(fā)生紊亂、菌群多樣性降低、腸道穩(wěn)定性被破壞,腸道微生物群的改變或在CHB急性發(fā)作中起潛在的致病作用。

本研究發(fā)現(xiàn)CHB急性發(fā)作期患者的腸道菌群在門(mén)、科和屬水平的組成上均與健康人群存在顯著差異。2組間腸道菌群差異分析結(jié)果顯示 ,CHB急性發(fā)作期患者另枝菌屬(Alistipes)及梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組。另枝菌屬(Alistipes)已被證明可預(yù)防肝纖維化、癌癥和心血管疾病等[9]。梭狀芽孢桿菌(Clostridium)屬于腸道菌群中的有益菌,可產(chǎn)生短鏈脂肪酸,如丙酸、乙酸和丁酸[10]。而短鏈脂肪酸在人類(lèi)健康中具有多種功能,可作為腸道細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和能量成分的特定來(lái)源,改善上皮屏障功能,降低炎癥水平[11]。丁酸鹽是腸上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源,被認(rèn)為是宿主細(xì)胞基因表達(dá)、炎癥、分化和死亡的重要調(diào)節(jié)劑,也是細(xì)菌能量代謝和腸道健康的關(guān)鍵參與者[12]。因此,產(chǎn)丁酸細(xì)菌的減少可能會(huì)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的破壞,從而導(dǎo)致肝病的發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,CHB急性發(fā)作期患者菌群內(nèi)產(chǎn)脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的普雷沃氏菌屬(Prevotella)的相對(duì)豐度增加。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種組成成分,也是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分,LPS增加會(huì)引發(fā)各種病理反應(yīng)。高濃度的LPS會(huì)破壞腸黏膜功能,誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)[13]。如上所述,在CHB急性發(fā)作期患者中腸黏膜保護(hù)細(xì)菌的減少和破環(huán)細(xì)菌的增加,會(huì)加重乙型肝炎的發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn),CHB急性發(fā)作期患者與聚糖生物合成和代謝以及脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因較對(duì)照組更豐富。研究表明,聚糖和脂質(zhì)代謝是肝臟的主要功能,肝臟通過(guò)合成糖原和分解糖異生作用來(lái)維持血糖濃度的恒定[14]。同時(shí),肝臟也是氧化分解脂肪酸、脂肪和磷脂等脂類(lèi)物質(zhì)的重要場(chǎng)所[15]。CHB急性發(fā)作期患者的肝組織損傷會(huì)導(dǎo)致糖類(lèi)和脂類(lèi)合成與代謝活動(dòng)更加頻繁,引起糖脂代謝紊亂誘發(fā)的糖尿病及心血管疾病等。

本研究通過(guò)分析CHB急性發(fā)作期患者的腸道菌群特征,發(fā)現(xiàn)其腸道菌群多樣性及豐富度均顯著低于健康對(duì)照者,腸道內(nèi)有益菌的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組,而致病菌的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組。這為臨床預(yù)防CHB急性發(fā)作提供了線(xiàn)索,也為研究CHB患者的預(yù)后提供了方向。同時(shí),本研究提供的CHB相關(guān)疾病的腸道菌群譜,對(duì)于全面理解CHB相關(guān)性疾病進(jìn)程有重要意義。本研究存在以下局限性:研究設(shè)計(jì)無(wú)法評(píng)估腸道微生物群和CHB急性發(fā)作之間因果關(guān)系,后期我們將考慮使用動(dòng)物模型來(lái)確定二者之間的因果關(guān)系。