喬志偉　劉超　王紅

摘要：為提高黔中黃壤區(qū)農(nóng)田土壤磷素的有效性，以從該地區(qū)篩選的1株具有溶磷能力的硝基還原假單胞菌（QHR-9）為試驗(yàn)菌株，通過(guò)室內(nèi)搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)研究菌株的溶磷特性。設(shè)置對(duì)照、QHR-9、QHR-9+葡萄糖、QHR-9+組合糖類等4個(gè)處理，通過(guò)室外土壤培養(yǎng)試驗(yàn)研究菌株在土壤中的作用及對(duì)碳循環(huán)相關(guān)基因的影響。室內(nèi)搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)第7 d，QHR-9對(duì)磷酸三鈣、磷酸鋁、磷礦粉的溶解能力分別為645.82 mg/L、269.17 mg/L、272.45 mg/L; QHR-9在10種不同碳源條件下溶磷能力為28.06～645.82 mg/L，在10種組合碳源條件下的溶磷能力為92.31 mg/L。室外土壤培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，QHR-9可以顯著增加土壤有效磷含量、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性、硝基還原假單胞菌豐度等，QHR-9+葡萄糖與QHR-9+組合糖類處理上述4項(xiàng)指標(biāo)均高于QHR-9處理；土壤pH以QHR-9+葡萄糖處理最低，與QHR-9、QHR-9+組合糖類處理差異不顯著；QHR-9處理微生物碳循環(huán)糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）和輔助活性酶（AA）基因相對(duì)豐度與對(duì)照相比降低，糖苷水解酶（GH）基因相對(duì)豐度增加，QHR-9+葡萄糖和QHR-9+組合糖類處理加劇了這一變化趨勢(shì)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，土壤有效磷含量、pH、酸性（堿性）磷酸酶活性與微生物碳循環(huán)相關(guān)基因相對(duì)豐度均有顯著或極顯著相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：硝基還原假單胞菌;溶磷特性；不同碳源；碳循環(huán)基因

中圖分類號(hào)：S154.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2023）05-1151-08

Phosphorus solubilizing characteristics of a Pseudomonas nitroreducens strain and its effect on carbon cycling related genesQIAO Zhi-wei1，2，3，LIU Chao2，WANG Hong2

（1.College of Agriculture， Anshun University， Anshun 561000， China；2.College of Resources and Environmental Engineering， Anshun University， Anshun 561000， China；3.Rural Revitalization Research Center of Guizhou Universities， Anshun 561000， China）

Abstract：To improve soil phosphorus availability in yellow soil area farmland of central Guizhou， a Pseudomonas nitroreducens strain （QHR-9） with phosphorus-solubilizing ability was selected from this area as the test strain. The phosphorus solubilization characteristics of the strain were studied by laboratory shaking flask culture test. Outdoor soil culture experiments were conducted to study the effect of the strain in soil and its effect on carbon cycling related genes， based on four treatments which contained CK， QHR-9， QHR-9+glucose and QHR-9+combined carbohydrate. Results of laboratory shaking flask culture test showed that， the dissolution capacity of QHR-9 to tricalcium phosphate， aluminum phosphate and ground phosphorite were 645.82 mg/L， 269.17 mg/L and 272.45 mg/L respectively on the 7th day of culturing. The phosphorus solubilizing capacity of QHR-9 was 28.06-645.82 mg/L under ten carbon sources conditions， the phosphorus solubilizing capacity under the combined ten carbon source condition was 92.31 mg/L. Results of outdoor soil culture experiments showed that， QHR-9 could significantly increase soil available phosphorus content， acid phosphatase activity， alkaline phosphatase activity and relative abundance of Pseudomonas nitroreducens strain， etc. Under QHR-9+glucose treatment and QHR-9+combined carbohydrate treatment， the above four indexes were significantly higher than those under QHR-9 treatment. Under QHR-9+glucose treatment， the pH was the lowest， and there was no significant difference between QHR-9 or QHR-9+ combined carbohydrate treatment. Compared with CK， the relative abundance of glycosyltransferases （GT） and auxiliary actives （AA） genes of microbial carbon cycle under QHR-9 treatment decreased， while the relative abundance of glycoside hydrolases （GH） genes increased， the variation trend was exacerbated by QHR-9+glucose treatment and QHR-9+ combined carbohydrate treatment. Correlation analysis showed that， soil available phosphorus content， pH， acid phosphatase or alkaline phosphatase activity were significantly or extremely significantly correlated with relative abundance of microbial carbon cycling related genes.

Key words：Pseudomonas nitroreducens strain;phosphorus solubility;different carbon sources;carbon cycle gene

磷在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用[1]，磷素的豐缺影響生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性[2]。磷素易在土壤中累積，這是其利用率較低的重要原因。溶磷細(xì)菌可以改善土壤磷素的有效性，因此成為土壤磷素利用研究的熱點(diǎn)方向。通過(guò)溶磷細(xì)菌的作用，對(duì)化學(xué)磷肥減量增效和增加作物產(chǎn)量等都有積極的效果[3-5]。不同碳源條件下，微生物溶磷能力差異較大[6-7]，研究溶磷細(xì)菌在不同碳源條件下的溶磷特性是其應(yīng)用的前提之一。土壤溶磷細(xì)菌種類多樣，芽孢桿菌、假單胞菌等屬中許多種類的微生物都具有溶磷能力，但是關(guān)于硝基還原假單胞菌作為溶磷細(xì)菌的研究未見(jiàn)報(bào)道。

碳是微生物有機(jī)體的能源物質(zhì)，也是重要的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，微生物介導(dǎo)的碳循環(huán)是地球物質(zhì)循環(huán)的重要組成部分，其微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)制和關(guān)鍵功能基因是重要研究?jī)?nèi)容[8]。外源磷添加可以通過(guò)改變木質(zhì)素的分解和微生物殘?bào)w的分解[2]、土壤呼吸[9]、團(tuán)聚體的穩(wěn)定性[10]等影響碳循環(huán)進(jìn)程。土壤微生物碳循環(huán)相關(guān)基因豐度與碳合成、分解等有密切關(guān)系[11]，宏基因組學(xué)及碳水化合物活性酶（CAZY）數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善為全面研究微生物碳循環(huán)相關(guān)基因提供了前提條件。溶磷細(xì)菌施用增加了土壤有效磷含量，由溶磷微生物作用導(dǎo)致的土壤有效磷含量增加對(duì)碳循環(huán)相關(guān)基因的影響，需要進(jìn)一步分析，且通過(guò)宏基因組學(xué)探討溶磷細(xì)菌對(duì)微生物碳循環(huán)相關(guān)基因的影響鮮有研究。

本研究試驗(yàn)菌株為具有溶磷特性的硝基還原假單胞菌，通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，研究其在不同碳源條件下的溶磷能力；通過(guò)土壤培養(yǎng)試驗(yàn)，設(shè)置空白、溶磷細(xì)菌、溶磷細(xì)菌+葡萄糖、溶磷細(xì)菌+組合糖類等4個(gè)處理，測(cè)定土壤養(yǎng)分含量、磷酸酶活性、硝基還原假單胞菌豐度、碳循環(huán)相關(guān)基因豐度等指標(biāo)，并分析不同指標(biāo)之間的相關(guān)性，以期為溶磷細(xì)菌的應(yīng)用和探究溶磷細(xì)菌對(duì)土壤微生物碳循環(huán)的影響提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株為硝基還原假單胞菌QHR-9，來(lái)源于安順學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)鑒定為硝基還原假單胞菌，從貴州省安順市農(nóng)田土壤中分離出來(lái)，具有較強(qiáng)的溶磷能力。菌株16S rDNA 序列分析采用引物 7f （5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′） 、1540r （5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′） 建立擴(kuò)增反應(yīng)體系并測(cè)序[12]，將獲得的 DNA 序列輸入 GenBank，用BLAST 程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)MEGA 7.0軟件和 Neighbor-Joining 方法[13]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.2菌株溶磷特性測(cè)定

1.2.1菌株活化培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g ，水1.0 L，調(diào)節(jié)pH 6.5～7.5。

1.2.2溶磷能力測(cè)定培養(yǎng)基（NBRIP）[14]葡萄糖10.0 g，磷酸三鈣5.0 g，氯化鎂5.0 g，硫酸鎂0.25 g，硫酸銨0.1 g，氯化鉀0.2 g；磷酸三鈣（或磷酸鋁、磷礦粉）5.0 g，水1.0 L，調(diào)節(jié)pH6.5～7.5。

1.2.3菌株的活化將保存于4 ℃冰箱中的菌株取出，接種在滅菌冷卻后的活化培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.4菌株對(duì)磷酸三鈣、磷酸鋁、磷礦粉的溶解能力將配制好的NBRIP培養(yǎng)液分裝在250 ml三角瓶中，每瓶裝培養(yǎng)液100 ml，滅菌后冷卻，將1 ml活化好的菌液接種于冷卻后的NBRIP培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，無(wú)菌操作下分別在第1 d、第3 d、第5 d、第7 d取培養(yǎng)液5 ml，離心后取上清液測(cè)定其有效磷含量，并設(shè)置空白對(duì)照。根據(jù)接種菌株培養(yǎng)液有效磷含量和空白培養(yǎng)液有效磷含量的差值計(jì)算菌株對(duì)難溶態(tài)磷酸鹽（磷酸三鈣、磷酸鋁、磷礦粉）的溶解能力，每個(gè)處理（包括空白對(duì)照）設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5不同碳源條件下菌株溶磷能力在NBRIP液體培養(yǎng)基中，難溶態(tài)磷為磷酸三鈣。分別以鼠李糖、淀粉、蔗糖、乳糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、纖維二糖、葡聚糖等糖類等質(zhì)量替換葡萄糖，接菌（菌液與培養(yǎng)液體積比為1∶100）振蕩培養(yǎng)7 d，并設(shè)置空白對(duì)照，測(cè)定培養(yǎng)液有效磷含量，分析不同碳源條件下菌株的溶磷能力。

在NBRIP培養(yǎng)基中，以葡萄糖、鼠李糖、淀粉、蔗糖、乳糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、纖維二糖、葡聚糖等10種糖類物質(zhì)組合作為碳源，各糖類質(zhì)量比為1∶1，組合碳源含量為10 g/L，接菌（菌液與培養(yǎng)液體積比為1∶100）振蕩培養(yǎng)7 d，并設(shè)置空白對(duì)照，測(cè)定培養(yǎng)液有效磷含量，分析組合碳源條件下菌株的溶磷能力。

1.3外加碳源條件下菌株土壤培養(yǎng)試驗(yàn)

1.3.1試驗(yàn)土壤試驗(yàn)土壤采集于貴州省安順市西秀區(qū)的農(nóng)田，風(fēng)干后過(guò)篩備用。土壤養(yǎng)分基本性質(zhì)如下：pH 4.23， 堿解氮含量137.12 mg/kg，有效磷含量79.65 mg/kg，速效鉀含量318.10 mg/kg，全氮含量2.45 g/kg，全磷含量 0.91 g/kg，全鉀含量28.02 g/kg，有機(jī)質(zhì)含量39.03 g/kg。

1.3.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)將采集的土樣風(fēng)干，過(guò)篩后裝盆，每盆裝土1.5 kg，共設(shè)置4個(gè)處理，分別為對(duì)照（CK）、QHR-9、QHR-9+葡萄糖（QHR-9P）、QHR-9+組合糖類（QHR-9C），每個(gè)處理重復(fù)3次。其中QHR-9菌液接種量為1%（菌液與土壤體積質(zhì)量比），組合糖類為葡萄糖、淀粉、乳糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、鼠李糖、葡聚糖等10種糖類按照質(zhì)量等比配制而成，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

將上述物質(zhì)加入塑料盆后與土壤充分混勻，放置在室外，培養(yǎng)時(shí)間為60 d，定期管理。培養(yǎng)結(jié)束后，采集表層新鮮土樣50 g左右，除去雜草等雜質(zhì)后裝于塑封袋中，樣品采集完成后放在干冰箱中寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司，進(jìn)行土壤宏基因組測(cè)序；剩余的土樣風(fēng)干后過(guò)篩，進(jìn)行土壤養(yǎng)分和磷酸酶活性的測(cè)定。

1.3.3土壤養(yǎng)分和磷酸酶活性測(cè)定土壤有效磷含量采用0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液浸提后，使用鉬銻抗比色法測(cè)定[15]；pH通過(guò)pH計(jì)直接測(cè)定（水土質(zhì)量比為1∶1）[15]；土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法 [15]測(cè)定；土壤酸性或堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法[16]測(cè)定。

1.3.4土壤宏基因組測(cè)定

1.3.4.1土壤DNA提取和宏基因組測(cè)序稱取土樣0.5 g，使用E.Z.N.A Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)上的方法提取總?cè)郝浠蚪MDNA，使用Qubit 4.0測(cè)量DNA濃度。取500 ng DNA樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序，采用Illumina NovaSeq 6000高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。

1.3.4.2宏基因組序列分析方法測(cè)得的原始數(shù)據(jù)使用Trimmonmatic進(jìn)行過(guò)濾處理，默認(rèn)參數(shù)值為Q20，去除得分值低于Q20的質(zhì)量序列，得到Clean數(shù)據(jù)；使用基于De Bruijn graph原理的拼接軟件IDBA_UD對(duì)優(yōu)質(zhì)的reads進(jìn)行拼接組裝，獲得contigs；選擇100 bp以上的基因，翻譯出蛋白質(zhì)序列。將所有預(yù)測(cè)出來(lái)的基因序列，用CD-HIT軟件進(jìn)行聚類（設(shè)置參數(shù)為95% identify、90 coverage），構(gòu)建非冗余基因集[17]。

1.3.4.3物種豐度分析方法將基因與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTp同源性比對(duì)，得到物種相關(guān)信息及豐度信息。

1.3.4.4碳水化合物活性酶注釋分析方法通過(guò)HMMER3將翻譯出的蛋白質(zhì)序列與CAZY數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到其相應(yīng)的碳水化合物活性酶注釋，篩選條件Evalue<1×10-5，并統(tǒng)計(jì)CAZY各功能層級(jí)的豐度。

1.4數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016和SPSS 20.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1QHR-9同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

菌株QHR-9 的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 477 bp，對(duì)其進(jìn)行序列分析，結(jié)果（圖1）表明，QHR-9與硝基還原假單胞菌[Pseudomonas nitroreducens strain（NR 042435.1）]同源性最接近。

2.2QHR-9溶磷特性

2.2.1QHR-9對(duì)磷酸三鈣、磷酸鋁、磷礦粉等的溶解能力QHR-9對(duì)磷酸三鈣、磷酸鋁、磷礦粉等的溶解能力見(jiàn)表2。由表2可知，QHR-9對(duì)磷酸三鈣、磷酸鋁、磷礦粉的溶解能力在第1～5 d隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)，第7 d菌株溶磷能力趨于穩(wěn)定。QHR-9在第7 d對(duì)磷酸三鈣、磷酸鋁、磷礦粉的溶解能力分別為645.82 mg/L、269.17 mg/L、272.45 mg/L，說(shuō)明QHR-9菌株對(duì)各種難溶態(tài)磷酸鹽具有較強(qiáng)的溶解能力。

2.2.2不同碳源條件下QHR-9的溶磷特性由表3可知，在不同碳源條件下QHR-9溶磷能力差異較大，菌株以葡萄糖為碳源的溶磷能力顯著高于其他糖類，以乳糖為碳源時(shí)溶磷能力次之，為201.82 mg/L，以淀粉、甘露醇、蔗糖、木糖、麥芽糖、鼠李糖、葡聚糖、纖維二糖等為碳源，其溶磷能力均在100.00 mg/L以下，菌株對(duì)這些糖類的利用率較低。QHR-9在10種碳源條件下溶磷能力范圍在28.06～645.82 mg/L，最大變化幅度為617.76 mg/L。QHR-9在組合碳源條件下的溶磷能力為92.31 mg/L，比以葡萄糖為單獨(dú)碳源時(shí)的溶磷能力降低了85.71%。

2.3QHR-9土壤培養(yǎng)試驗(yàn)

2.3.1土壤養(yǎng)分含量由表4可知，QHR-9各處理土壤有效磷含量均顯著高于CK，QHR-9、QHR-9P、QHR-9C處理土壤有效磷含量分別比CK增加了9.74 mg/kg、20.81 mg/kg、17.16 mg/kg，施用QHR-9對(duì)土壤有效磷含量的增加效果顯著，QHR-9P、QHR-9C處理土壤有效磷含量顯著高于QHR-9。

各處理土壤pH值為4.11～4.20，QHR-9各處理土壤pH差異不顯著。QHR-9處理土壤有機(jī)質(zhì)含量為38.81 mg/kg，與對(duì)照差異不顯著，QHR-9P、QHR-9C處理土壤有機(jī)質(zhì)含量分別為40.59 mg/kg、40.89 mg/kg，顯著高于QHR-9，但2個(gè)處理之間差異不顯著。

2.3.2土壤磷酸酶活性由圖2可知，CK、QHR-9、QHR-9P、QHR-9C處理土壤酸性磷酸酶活性分別為2.24 mg/kg、2.67 mg/kg、3.31 mg/kg、3.71 mg/kg，QHR-9、QHR-9P、QHR-9C處理的土壤酸性磷酸酶活性分別比CK顯著增加了19.20%、47.77%、65.63%，溶磷細(xì)菌可以顯著增加土壤酸性磷酸酶的活性，QHR-9P、QHR-9C處理酸性磷酸酶活性分別比QHR-9處理顯著增加了23.97%、38.95%，溶磷細(xì)菌與葡萄糖或者組合糖類可以進(jìn)一步增加土壤酸性磷酸酶的活性；QHR-9C處理土壤酸性磷酸酶活性最高，比QHR-9P處理顯著增加了12.08%。各處理土壤堿性磷酸酶活性的變化趨勢(shì)與酸性磷酸酶一致。

2.3.3土壤硝基還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducens strain）豐度由圖3可知，培養(yǎng)60 d后QHR-9各處理土壤Pseudomonas nitroreducens strain的相對(duì)豐度顯著高于CK，QHR-9、QHR-9P、QHR-9C處理土壤Pseudomonas nitroreducens strain的相對(duì)豐度分別比CK顯著增加了36.56%、67.44%、82.90%，QHR-9在土壤中表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長(zhǎng)和繁殖能力；QHR-9P、QHR-9C處理土壤Pseudomonas nitroreducens strain的相對(duì)豐度分別比QHR-9顯著增加了22.61%、33.93%，添加葡萄糖或者組合糖類可以進(jìn)一步增強(qiáng)QHR-9在土壤中的生存能力。

2.3.4土壤微生物碳循環(huán)相關(guān)基因相對(duì)豐度GH（糖苷水解酶）參與土壤有機(jī)碳分解，GT（糖基轉(zhuǎn)移酶）參與土壤有機(jī)碳生物合成， AA（輔助活性酶）參與木質(zhì)素的微生物分解。由表5可知，QHR-9處理微生物碳循環(huán)基因相關(guān)GT基因相對(duì)豐度與對(duì)照相比顯著減少，GH基因相對(duì)豐度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，比對(duì)照顯著增加，溶磷細(xì)菌可以在一定程度上影響土壤微生物碳循環(huán)；QHR-9+葡萄糖和QHR-9+組合糖類處理微生物碳循環(huán)相關(guān)基因AA、GT豐度與QHR-9處理相比，均呈減少趨勢(shì)，GH基因相對(duì)豐度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，QHR-9與葡萄糖或者組合糖類共同施用，進(jìn)一步影響了土壤微生物碳循環(huán)相關(guān)基因的相對(duì)豐度；QHR-9+葡萄糖和QHR-9+組合糖類處理微生物碳循環(huán)各類基因豐度之間差異均不顯著。

2.3.5土壤微生物碳循環(huán)基因相對(duì)豐度與土壤養(yǎng)分含量、磷酸酶活性的相關(guān)性由表6可知，土壤有效磷含量、酸性磷酸酶活性、堿性磷酸酶活性與AA、GT基因相對(duì)豐度呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，與GH基因相對(duì)豐度呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)；pH與AA、GT基因相對(duì)豐度呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，與GH基因相對(duì)豐度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)；有機(jī)質(zhì)含量與GH基因相對(duì)豐度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，與AA、GT基因相對(duì)豐度相關(guān)性不顯著。

3討論與結(jié)論

3.1溶磷細(xì)菌溶磷能力及不同碳源對(duì)其影響

微生物對(duì)難溶態(tài)磷酸鹽的溶解能力是評(píng)價(jià)其溶磷能力大小的重要指標(biāo)[18-19]。溶磷能力為接菌培養(yǎng)后培養(yǎng)液有效磷含量與未接菌培養(yǎng)液有效磷含量的差值。李慧萍等[20]對(duì)祁連山云杉林土壤溶磷細(xì)菌的研究中篩選出5株對(duì)磷酸三鈣溶解能力為387.41～479.87 mg/L的菌株；朱芙蓉等[21]在滇重樓根際土壤分離出42株無(wú)機(jī)溶磷細(xì)菌，對(duì)磷酸三鈣溶磷能力為66.68～104.10 mg/L；劉萍等[22]的研究結(jié)果顯示，溶磷細(xì)菌RPB03在較高的溫度、鹽度和堿性條件下對(duì)磷酸三鈣溶磷能力均在300.00 mg/L以上；呂俊等[23]、劉春菊等[24]篩選的溶磷菌株對(duì)磷酸三鈣溶磷能力在200 mg/L以上。本試驗(yàn)中，在培養(yǎng)第7 d QHR-9對(duì)磷酸三鈣、磷酸鋁、磷礦粉的溶解能力分別為645.82 mg/L、269.17 mg/L、272.45 mg/L，對(duì)各種難溶態(tài)磷酸鹽都具有較強(qiáng)的溶解能力，可以作為黔中黃壤區(qū)農(nóng)田土壤溶磷細(xì)菌研究的菌株資源。

培養(yǎng)基碳源種類對(duì)溶磷微生物溶磷能力影響較大[8]。本試驗(yàn)中，QHR-9以葡萄糖為碳源時(shí)溶磷能力最強(qiáng)，在10種碳源條件下其溶磷能力為28.06～645.82 mg/L，最大變化幅度為617.76 mg/L。這是因?yàn)槿芰准?xì)菌對(duì)不同碳源的利用率不盡相同，在利用率高的碳源條件下溶磷能力強(qiáng)，在無(wú)法利用或者利用率較低的碳源條件下溶磷能力顯著降低。研究結(jié)果表明，不同碳源通過(guò)影響微生物產(chǎn)生有機(jī)酸的種類和含量不同進(jìn)而影響溶磷能力[25] ，產(chǎn)生有機(jī)酸是微生物溶磷的重要機(jī)理之一[26-27]。溶磷細(xì)菌研究的關(guān)鍵在于應(yīng)用，土壤中的碳源種類繁多，含量也不盡相同，因此研究碳源對(duì)菌株溶磷能力的影響，不僅要分析單一碳源的影響，更要分析組合碳源的影響。本研究采用室內(nèi)搖瓶培養(yǎng)，QHR-9在組合碳源條件下的溶磷能力比以葡萄糖為單一碳源降低了85.71%，組合碳源是10種糖類的等量組合，其中有8種是QHR-9利用率較低的碳源，其余2種利用率較高的碳源在培養(yǎng)液中的含量也較低，不足以提供其正常生長(zhǎng)所需要的能量物質(zhì)，因此菌株在組合碳源條件下的溶磷能力也較低。

3.2溶磷細(xì)菌外加碳源對(duì)土壤有效磷含量、磷酸酶活性和微生物碳循環(huán)相關(guān)基因相對(duì)豐度的影響本研究中，QHR-9各處理與CK相比，土壤有效磷含量均顯著增加，這與Barra等[28]的研究結(jié)果相同，溶磷細(xì)菌在提升土壤磷素有效性方面發(fā)揮積極的作用；QHR-9P處理的土壤有效磷含量最高，溶磷細(xì)菌與其可高效利用的碳源共同施用，對(duì)溶磷能力的發(fā)揮可以起到協(xié)同作用。土壤磷酸酶的作用之一是將有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷[29] ，酸性磷酸酶是中國(guó)農(nóng)業(yè)和自然生態(tài)系統(tǒng)磷素有效性的重要預(yù)測(cè)因子[30] ，堿性磷酸酶活性高低與微生物磷素豐缺有顯著相關(guān)性[29]。本研究中QHR-9C處理的土壤磷酸酶活性最高，溶磷細(xì)菌增加土壤有效磷含量的重要原因之一是磷酸酶活性增強(qiáng)，這與 Angelica等[31]、張雪梅等[32]的研究結(jié)果一致。微生物增殖會(huì)導(dǎo)致土壤磷酸酶活性增強(qiáng)[33]，本研究中不同處理土壤Pseudomonas nitroreducens strain相對(duì)豐度與土壤有效磷含量、酸性磷酸酶活性、堿性磷酸酶活性等呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)，QHR-9的增殖在一定程度上增加了磷酸酶活性，進(jìn)而促進(jìn)了土壤有效磷含量的增加。在土壤中添加不穩(wěn)定碳源（葡萄糖等），微生物可以利用添加的碳源進(jìn)行自身生長(zhǎng)[34]，因此本試驗(yàn)中QHR-9P和QHR-9C處理土壤碳循環(huán)相關(guān)基因相對(duì)豐度顯著高于QHR-9處理，土壤中以QHR-9 為代表的溶磷細(xì)菌數(shù)量的增加，進(jìn)一步促進(jìn)了土壤磷酸酶活性和有效磷含量等磷素相關(guān)指標(biāo)的變化。

土壤碳循環(huán)相關(guān)基因中，GH參與有機(jī)碳的微生物分解，GT與有機(jī)碳的合成有關(guān)，AA參與木質(zhì)素的微生物分解。QHR-9處理土壤GT基因相對(duì)豐度與對(duì)照相比呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，GH基因相對(duì)豐度增加，這可能是因?yàn)槿芰准?xì)菌需要利用土壤中的碳源作為生長(zhǎng)的碳骨架和能源物質(zhì)，維持自身生長(zhǎng)和發(fā)揮溶磷能力，促進(jìn)了土壤碳的分解，土壤有機(jī)碳分解相關(guān)基因GH相對(duì)豐度增加，有機(jī)碳合成相關(guān)基因GT相對(duì)豐度減少。Luo等[2]的研究結(jié)果表明，添加人工磷，通過(guò)降低氧化酶活性抑制了木質(zhì)素的分解，施用溶磷細(xì)菌的土壤有效磷含量顯著增加，有效磷含量的增加對(duì)木質(zhì)素的分解產(chǎn)生抑制作用，與木質(zhì)素分解有關(guān)的AA基因豐度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。外加不穩(wěn)定碳源（葡萄糖等）會(huì)產(chǎn)生正激發(fā)效應(yīng)，導(dǎo)致土壤有機(jī)碳分解增加[34]，因此QHR-9C處理GH基因相對(duì)豐度高于QHR-9處理，QHR-9C處理的GT基因相對(duì)豐度與QHR-9處理相比呈下降趨勢(shì)。QHR-9+葡萄糖與QHR-9+組合糖類處理GH、GT、AA基因相對(duì)豐度差異不顯著，這可能與土壤微生物系統(tǒng)的復(fù)雜性以及對(duì)碳源利用的多樣性有關(guān)，單獨(dú)加入葡萄糖或者加入組合糖類，兩者對(duì)土壤微生物碳循環(huán)相關(guān)基因影響的差異性較小。

3.3土壤微生物碳循環(huán)相關(guān)基因相對(duì)豐度與土壤養(yǎng)分含量、磷酸酶活性的相關(guān)性本研究中，土壤有效磷含量與微生物碳循環(huán)AA、GT基因相對(duì)豐度等均呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，與GH基因相對(duì)豐度呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。土壤有效磷是影響土壤微生物碳循環(huán)功能相關(guān)基因的重要因素，袁銀龍等[35]的研究結(jié)果也證明土壤有效磷對(duì)土壤微生物碳循環(huán)具有重要影響，這也揭示了外源磷添加對(duì)碳庫(kù)的影響，即外源磷添加會(huì)增加土壤有效磷含量，進(jìn)而影響碳循環(huán)過(guò)程。在影響微生物群落和結(jié)構(gòu)方面，pH是關(guān)鍵因子之一[36]，Dai等[37]的研究結(jié)果表明，土壤pH與土壤微生物碳循環(huán)AA、GT基因相對(duì)豐度呈正相關(guān)，與GH基因相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。溶磷細(xì)菌在土壤中分泌低分子量有機(jī)酸，通過(guò)降低土壤pH促進(jìn)有效磷含量的增加，土壤pH的變化與有效磷含量的變化呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，因此pH與土壤微生物碳循環(huán)相關(guān)基因相對(duì)豐度的相關(guān)性也呈相反的趨勢(shì)。微生物參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解和合成，因此與微生物碳循環(huán)相關(guān)基因有密切的關(guān)系。本研究中，由于試驗(yàn)包含添加葡萄糖或組合糖等處理，有機(jī)質(zhì)含量?jī)H與GHs基因相對(duì)豐度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。

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