◎ 吳明亮

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

還原糖是指能夠被還原的糖，包括葡萄糖、果糖。由于其對人體健康具有重要意義，所以在食品、飲料、乳制品、藥品、飼料等行業(yè)廣泛應(yīng)用。還原糖可以直接作為食品添加劑，也可以作為食品添加劑的載體或載體中的一種，在食品工業(yè)中有著重要作用。果糖相對來說不容易被人體吸收，但果糖被人體吸收后會迅速轉(zhuǎn)化為葡萄糖，而且果糖在體內(nèi)代謝較快，在一定程度上可以代替葡萄糖為人體提供能量。因此，有必要研究食品中還原糖的快速檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

飲料、水果。

1.1.2 試劑

本實驗使用的試劑為甲醇、鹽酸、氫氧化鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）、乙酸銨溶液（分析純）。其中，甲醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%；鹽酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%；氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%；無水乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%；乙酸銨溶液（分析純）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%。在實驗中，還使用了乙酸銨溶液（分析純），使用了10 mg/mL的還原糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成樣品溶液。

1.2 儀器與方法

1.2.1 儀器

在實驗室中，使用的儀器主要包括紫外分光光度計、原子熒光分光光度計等。其中，原子熒光分光光度計是一種較為新型的儀器，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可以通過不同的波長來對溶液中的還原糖含量進(jìn)行檢測，具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。在使用儀器檢測還原糖時，需要將其工作環(huán)境控制在100～400 nm之間，且波長在400 nm處的光強不應(yīng)超過10 mW/cm2[1]。

1.2.2 樣品前處理

對樣品進(jìn)行前處理，能夠提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。對于還原糖含量較高的樣品來說，在進(jìn)行前處理時，需要確保樣品的純度。將樣品置于水中，加入適量的還原劑和顯色劑，攪拌均勻后靜置1 h，然后取出放置24 h，或者放置過夜。在放置過程中，需要保證樣品的吸光度與顯色劑的吸光度一致。對于還原糖含量較低的樣品來說，需要先將其放置于水中加熱到70 ℃，然后靜置30 min取出，用水冷卻至室溫后再加入適當(dāng)比例的顯色劑和還原劑。在測定過程中，需要注意以下幾點：①如果還原糖含量較高，需要先將其加熱至70 ℃。②在加入顯色劑之前需要對溶液進(jìn)行稀釋。③在加入還原劑之前需要對溶液進(jìn)行稀釋。如果還原糖含量較低，則可以直接將其加入水中。

1.2.3 測量條件

為了使實驗具有較高的準(zhǔn)確度，可以根據(jù)測量條件進(jìn)行測量，一般來說，可以采用如下測量條件：①在測量過程中，將 pH值調(diào)節(jié)為5.0。②在測量過程中，對吸收液的溫度進(jìn)行控制，一般在20～25 ℃之間。③在測量過程中，采用的是紫外分光光度計進(jìn)行測定。④在測量過程中，采用的是光電比色計進(jìn)行測定。為了確定最佳檢測條件，可以在標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍內(nèi)，使用50～20 mL的蒸餾水來制備樣品溶液。同時需要將樣品溶液稀釋到一定倍數(shù)。需要注意的是，當(dāng)樣品溶液濃度高于一定數(shù)值時，不能再使用此方法測定。

一般情況下，樣品溶液濃度小于40 mg/L時，其稀釋倍數(shù)應(yīng)控制在1倍以上；樣品溶液濃度大于40 mg/L時，則應(yīng)控制在2倍以上。同時，需要注意的是：①測定的時間一般控制在10～20 min之間。②測定過程中，需要對試劑進(jìn)行充分?jǐn)嚢?。如果試劑沒有充分溶解或者攪拌不充分，則會影響實驗的準(zhǔn)確度。

1.2.4 測定方法

滴定分析：將試樣移至5 mL容量瓶中，加入2 mL 95%酒精，充分溶解后，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆?，再加? mL 10%硫酸鈉溶液和2.0 mL無水硫酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌1 min。取2滴0.1 g無水硫酸鈉溶液于1 mL容量瓶中，加入1 mL 95%酒精，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆?，再?.1 g無水硫酸鈉溶液繼續(xù)攪拌1 min，然后靜置10 min。精密度試驗需要注意以下幾點：①平行試驗所用試劑、標(biāo)準(zhǔn)溶液、溶液和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)一致[2]。②重復(fù)性試驗中標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)品不得更換。③同一樣品測定次數(shù)不應(yīng)超過3次。

1.2.5 實驗過程

首先，將一定量的樣品稀釋至不同濃度，并將稀釋后的樣品溶液放置一定時間，觀察其顏色變化，以確定樣品稀釋的程度。其次，用甲醇對樣品溶液進(jìn)行洗脫，并通過紫外-可見分光光度計進(jìn)行測定。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中還原糖的含量。該方法簡單、準(zhǔn)確、快速，適合于實驗室進(jìn)行大量樣品的含量測定。當(dāng)還原糖濃度大于0.2 mg/mL時，該方法具有較高的準(zhǔn)確性；當(dāng)還原糖濃度小于0.2 mg/mL時，該方法具有較高的靈敏度；當(dāng)還原糖濃度大于0.4 mg/mL時，該方法具有較低的靈敏度。該方法測定食品中還原糖含量時需要注意以下幾點：①樣品一定要充分研磨。②樣品稀釋比例合理。③樣品要現(xiàn)測現(xiàn)調(diào)。④在一定時間內(nèi)進(jìn)行測定。⑤樣品中添加一定濃度的甲醇。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品溶液稀釋至一定濃度后，使用 HPLC進(jìn)行檢測，在波長為265 nm處記錄吸收值，然后根據(jù)其峰面積計算出樣品中還原糖的含量。將標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用于測定葡萄糖和蔗糖中的還原糖含量，并記錄吸光度值。由實驗結(jié)果可知，葡萄糖和蔗糖中的還原糖在一定范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（Y=1.566X-0.052）可得，葡萄糖和蔗糖中的還原糖含量分別為5.32 mg/mL和2.96 mg/mL。此外，通過對比實驗可以得出結(jié)論：①當(dāng)樣品稀釋至一定濃度后，其吸光度值隨稀釋濃度的增大而升高。這是因為溶液中的還原糖與鹽酸反應(yīng)生成褐色的物質(zhì)。②通過對標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的研究可知，樣品中還原糖與鹽酸反應(yīng)后生成的褐色物質(zhì)是以葡萄糖為基本單元的一系列物質(zhì)。因此，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程來計算樣品中還原糖含量時，可以利用葡萄糖和蔗糖中相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算樣品中還原糖含量[3]。

精密度試驗是測定實驗結(jié)果準(zhǔn)確度的重要步驟，可保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。精密度試驗要求在同一實驗室內(nèi)，對同一樣品進(jìn)行多次平行測定，得出重復(fù)性的數(shù)據(jù)。精密度試驗可以分為2種，1種是平行試驗，另1種是精密度試驗。如果在一個實驗室內(nèi)測定幾個樣品，需要取其平均值計算得出精密度數(shù)據(jù)[4]。通常情況下，平行試驗是在一個實驗室內(nèi)完成的。精密度試驗所用的儀器設(shè)備必須可靠、穩(wěn)定，測試環(huán)境條件應(yīng)盡可能一致，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 討論

測試結(jié)果的重復(fù)性，是衡量試驗結(jié)果的重要指標(biāo)之一。測量結(jié)果的重復(fù)性越高，就越能準(zhǔn)確反映出被測樣品中還原糖含量的準(zhǔn)確程度。在評價一種方法是否具有重復(fù)性時，最常用的指標(biāo)是測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。對于多種方法的檢測結(jié)果之間的相對關(guān)系，不能采用簡單的算術(shù)平均法，而只能用加權(quán)平均值來表示。加權(quán)平均值是根據(jù)一定原則建立起來的，如以某一樣品為中心，從多個樣品中取得平均值，則稱該樣品進(jìn)行測定所得到的結(jié)果為這一樣品在所有測定條件下得到的平均結(jié)果。如果加權(quán)平均值大于零，則表明該方法具有良好的重復(fù)性；否則，則表明該方法具有較大的偏差[5]。

由于還原糖的純度很低，且檢測的靈敏度也比較低，所以通常使用還原糖含量檢測試劑盒進(jìn)行測定。這些試劑盒大多采用高效液相色譜法對還原糖進(jìn)行檢測，但是該方法會受儀器、試劑、操作等方面的影響，而且其回收率較低，所以測定結(jié)果不夠準(zhǔn)確。為了提高檢測精度、提高回收率，同時在一定程度上降低成本，需要在原方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。一般采用加樣回收法，根據(jù)樣品中還原糖含量和濃度確定加樣體積，將樣品加到檢測試劑盒中進(jìn)行測定，計算回收率。加樣法是一種比較簡單、準(zhǔn)確的方法，但是也有一些不足之處：①由于加樣法只能在樣品濃度很低的情況下進(jìn)行檢測，所以加樣時樣品中要加入大量的試劑。②由于加樣法會受儀器、試劑、操作等方面的影響，所以檢測結(jié)果與實際值存在一定的誤差。③加樣后必須進(jìn)行溶解操作，溶解步驟比較煩瑣。④加樣法的準(zhǔn)確度受樣品中還原糖含量和濃度等因素的影響。如果樣品中還原糖含量較低或較高，加樣誤差都會較大。⑤加樣法只能檢測樣品中的還原糖含量和濃度，而不能對其進(jìn)行定量。如果樣品中的還原糖含量過低或者濃度過高時，則需要另外添加試劑來進(jìn)行檢測。如果需要對還原糖進(jìn)行定量檢測時，可以采用加樣法和加樣后進(jìn)行溶解操作；如果不進(jìn)行溶解操作，則會導(dǎo)致加樣法的準(zhǔn)確性無法保證。

4 結(jié)語

還原糖是一種廣泛存在于各類食品中的物質(zhì)，對食品品質(zhì)有重要影響。采用常規(guī)的分光光度法、儀器分析法等方法進(jìn)行檢測時，由于還原糖在試劑中溶解度較小，所測結(jié)果偏低，且操作煩瑣、耗時長。采用新的檢測方法——比色法，通過與比色卡比較進(jìn)行準(zhǔn)確測定，具有快速、簡便、準(zhǔn)確的特點。新的檢測方法比傳統(tǒng)比色法的使用范圍更廣泛，可用于各種食品的檢測，也可用于植物細(xì)胞中還原糖含量的測定。