蔣碧偉 , 羅蓓蓓 , 張立攀 , 張亞勛 , 孫茜茜 , 任 釗

(河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司 ,河南 鄭州 450000)

杜仲(Eucommiae Cortex)又名思仲、扯絲皮,為杜仲科杜仲屬植物,是我國獨有的經(jīng)濟樹種,廣泛分布于河南、安徽、山東等地,杜仲常以皮入藥,具有滋補肝腎、強筋壯骨、保胎安胎等功效[1]。杜仲的成熟干制葉片,研究表明,杜仲葉與皮化學組成近似,具有極高的藥用價值。2019年經(jīng)衛(wèi)健委批準將杜仲葉、山茱萸等作為藥食同源試點物質(zhì)開展生產(chǎn),從此杜仲葉可以作為食品原料使用,其在功能食品領(lǐng)域具有巨大的潛在發(fā)展前景[2]。

杜仲葉被認為是天然的降壓、降糖藥物,效果顯著,但杜仲葉茶的活性物質(zhì)只有溶于水,才能被人體吸收利用,杜仲葉茶功效發(fā)揮的關(guān)鍵在于泡制方式,科學的泡茶方式不僅能夠使茶香濃郁純正,口感醇和更佳,還能使活性成分得到高效利用[3]。因此,為了探討浸泡條件對杜仲葉茶功效成分溶出量及抗氧化、降糖效果的影響,本研究以浸泡溫度、時間、次數(shù)為考察因素,以黃酮、綠原酸、總多酚溶出量、DPPH·清除率、OH·清除率、葡萄糖苷酶抑制率為考察指標,分析評價其抗氧化作用及降糖功效,從而為杜仲葉茶的科學泡制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉茶,河南芳捷農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司;綠原酸標準品(純度≥99%)、蘆丁標準品(純度≥99%)、沒食子酸標準品(純度≥99%)、京尼平苷酸(純度≥99%)、α-葡萄糖苷酶(25 U)、1,1-二苯基苦基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(純度≥95%)、Folin-Ciocalteu 試劑(1 moL/L)、阿卡波糖、VC標準品,上海源葉生物科技有限公司;水楊酸、FeSO4、過氧化氫、對硝基苯酚葡萄糖苷(PNPG)、乙腈、甲酸、甲醇、乙醇、Na2CO3,分析純,國藥集團試劑化學有限公司;硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉,分析純,天津市瑞金特化學品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

101-1AB型恒溫干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司;TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;FA2004電子天平,上海衡際科學儀器有限公司;KQ-7000DE型數(shù)控超聲清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;Agilent TC-C18,150 mm×4.6 mm,3.0 μm,1290高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

準確稱取杜仲葉茶1 g,置于燒杯,按照1∶30的茶水比加入熱水,恒溫水浴鍋中保溫一定時間,放涼、過濾,測定黃酮、多酚、綠原酸、京尼平苷酸等含量,并進行相關(guān)活性實驗研究。

1.3.1實驗過程

①準確稱取1 g杜仲葉茶,放入到燒杯中,按照1∶30茶水比,加入一定溫度(60、70、80、90、100 ℃)的純凈水,浸泡30 min后,放涼、過濾,檢測黃酮、綠原酸、京尼平苷酸含量。②準確稱取1 g杜仲葉茶,放入到燒杯中,按照1∶30茶水比,加入90 ℃熱水,浸泡一定時間(15、30、45、60、90 min)后,放涼、過濾,檢測黃酮、綠原酸、京尼平苷酸含量。③準確稱取1 g杜仲葉茶,放入到燒杯中,按照1∶30茶水比,加入90 ℃熱水,浸泡45 min后,重復(fù)操作,進行第2次浸泡和第3次浸泡,放涼、過濾,檢測黃酮、綠原酸、京尼平苷酸、含量。④根據(jù)上述得出的最佳浸泡條件,研究對DPPH·、OH·的清除作用及對葡萄糖苷酶的抑制效果。

1.3.2黃酮檢測方法

參考文獻[4]采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法,準確稱量蘆丁標準品15 mg,以60%乙醇定容至25 mL容量瓶中,制備0.6 mg/mL標準液。分別吸取0、0.25、0.50、1.00、1.50、1.75 mL標準液加至10 mL容量瓶中,依次加入5% 亞硝酸鈉溶液0.5 mL,搖勻靜置6 min,加入10% 硝酸鋁溶液0.5 mL,搖勻靜置6 min,加入10% 氫氧化鈉溶液2 mL,最后用60%乙醇定容至刻度線,采用分光光度法,在510 nm波長下,測定吸光值,以蘆丁濃度(mg/L)為橫坐標,以吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3總多酚含量測定

參考文獻[5]精確稱量22 mg沒食子酸標準品,用純凈水定容至100 mL容量瓶中,得到0.22g/L標準液,分別吸取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL標準液于具塞比色管,依次加入福林酚試劑1 mL,搖勻,加入12 mL 12%的Na2CO3溶液,以純凈水定容至25 mL,在25 ℃下避光保溫2 h,于765 nm波長下測定吸光度,以沒食子酸濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4綠原酸、京尼平苷酸檢測

1.3.4.1色譜條件

以Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm,3.0 μm)為實驗柱,綠原酸和京尼平苷酸色譜條件:以100%甲醇、1.5%醋酸水溶液分別為流動相A和B,檢測波長分別為327、254 nm,柱溫40 ℃,梯度洗脫程序為0～2 min,5%A;2～10 min,5%～100%A,流速為0.5 mL/min,檢測時長10 min,進樣量20 μL。上述操作條件下,杜仲葉供試品及標準品色譜圖見圖1。京尼平苷酸、綠原酸保留時間分別為5.043、5.816 min。

圖1 杜仲葉供試品及標準品色譜圖

1.3.4.2標準曲線制備

分別精確稱取綠原酸(12.4 mg)、京尼平苷酸(11.3 mg)標準品于10 mL棕色容量瓶,加入甲醇溶液定容至刻度線,搖勻,得到綠原酸、京尼平苷酸混合標準液。分別吸取一定體積的標準液制備20、50、100、200、500 mg/L標準液,按照1.3.2.1色譜條件上樣檢測,以峰面積為縱坐標,標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.5DPPH·自由基清除率實驗

參考文獻方法[6],分別吸取2 mL杜仲葉提取液,0.2 mmol/L的DPPH·乙醇溶液2 mL,混合均勻,25 ℃下避光保溫30 min,以蒸餾水代替樣品為空白組,在517 nm波長下測定吸光值A(chǔ)空白,以2 mL DPPH·乙醇溶液和2 mL樣品為實驗組測定吸光值為A樣品,DPPH·清除率見式(1):

(1)

1.3.6OH·自由基清除實驗

參考文獻方法[7],將提取液2 mL,6 mmol/L硫酸亞鐵,8.8 mmol/L 雙氧水各2 mL混合后靜置10 min,分成兩部分,一部分加入2 mL 6 mmol/L水楊酸乙醇溶液混合靜置3 min,在510 nm處測定吸光度值Ci,一部分加2 mL水,在510 nm處測吸光度值Cj,空白組吸光度記為C0,清除率見式(2):

(2)

1.3.7α-葡萄糖苷酶抑制率實驗

參考文獻方法[8],準確吸取100 μL提取液,加入0.01 g/Lα-葡萄糖苷酶100 μL,混勻。37 ℃下水浴加熱15 min,加入2.5 mmol/L PNPG 100 μL,混勻;37 ℃水浴10 min,然后加入0.1 mol/L Na2CO35 mL終止反應(yīng),405 nm波長下測定吸光值(A實驗)。蒸餾水代替提取液組作為空白組(A空白),蒸餾水代替α-葡萄糖苷酶組為空白對照組(A空白對照),抑制率公式見式(3):

抑制率/%=

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同浸泡溫度對杜仲葉茶活性成分的影響

如圖1所示,隨著溫度的升高,杜仲葉茶活性成分溶出量呈現(xiàn)一定的遞增趨勢。

圖1 不同溫度對杜仲葉茶活性成分的影響

總黃酮是杜仲葉的主要活性成分,黃酮含量高低被認為是判斷杜仲葉品質(zhì)的基本指標,研究表明,植物黃酮具有抗氧化、抗衰老、降血壓、提升免疫力等作用[9]。杜仲葉茶總黃酮含量在90 ℃時為(69.13±2.77) mg/g,是60 ℃時含量的1.2倍,100 ℃時的黃酮含量與90 ℃時黃酮含量差異較小。多酚被稱為“第八大營養(yǎng)素”,植物多酚具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、增強免疫力等功能[10]。由圖1可知,在90 ℃時,杜仲葉茶總多酚溶出量為(37.2±2.11) mg/g,是60 ℃時含量的1.15倍,在100 ℃時,總多酚溶出量增長幅度較小,但整體為增長趨勢。綠原酸是《中國藥典》(2020版)中關(guān)于杜仲葉質(zhì)量控制的唯一指標,綠原酸具有較強的抗衰老、清除自由基、抑菌、抗腫瘤、降血壓、保護心血管等作用[11]。綠原酸在60～90 ℃時增幅明顯,90 ℃時綠原酸溶出量是60 ℃時含量的1.15倍,90～100 ℃溶出量增長較緩慢。京尼平苷酸是杜仲葉環(huán)烯醚萜類化合物之一,具有保肝利膽、修復(fù)損傷脊髓、提高記憶力、抗炎等多種生物活性[12]。京尼平苷酸含量在90 ℃時溶出量最大,在60～90 ℃,其溶出量逐漸增加,當溫度超過90 ℃時,其溶出量呈現(xiàn)降低趨勢,可能是京尼平苷酸受溫度影響,出現(xiàn)了一定量的損失,與鄧佑林等[13]研究結(jié)果相似。因此,當水溫在90 ℃以上時,杜仲葉茶活性成分的溶出量比較大,適合飲用。

2.2 不同浸泡時間對杜仲葉茶活性成分的影響

不同浸泡時間對杜仲葉茶活性成分溶出的影響見圖2。

圖2 不同浸泡時間對杜仲葉活性成分的影響

由圖2可知,隨著浸泡溫度的升高,黃酮在45 min時溶出量最高,45 min后溶出量逐步降低,多酚在15～45 min時溶出量逐漸升高,45 min時含量最高,綠原酸溶出量隨時間變化規(guī)律和黃酮、多酚相一致,在45 min時達到最大值,京尼平苷酸溶出量在15～60 min時,隨浸泡時間呈現(xiàn)遞增趨勢,在60 min時含量最高,60 min后含量有一定范圍的緩慢降低。因此,當浸泡時間在45 min時,活性成分整體含量較高,適合飲用。

2.3 不同浸泡次數(shù)對杜仲葉茶活性成分的影響

不同浸泡次數(shù)對杜仲葉茶活性成分的影響見圖3。

圖3 浸泡次數(shù)對杜仲葉茶活性成分的影響

由圖3可知,隨著浸泡次數(shù)的增加,活性成分的溶出量均出現(xiàn)逐漸降低趨勢,黃酮含量明顯降低,統(tǒng)計學數(shù)據(jù)顯示差異性顯著(P<0.05)。多酚含量隨著浸泡次數(shù)的增加略有降低,綠原酸含量第1次浸泡和第2次浸泡之間差異不大,第3次浸泡有一定程度降低。京尼平苷酸含量隨著浸泡次數(shù)增加呈現(xiàn)顯著降低趨勢(P<0.05)。因此,第1次浸泡是最佳的浸泡方式,活性成分溶出量最高,最利于功效的發(fā)揮。

2.4 DPPH·自由基清除率實驗

利用SPSS 22.0軟件對VC溶液及杜仲葉茶浸泡液清除DPPH·自由基能力進行分析,經(jīng)過非線性曲線擬合(DOSERESP),各參數(shù)及方程見圖4。VC溶液對DPPH清除作用擬合非線性關(guān)系良好,R2=0.999 2,其對DPPH·自由基清除率的IC50為0.007 88 g/L,杜仲葉茶浸提液清除DPPH·自由基的IC50為0.231 92 g/L,因此,研究表明,VC抗氧化能力較強,杜仲葉茶具有一定的抗氧化能力。

圖4 VC及杜仲葉茶對DPPH·自由基的清除能力

2.5 對OH·自由基的清除作用

VC及杜仲葉茶浸泡液對OH自由基的清除能力見圖5。由圖5可知,利用SPSS 22.0軟件對VC溶液及杜仲葉茶浸泡液清除OH·自由基能力進行分析,發(fā)現(xiàn)VC溶液OH·自由基清除率的IC50為0.140 04 g/L,擬合方程的R2=0.940 4,擬合關(guān)系良好。杜仲葉茶浸提液對OH·自由基具有明顯的清除作用,其IC50為7.443 69 g/L,表明杜仲葉茶具有良好的抗氧化能力。

圖5 VC及杜仲葉茶浸泡液對OH·自由基的清除能力

2.6 對α-葡萄糖苷酶的清除作用

阿卡波糖及杜仲葉茶浸泡液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖6。

圖6 阿卡波糖及杜仲葉茶對葡萄糖苷酶的抑制作用

由圖6可知,隨著濃度升高,阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率幾乎不變,達到100%。杜仲葉茶浸泡液對葡萄糖苷酶的抑制作用隨著濃度升高呈現(xiàn)遞增趨勢,通過非線性方程擬合,擬合度較高,R2=0.994 51,得到其IC50為1.941 63 g/L,表明杜仲葉茶具有一定的降糖作用。

3 結(jié)論

通過研究不同浸泡因素對杜仲葉茶活性成分溶出量的影響,得到最佳的泡制方式,為其科學飲用奠定了理論基礎(chǔ),研究表明,當條件為水溫90 ℃以上,浸泡時間45 min,首次浸泡時杜仲葉茶中黃酮類化合物、多酚、綠原酸及京尼平苷酸溶出量較高,能夠發(fā)揮最大功效。在最佳浸泡條件的基礎(chǔ)上,評價了杜仲葉茶浸泡液對DPPH·、OH·的清除作用及對葡萄糖苷酶的抑制效果,利用SPSS 22軟件進行非線性擬合得到其IC50,分別為0.231 92、7.443 69、1.941 63 g/L,結(jié)果表明,杜仲葉茶具有一定的抗氧化能力及降糖作用。