肖 昕, 孫建飛, 肖 剛, 郭 輝, 曹麗娟, 任玉靜

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué), 陜西 咸陽 712046 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院, 陜西 咸陽 712000)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)發(fā)病率和死亡率呈逐年遞增的趨勢,是惡性腫瘤死亡的主要原因之一。據(jù)2008年中國癌癥統(tǒng)計公報表明:我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率、死亡率在世界惡性腫瘤中居于第三位及第五位,新發(fā)病例37.6萬,死亡病例19.1萬[1]。飲食對CRC發(fā)病影響至關(guān)重要,高脂飲食習(xí)慣和低膳食纖維含量的“西方”飲食會增加體內(nèi)次級膽汁酸含量從而導(dǎo)致結(jié)腸炎癥和腫瘤形成。而短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)作為腸道微生物群分解膳食纖維的一種代謝物,隨著膳食纖維的攝入增加可有效預(yù)防結(jié)直腸癌變。目前國內(nèi)外就次級膽汁酸和短鏈脂肪酸對CRC的影響及其關(guān)聯(lián)性研究還不夠深入,因此探討次級膽汁酸和短鏈脂肪酸對CRC的影響因素及其后續(xù)防治意義至關(guān)重大。

1 次級膽汁酸與SCFAs

1.1次級膽汁酸產(chǎn)生、運輸及代謝:次級膽汁酸由初級膽汁酸分泌,在腸道菌群代謝作用下進(jìn)行7α-脫羥基作用分解所產(chǎn)生。初級膽汁酸是以肝細(xì)胞中膽固醇為主要原料直接合成的一種甾醇化合物。合成后的膽汁酸由甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合后排出并儲存在膽囊中,再經(jīng)回腸頂端鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白(apical sodium-dependent bile salt transporter,ASBT)主動吸收及結(jié)腸的被動吸收進(jìn)行重吸收,重吸收的膽汁酸在腸黏膜細(xì)胞內(nèi)與回腸膽汁酸結(jié)合蛋白(ileal bile acid binding protein,IBABP)結(jié)合,并通過OSTα-OSTβ 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至基底膜外側(cè)并通過門脈血入肝臟完成“腸-肝循環(huán)”。只有5%的膽汁酸真正進(jìn)入到結(jié)腸,并通過腸道菌群代謝,其中的初級膽汁酸如膽酸(cholic acid,CA)和鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)則轉(zhuǎn)化為次級膽汁酸:脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)和石膽酸(lithocholic acid,LCA)。當(dāng)兩者水平升高,又會破壞腸道微生物平衡,損害腸黏膜,引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而促使結(jié)直腸炎癥和癌變的發(fā)生。

1.2SCFAs的組成及作用:SCFAs是一個具有1～6個碳鍵原子的羧酸,并由復(fù)雜的碳水化合物被腸道微生物區(qū)代謝成低聚糖并發(fā)酵形成。作為大腸內(nèi)游離陰離子(SCFA-)的主要組成部分,SCFAs基本被腸黏膜直接吸收,且種類繁多,以丁酸鹽、丙酸鹽、乙酸鹽為主,在人體腸道中占全部短鏈脂肪酸的比重超95%且達(dá)到50～200mmoL/L的總濃度。它們通過腸黏膜被有效吸收,并作為能量來源、基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑和被特異性受體識別的信號分子對宿主生理學(xué)影響重大。丁酸鹽作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的主要能量源,低濃度會導(dǎo)致哺乳動物細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的分化。而短鏈脂肪酸作為健康和疾病中氧化還原信號的調(diào)節(jié)劑,尤其是丁酸鹽,表現(xiàn)出與其氧化還原信號傳導(dǎo)活性相關(guān)的抗炎和抗增殖特性。

2 次級膽汁酸、SCFAs影響CRC的相關(guān)因素

2.1腸道微生物群

2.1.1次級膽汁酸與腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)失調(diào)致使結(jié)直腸癌變:高脂肪飲食習(xí)慣不僅會引起腸道微生物群的紊亂、破壞腸屏障功能并誘導(dǎo)炎癥,還會異常代謝出諸如次級膽汁酸等致癌產(chǎn)物,進(jìn)而促使CRC形成。長期的高脂肪低纖維飲食人群,在其糞便中可明顯檢測到高水平的DCA、LCA,這些都使得CRC發(fā)病率顯著提高。次級膽汁酸作為結(jié)直腸中一種腫瘤促進(jìn)劑,當(dāng)腸道微生物菌群長期暴露于其中,其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的相對完整性也會遭到一定程度的損害甚至導(dǎo)致腸道菌群死亡。一則臨床研究發(fā)現(xiàn)[2],在通過對比正常人與CRC患者體內(nèi)膽汁酸水平得出,CRC患者次級膽汁酸表達(dá)水平顯著升高于正常人群(P<0.05),且癌變處的腸道微生物群受到顯著改變(P<0.05),說明次級膽汁酸影響腸道微生物進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另一方面,腸道微生物群能顯著改變膽汁酸的理化性質(zhì),產(chǎn)生宿主核受體(法尼醇X受體、維生素D受體(VDR)、孕烷X受體)和G偶聯(lián)蛋白受體5(TGR-5)的高親和力配體,并激活一系列如JNK、ERK、Akt等信號通路。腸道微生物群失衡同樣使得膽汁酸硫酸化降低,進(jìn)而抑制其對FXR的激活。在一項動物實驗中得出[3],在無菌(GF)和常規(guī)飼養(yǎng)(CONV-R)小鼠整個腸-肝系統(tǒng)的膽汁酸組成中CONV-R小鼠的鼠膽酸(嚙齒動物體內(nèi)的一種次級膽汁酸)水平顯著降低。這些研究表明,腸道微生物群在調(diào)節(jié)次級膽汁酸代謝時,通過上調(diào)FXR來抑制肝臟中膽汁酸合成起到了重要作用。有研究證明7α-脫羥基梭菌的濃度在所調(diào)查的CRC患者糞便中均有所升高[4]。7α-脫羥基梭菌加劇了次級膽汁酸的異常分泌,增加了CRC發(fā)病率。由此看出,CRC的發(fā)生發(fā)展離不開次級膽汁酸與腸道微生物菌群兩者的相互影響。因此,改變飲食習(xí)慣、減少高脂肪攝入、調(diào)節(jié)次級膽汁酸與腸道微生物之間的穩(wěn)態(tài)平衡,可以有效預(yù)防結(jié)直腸炎癥及癌變的發(fā)生。

2.1.2SCFAs與腸道微生物群對結(jié)直腸癌的影響:素食及其他高纖維飲食可以有效的預(yù)防CRC,SCFAs作為結(jié)腸微生物群酵解膳食纖維的產(chǎn)物,同樣在預(yù)防CRC中起到了重要作用。在SCFAs中,屬丁酸鹽的含量最高。進(jìn)入人體的膳食纖維經(jīng)腸道微生物群利用,使得丁酸鹽含量升高,減少亞硝酸鹽的毒性從而降低癌變率。腸道微生物群失衡的顯著特征便是丁酸鹽及其代謝菌群的減少。有研究發(fā)現(xiàn)通過周期性的攝入酸奶可以有效增加腸道中的益生菌,顯著升高SCFAs水平,進(jìn)而加速結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡[5]。研究指出,在丁酸衣原體的作用下,結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的增殖明顯減少,同時還加速其凋亡。此外,丁酸芽孢桿菌抑制了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路并調(diào)節(jié)了腸道微生物群組成。以及通過高脂肪飲食(HFD)誘導(dǎo)的APCmin/+小鼠,在丁酸梭狀芽孢桿菌(丁酸鹽的產(chǎn)物之一)的作用下顯著抑制了其腸道腫瘤的發(fā)展。因此,丁酸梭菌在降低了糞便次級膽汁酸含量同時增加了盲腸SCFA含量,并激活了G蛋白偶聯(lián)受體(GPR),說明丁酸衣原體可以通過調(diào)節(jié)Wnt信號傳導(dǎo)和腸道微生物群來抑制腸道腫瘤的發(fā)展,從而證明了產(chǎn)生丁酸鹽的菌群對CRC有著潛在抑制功能。

2.2對結(jié)直腸細(xì)胞增殖的影響

2.2.1次級膽汁酸促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖:次級膽汁酸對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響程度可以反映在其濃度變化上。低濃度DCA(5-50μmoL/L)通過反式激活表皮生長因子受體(EGFR)誘導(dǎo)COX-2表達(dá),增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲性;而在高脂肪飲食下,次級膽汁酸濃度可高達(dá)1mmoL/L,并通過激活蛋白1(AP1)和c-髓細(xì)胞瘤(c-Myc)靶向通路激活β-連環(huán)蛋白細(xì)胞信號、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白1和2(ERK1/2)信號通路,刺激結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲性。另一方面,生理濃度(0.05～0.3mmoL/L)的次級膽汁酸(如DCA)會根據(jù)不同類型細(xì)胞不同程度的抑制結(jié)直腸細(xì)胞的增殖。具體來說,DCA和LCA主要通過產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)、基因組DNA斷裂、激活ERK1/2、caspase-3和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)來促進(jìn)細(xì)胞周期停滯和凋亡,但降低了細(xì)胞周期蛋白E(CyclinE)的表達(dá),從而抑制結(jié)腸細(xì)胞增殖[6]。此外,DCA激活細(xì)胞信號通路,導(dǎo)致對凋亡、血管生成、增殖和氧化應(yīng)激的選擇性抵抗。因此,次級膽汁酸暴露造成的反復(fù)DNA損傷,使得結(jié)直腸(和其他胃腸道)上皮細(xì)胞中的大量細(xì)胞代謝并誘導(dǎo)結(jié)直腸細(xì)胞癌變。

2.2.2SCFAs抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖:丁酸鹽被認(rèn)為是結(jié)直腸上皮細(xì)胞中對生長和分化最有效的SCFA。組蛋白去乙?；?HDAC)活性通過濃縮染色質(zhì)包裝抑制轉(zhuǎn)錄活性,導(dǎo)致腫瘤抑制基因(如p21)的表觀遺傳學(xué)介導(dǎo)沉默。而丁酸鹽作為一種HDAC抑制劑(HDACI)強(qiáng)烈激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá),并促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯、分化和凋亡,是一種潛在的抗腫瘤藥物。丁酸鹽被結(jié)腸上皮組織通過單羧酸轉(zhuǎn)運體1和其他轉(zhuǎn)運體選擇性吸收,并滿足能量平衡為結(jié)腸細(xì)胞提供約70%的能量;細(xì)胞內(nèi)丁酸鹽在低濃度(<0.5mmoL/L)時符合細(xì)胞的能量需求,并促進(jìn)正常結(jié)腸細(xì)胞的增殖;當(dāng)濃度超過其能量所需濃度(取決于細(xì)胞類型,范圍:0.5～5mmoL/L)時,丁酸鹽則充當(dāng)組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi);此外,丁酸鹽在生理濃度(0.5～5mmoL/L)時,以p53依賴和非依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡。在0.5mmoL/L或更高的濃度下,丁酸鹽通過增加抗轉(zhuǎn)移基因(如金屬蛋白酶)的表達(dá)和抑制促轉(zhuǎn)移基因(如基質(zhì)金屬蛋白酶)的激活來抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。盡管測試的每種SCFAs都顯著降低了原發(fā)性細(xì)胞侵襲,但丁酸鹽是最有效的。Wang[7]等將癌性HCT116結(jié)腸細(xì)胞暴露于生理相關(guān)劑量的丁酸鈉(丁酸鹽的一種),發(fā)現(xiàn)丁酸鈉抑制NRF2/NRF2信號軸靶基因并阻斷NRF2-ARE信號傳導(dǎo),證明丁酸鹽通過調(diào)節(jié)KEAP1/NRF2信號傳導(dǎo)并起到預(yù)防和治療CRC的作用。另一項研究表明與短鏈脂肪酸聯(lián)合放療時,丁酸鹽作為一種候選放射增敏劑可以在保護(hù)正常黏膜的同時增強(qiáng)放射治療的療效[8]。且丁酸鹽不會增加輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,也不會提高正常類器官輻射后的再生能力。由此可見,SCFAs對結(jié)直腸癌的治療將成為未來新的研究方向。

2.3相關(guān)信號通路

2.3.1次級膽汁酸影響結(jié)直腸癌的相關(guān)通路及分子機(jī)制:CRC的發(fā)生過程循序漸進(jìn),包括從腺瘤到癌的一系列細(xì)胞突變,其中一些突變導(dǎo)致Wnt和凋亡信號通路的失控。在結(jié)腸腫瘤發(fā)生發(fā)展中,細(xì)胞對次級膽汁酸的反應(yīng)包括激活Wnt和NF-κB信號通路,DNA氧化損傷和核分裂活性受損,從而導(dǎo)致結(jié)腸細(xì)胞過度增殖和侵襲。次級膽汁酸作用于癌細(xì)胞表面的TGR5或癌細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)的VDR后,可激活各種信號通路,抑制癌細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)癌細(xì)胞周期的進(jìn)展,增強(qiáng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力,并促進(jìn)細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞(CSCs)的轉(zhuǎn)化。此外,次級膽汁酸可以降低肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子CXCL16的水平,從而抑制NKT細(xì)胞上CXCR6蛋白的積累。

作為對膽汁酸毒性濃度的響應(yīng),由FXR、VDR、PXR和CAR組成復(fù)雜的核受體網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)膽汁酸攝取和解毒。一項對腸道腫瘤和其附近正常黏膜的研究指出,在從正常上皮向腫瘤轉(zhuǎn)化上皮的轉(zhuǎn)變過程中,FXR的表達(dá)顯著減少[9]。FXR表達(dá)下調(diào)是引起結(jié)直腸炎癥及腫瘤形成的重要因素。而應(yīng)用FXR激動劑可維持干細(xì)胞的正常增殖及染色體的穩(wěn)定性[10],上調(diào)促凋亡基因的表達(dá),抑制CRC的進(jìn)展。在Renga等的實驗中,與WT小鼠相比,FXR-/-小鼠(FXR缺陷)表現(xiàn)出結(jié)腸炎和癌癥風(fēng)險的增加。證實結(jié)直腸癌細(xì)胞中FXR的激活抑制了結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)了促凋亡基因p21,同時抑制了抗凋亡基因Bcl2。

2.3.2SCFA影響結(jié)直腸癌的相關(guān)通路及分子機(jī)制:丁酸鹽在結(jié)腸上皮組織中發(fā)揮抗增殖和促凋亡作用的相關(guān)信號通路是最近研究的焦點。有研究指出,TGF-β/Smad3通路激活對結(jié)腸細(xì)胞促凋亡有著顯著作用,而其通路的下調(diào)會導(dǎo)致癌癥進(jìn)展[11]。且丁酸鹽的機(jī)制作用與TGF-β上調(diào)介導(dǎo)的Wnt通路有關(guān),這也涉及到多種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶中的任何一種,即cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、CREB結(jié)合蛋白(CBP)或p300:CBP介導(dǎo)的Wnt信號與結(jié)腸細(xì)胞增殖有關(guān),而p300介導(dǎo)的Wnt信號與分化更密切相關(guān);因此,CBP-Wnt活性可能在癌癥中占主導(dǎo)地位。隨后,丁酸鹽(或其他HDACis)對該通路的過度激活導(dǎo)致與結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡有關(guān)的Wnt信號相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。丁酸鹽作為正常結(jié)腸上皮細(xì)胞的主要能量來源,并通過維持低水平的Wnt信號來支持細(xì)胞增殖[12]。因此,丁酸鹽誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞中Wnt信號的過度激活有望增加Wnt的活性水平,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;而膽汁酸對正常結(jié)腸細(xì)胞的刺激可能導(dǎo)致中等水平的Wnt活性,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。

除了具有Wnt信號通路的激活突變外,癌細(xì)胞往往會異常代謝,增加對有氧糖酵解的依賴。這將使結(jié)腸腫瘤細(xì)胞會優(yōu)先利用葡萄糖而非丁酸作為主要供能,并允許更多的丁酸鹽作為HDACi發(fā)揮作用,刺激Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此,經(jīng)過丁酸鹽處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞中Wnt信號的過度激活是促使這些細(xì)胞高水平凋亡所必需的條件。然而,適度的Wnt活性也與癌細(xì)胞增殖相關(guān),癌細(xì)胞可能逐漸對丁酸鹽的作用產(chǎn)生抗藥性。這種抗藥性可以表現(xiàn)為從依賴β-連環(huán)蛋白的Wnt途徑轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰蕾囉讦?連環(huán)蛋白下游效應(yīng)的修飾途徑。總體而言,丁酸鹽過度激活由于突變而表現(xiàn)出Wnt信號失控的結(jié)腸癌細(xì)胞系中的Wnt信號,這種突變是大多數(shù)結(jié)直腸癌類型的共同特征。因此,Wnt通路的過度激活與丁酸誘導(dǎo)的結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān),這一作用可以解釋丁酸鹽對結(jié)腸癌的預(yù)防作用。

3 腸道微生物組將成為免疫治療結(jié)直腸癌的新目標(biāo)

多項研究證明,微生物群有望成為免疫治療的新靶點。微生物群可以直接或間接激活和調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng),并且癌癥免疫療法對抗腫瘤的新思路,與微生物群的關(guān)系密切。近期一項研究表明,腸道微生物群可以與其宿主的免疫檢查點抑制劑(ICI)協(xié)同作用,尤其是在增強(qiáng)程序性死亡1(PD-1)蛋白及其配體程序性死亡配體1(PD-L1)阻斷治療癌癥的方面[13]。Montalban-Arques等[14]發(fā)現(xiàn)四種產(chǎn)丁酸梭菌:羅氏菌屬、哈利氏真細(xì)菌、普氏桿菌和卡卡厭氧桿菌(CC4)可以預(yù)防CRC發(fā)展:補充CC4可增加腫瘤浸潤IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的頻率和活性。另有研究發(fā)現(xiàn),雞乳桿菌可通過分泌一種保護(hù)性代謝產(chǎn)物吲哚-3-乳酸,促進(jìn)CRC細(xì)胞的凋亡,從而阻止CRC的發(fā)生。總之,微生物的改造和應(yīng)用對腫瘤免疫治療有很大的貢獻(xiàn),不僅能提高療效,還能降低副作用。同時,微生物群作為治療靶點,在腫瘤治療和預(yù)防中也發(fā)揮著重要作用。這些微生物組促進(jìn)癌癥和癌癥免疫治療的機(jī)制,還需要更多的理論支持和數(shù)據(jù)研究,但無疑是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)新的治療方向。

4 討 論

通過腸道微生物群、結(jié)腸細(xì)胞增殖、相關(guān)信號通路及分子機(jī)制等方面概述了次級膽汁酸與SCFAs對CRC的影響。總體而言,次級膽汁酸和SCFAs這兩種腸道主要代謝物在結(jié)直腸細(xì)胞增殖中起到的作用既有相似點也有不同點。在低濃度下這些微生物代謝物可促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞增殖,在高濃度時,次級膽汁酸和SCFAs通過共同或不同的分子途徑抑制結(jié)腸細(xì)胞的增殖;以及這兩者在長期的高生理水平上對結(jié)腸炎癥及CRC產(chǎn)生相反的作用。通過文獻(xiàn)總結(jié),次級膽汁酸和SCFAs之間的關(guān)聯(lián)可能通過改變結(jié)腸微生物群組成而發(fā)生。然而,哪些特定的生化途徑可能導(dǎo)致膽汁酸和SCFAs信號之間的潛在關(guān)聯(lián)仍需要進(jìn)一步研究,因為它們的影響不僅基于濃度和持續(xù)時間,還取決于細(xì)胞類型。由于腸道微生物群失調(diào)會改變次級膽汁酸和SCFAs的產(chǎn)生,并促使結(jié)直腸炎最終形成惡性腫瘤,因此平衡營養(yǎng)攝入量與高纖維低飽和脂肪攝入量對于維持健康的腸道微生物群至關(guān)重要。

另一方面,在近期的不斷研究下,微生物群和癌癥免疫治療已經(jīng)逐漸臨床上得到嘗試,在臨床研究中一些關(guān)于腸道微生物群在癌癥免疫治療中的初步報告表明,這將是對抗癌癥的一種新的方法。因此,更多地了解這些微生物及其代謝產(chǎn)物的相互作用很可能在結(jié)直腸癌的預(yù)防和治療方向有新的突破。