劉思宇，宋 濤，尹寧北

面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥（facioscapulohumeral muscular dystrophy，F(xiàn)SHD）的典型特征是進(jìn)行性肌無力，伴有肌萎縮，病理性纖維化及脂肪浸潤[1~3]。 FSHD與表觀遺傳抑制失敗引起的逆轉(zhuǎn)錄基因雙同源盒蛋白4 基因（double homeobox 4 gene，DUX4）的異常表達(dá)有關(guān)。 該基因在成年人組織中處于沉默狀態(tài)，其在骨骼肌中的異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4，5]。目前已經(jīng)確定了100 多個(gè)由DUX4 激活的靶基因，通過介導(dǎo)細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等引發(fā)FSHD 的病理變化[6~8]。除DUX4 表達(dá)外，F(xiàn)SHD 的關(guān)鍵病理機(jī)制仍然未知。研究表明，既往早期的DUX4 表達(dá)有可能會(huì)改變肌肉穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致FSHD 疾病狀態(tài)的持續(xù)存在和進(jìn)展[9]。這意味著，F(xiàn)SHD 的病理改變可能不僅由DUX4 驅(qū)動(dòng)，還可能由異常的肌肉微環(huán)境驅(qū)動(dòng)，例如持續(xù)地炎癥和病理性纖維化狀態(tài)[10，11]。 此外，F(xiàn)SHD 區(qū)別于其他肌營養(yǎng)不良的主要特征是肌肉病變的雙側(cè)不對稱，但機(jī)制尚不清楚。 因此，F(xiàn)SHD 進(jìn)展過程中肌肉微環(huán)境中發(fā)生改變的細(xì)胞類型可能成為未來治療的新靶點(diǎn)。

迄今為止，大多數(shù)關(guān)于FSHD 的研究都是在表達(dá)DUX4 的體外系統(tǒng)中進(jìn)行的，涉及FSHD 肌肉活檢的轉(zhuǎn)錄組研究也主要限于普通轉(zhuǎn)錄組測序 （bulk RNA sequencing，bulk RNA-seq）[1，11，12]。 之前有兩項(xiàng)關(guān)于FSHD 的單細(xì)胞測序研究[13，14]，也主要集中在肌源性細(xì)胞上，不涉及肌肉活檢的多細(xì)胞類型分析。因此，筆者研究旨在通過單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序 （single nuclei RNA sequencing，snRNA-seq），全面表征FSHD 肌肉微環(huán)境的細(xì)胞譜系組成和轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，為理解FSHD 的發(fā)病機(jī)制及藥物靶向治療提供更直觀和新穎的視角。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 臨床材料

選擇2021 年8 月至2022 年4 月就診于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院唇腭裂中心的2 例FSHD 患者，男性1 例，年齡65 歲，病程43 年；女性1 例，年齡46歲，病程32 年；采集雙側(cè)不對稱病變的口輪匝肌。2 例健康志愿者，男性1 例，年齡42 歲；女性1 例，年齡38歲；采集男性左側(cè)和女性右側(cè)正?？谳喸鸭?。收集各研究對象的臨床和病理特征。遵守中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院倫理委員會(huì)規(guī)定，已獲得研究對象或其家屬的書面知情同意書，并得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑、儀器與軟件

磷酸鹽緩沖溶液、2%胎牛血清、細(xì)胞核EZ 裂解緩沖溶液（Sigma，美國）。

常溫離心機(jī)、 冷凍離心機(jī)、Qubit 4.0 Flouromete（Thermo Fisher Scientific，美國）。

Cellranger v 6.0、Seurat v 4.1.1、Monocle 2 v 2.22.0、SingleR v 1.0 軟件（10 X Genomics，美國）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理

每個(gè)樣本采集約250 mg 肌肉組織，于4 ℃條件下保存送至實(shí)驗(yàn)室。用磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)清洗肌肉組織，去除殘留血液和雜質(zhì)，剪碎肌肉組織至3 ～5 mm3的小塊。將肌肉組織重懸于0.5 mL 細(xì)胞核EZ 裂解緩沖溶液中， 并用研磨機(jī)在冰上均質(zhì)化。 勻漿依次通過70 mm 和40 mm 細(xì)胞過濾器過濾，并在4°C（1 000×g）下離心5 min 以沉淀細(xì)胞核。 將沉淀物重懸于1 mL冷洗緩沖溶液 （含有2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖溶液），隨后通過20 μm 細(xì)胞過濾器過濾，即得到單細(xì)胞核懸液。

1.2.2 單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序

1.2.2.1 細(xì)胞捕獲和cDNA 合成 以6 000 ～8 000個(gè)細(xì)胞核為最終目標(biāo)捕獲量，根據(jù)10 X Genomics 的操作說明，利用微流控芯片將帶有細(xì)胞標(biāo)簽序列（cell barcode）的膠珠（bead）和單細(xì)胞核懸液中的細(xì)胞核一起包裹在液滴中，細(xì)胞核在液滴中發(fā)生裂解，使得細(xì)胞核中的mRNA 與bead 上面的cell barcode 相連。通過在3′端使用poly（A）堿基互補(bǔ)來捕獲特定的mRNA，從而構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄文庫。 以cDNA 為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，完成后進(jìn)行cDNA 質(zhì)檢及定量。

1.2.2.2 單細(xì)胞文庫構(gòu)建和測序 根據(jù)操作指南使用Chromium Single Cell 3' GEM、Library 和Gel Bead Kit v3.1 構(gòu)建單細(xì)胞文庫。使用cDNA 酶切割為200 ～300 bp 左右的片段， 然后進(jìn)行末端修復(fù)并加入A 尾結(jié)構(gòu)，連接P7 適配器接頭，通過PCR 擴(kuò)增引入樣品Tndex，最后篩選片段得到cDNA 文庫。 使用Illumina的NovaSeq 平臺(tái)進(jìn)行Pair-end 雙端文庫測序，每個(gè)細(xì)胞的測序深度至少為43 000 個(gè)讀數(shù)。

1.2.3 單細(xì)胞核測序數(shù)據(jù)分析

1.2.3.1 質(zhì)控、 降維和聚類分析 使用Cellranger 對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對和定量，獲得cell x gene 的表達(dá)式矩陣。 使用Seurat 對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。 正常情況下默認(rèn)過濾掉：①只在≤3 個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的基因；②過濾掉總基因數(shù)＞5 000 或者＜400 的細(xì)胞； ③過濾掉線粒體基因比例＞10%的細(xì)胞。

對多樣本進(jìn)行整合并使用Seurat 進(jìn)行無監(jiān)督聚類分群。 聚類分群流程包括如下步驟： ①使用“Normalization”函數(shù)的LogNormalize 方法，進(jìn)行表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化； ②使用在≥3 個(gè)細(xì)胞中表達(dá)并且高度可變的前2 000 個(gè)基因進(jìn)行主成分分析， 選取前20 個(gè)主成分用于后續(xù)的聚類和分群分析； ③采用louvain 算法對歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析；④采用統(tǒng)一流形逼近與投影方法 （uniform manifold approximation and projection，UMAP）進(jìn)行降維將結(jié)果可視化展示。

1.2.3.2 細(xì)胞類型鑒定 基于wilcox 算法篩選marker 基因，以劃分、注釋細(xì)胞群。 具體篩選標(biāo)準(zhǔn)為：①基因在細(xì)胞群中的表達(dá)比例，pct.1 或pct.2>0.25；②表達(dá)倍數(shù)avg_log2FC>0.25； ③P<0.01。 使用SingleR提供的方法和參考數(shù)據(jù)集對各個(gè)cluster 進(jìn)行細(xì)胞類型注釋。

1.2.3.3 差異基因（differentiallyexpresssedgenes，DEG）分析 使用FindMarkers 函數(shù)、基于wilcox 算法，對同一個(gè)細(xì)胞類型內(nèi)不同樣品的細(xì)胞進(jìn)行差異比較，篩選出DEG，具體篩選標(biāo)準(zhǔn)為：①|(zhì)avg_log2FC|>1；②P<0.05。

1.2.3.4 通路富集分析 針對不同細(xì)胞類型的DEG使用clusterProfiler 進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。挑選顯著富集的KEGG 通路（P<0.05），從而確定DEG 行使的主要生物學(xué)功能。

1.2.3.5 擬時(shí)序分析 使用Monocle 軟件包， 根據(jù)cluster 間差異表達(dá)的基因，以偽時(shí)間順序構(gòu)建單細(xì)胞發(fā)育軌跡。 使用雙倍數(shù)據(jù)流樹（double data rate tree，DDRTree） 來實(shí)現(xiàn)降維。 最后使用Monocle 包中的plot_cell_trajectory 函數(shù)來進(jìn)行可視化[15]。

1.2.3.6 基因集特征評分 使用基因集特征評分探索不同樣品中特定細(xì)胞類型的功能狀態(tài)，每個(gè)特征的詳細(xì)基因列表在相應(yīng)參考文獻(xiàn)中提供。 通過“AddModuleScore”函數(shù)計(jì)算基因集的歸一化加權(quán)平均表達(dá)， 并通過非參數(shù)Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)比較不同樣品之間的表達(dá)差異。

1.2.4 觀察指標(biāo)

①FSHD 肌肉組織的基本細(xì)胞譜系組成；②FSHD 肌肉微環(huán)境中各細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄組特征；③不同樣本中特定細(xì)胞類型的功能狀態(tài)及發(fā)育軌跡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0（IBM）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t 檢驗(yàn)比較各組間DEG 的表達(dá)水平，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)比較各組間基因集特征表達(dá)差異。 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α 值取雙側(cè)0.05。

2 結(jié)果

2.1 樣本特征

采集2 例FSHD 患者雙側(cè)不對稱病變的口輪匝肌和2 例正?？谳喸鸭」? 個(gè)樣本制備單細(xì)胞核懸液。樣本中2 例FSHD 患者口輪匝肌損傷相對正常側(cè)為輕度組，編號(hào)M1、M2；肌肉損傷較重側(cè)為重度組，編號(hào)S1、S2；2 例健康志愿者的正常肌肉為對照組，編號(hào)N1、N2。 見圖1。

圖1 snRNA-seq 流程和樣本特征Fig.1 Images of snRNA-seq process and sample characteristics

6 個(gè)樣本N1、N2、M1、M2、S1、S2 的單細(xì)胞核懸液濃度分別為310、500、550、460、350、520/μL； 細(xì)胞總量分別為6 200、20 000、22 000、18 400、7 000、10 400個(gè)；測序得到有效細(xì)胞數(shù)分別為3 093、10 590、13 648、13 124、2 307、5 840 個(gè)；過濾掉低質(zhì)量細(xì)胞后，分別納入2 987、9 704、12 148、11 736、2 232、5 496 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥肌肉組織的基本細(xì)胞類型

對6 個(gè)樣本的44 303 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行UMAP 無監(jiān)督聚類分析，分為23 個(gè)cluster，根據(jù)典型標(biāo)記基因共鑒定出10 種細(xì)胞類型（圖2A、B）：肌細(xì)胞[myocyte，14 032 個(gè)。 用肌聯(lián)蛋白基因（titin gene，TTN）、肌動(dòng)蛋白α1 基因（actin alpha 1 gene，ACTA1）標(biāo)記]，衛(wèi)星細(xì)胞[satellite cells，719 個(gè)。 用配對盒7 基因（paired box 7 gene，PAX7）標(biāo)記]，纖維/脂肪祖細(xì)胞[fibrous/adipose progenitor cells（FAPs），8 682 個(gè)。 用血小板衍生生長因子受體α 基因（platelet derived growth factor receptor alpha gene，PDGFRA） 標(biāo)記]， 平滑肌細(xì)胞[smooth muscle cells，6 780 個(gè)。 用肌球蛋白重鏈11 基因（myosin heavy chain 11 gene，MYH11）、肌動(dòng)蛋白α 基因（actin alpha 2 gene，ACTA2）標(biāo)記]，內(nèi)皮細(xì)胞[endothelial，8 563 個(gè)。 用血小板和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1基因 （platelet and endothelial cell adhesion molecule 1 gene，PECAM1）、血管性血友病因子基因（von willebrand factor gene，VWF）標(biāo)記]，巨噬細(xì)胞[macrophage，1 875個(gè)。 用CD163 分子基因（CD163 molecule gene，CD163）標(biāo)記]，肥大細(xì)胞[mastocyte，309 個(gè)。 用羧肽酶A3 基因（carboxypeptidase A3 gene，CPA3）標(biāo)記]，T 細(xì)胞 [T cells，445 個(gè)。 用CD247 分子基因（CD247 molecule gene，CD247）標(biāo)記]，脂肪細(xì)胞[adipocyte，1 466 個(gè)。 用脂肪酸結(jié)合蛋白4 基因 （fatty acid bind ing protein 4 gene，F(xiàn)ABP4）標(biāo)記]，施旺細(xì)胞[Schwann，1 432 個(gè)。 用髓磷脂蛋白P0 基因（myelin protein zero gene，MPZ）標(biāo)記]。3 組樣品中各種細(xì)胞類型的比例存在較大差異（圖2C）。 FSHD 重度組中，肌細(xì)胞比例明顯下降（對照組26.8%，輕度組38.9%，重度組17.2%）；FAPs 比例升高（對照組18.0%，輕度組19.6%，重度組22.0%）；脂肪細(xì)胞比例明顯升高（對照組0.7%，輕度組2.2%，重度組11.0%）。FSHD 兩組中內(nèi)皮細(xì)胞（對照組26.2%，輕度組15.6%，重度組19.4%）和平滑肌細(xì)胞（對照組21.0%，輕度組11.5%，重度組17.5%）比例均下降，免疫細(xì)胞中巨噬細(xì)胞比例均明顯升高（對照組1.0 %，輕度組5.0 %，重度組6.4 %）。

圖2 FSHD 單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄圖譜Fig.2 Single cell nuclear transcriptional profiles of FSHD

2.3 面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性

6 個(gè)樣本中共有2 629 個(gè)免疫細(xì)胞， 分為3 種類型，即T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞。 分別比較了FSHD 重度組和輕度組免疫細(xì)胞與對照組間的DEG， 其中巨噬細(xì)胞的上調(diào)基因在3 種細(xì)胞中最多，提示巨噬細(xì)胞在FSHD 免疫微環(huán)境中發(fā)揮了重要作用。 接下來重點(diǎn)分析了巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征， 發(fā)現(xiàn)FSHD 兩組巨噬細(xì)胞都存在免疫功能失調(diào)和細(xì)胞毒性損傷。 與輕度組相比，重度組巨噬細(xì)胞中參與脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝的基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ 基因（peroxisome proliferator activated receptor gamma gene，PPARG）、 脂肪酸轉(zhuǎn)位酶基因（fatty acid translocase gene，CD36）、 半乳糖凝集素1 基因（galectin 1 gene，LGALS1）、Toll 樣受體4 基因（toll like receptor 4 gene，TLR4）高表達(dá)，提示巨噬細(xì)胞可能參與了損傷肌肉的病理性脂肪替代過程，上述基因的拮抗劑可作為潛在治療靶點(diǎn)。 此外，重度組巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)免疫炎癥的基因GLIS 家族鋅指3 基因（GLIS family zinc finger 3 gene，GLIS3）、白細(xì)胞介素6受體基因（interleukin 6 receptor gene，IL6R）、造血前列腺素D 合酶基因 （hematopoietic prostaglandin D synthase gene，HPGDS）、 白三烯 C4 合酶基因（leukotriene C4 synthase gene，LTC4S）表達(dá)上調(diào)。

2.3.1 面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥巨噬細(xì)胞差異基因的功能富集分析

對FSHD 巨噬細(xì)胞的DEG 進(jìn)行KEGG 通路富集分析（圖3）。 與輕度組相比，重度組巨噬細(xì)胞富集到明顯更多的上下調(diào)通路，表明重度組存在更嚴(yán)重的免疫功能失調(diào)狀態(tài)。其中上調(diào)通路富集到脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路和過氧化物酶體增殖物激活受體通路，與肌肉的病理性脂肪浸潤相關(guān)。以上提示巨噬細(xì)胞可能是FSHD 免疫失調(diào)微環(huán)境中的主要調(diào)控子，并參與脂肪沉積的調(diào)控。

圖3 FSHD 巨噬細(xì)胞的KEGG 富集分析Fig.3 Images of KEGG enrichment analysis of FSHD macrophages

2.3.2 不同樣本中巨噬細(xì)胞的極化特征

為深入了解巨噬細(xì)胞在不同樣本之間的狀態(tài)，利用M1 和M2 極化特征基因集計(jì)算了M1 和M2 極化評分[16]。 結(jié)果顯示，重度組巨噬細(xì)胞具有顯著更高的M1 評分（圖4）。 這表明FSHD 中存在M1/M2 型巨噬細(xì)胞的比例失調(diào)，過度的M1 類型激活會(huì)損傷肌肉組織，誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[17]。

圖4 巨噬細(xì)胞M1 和M2 極化評分Fig.4 Images of macrophage M1 and M2 polarization scores

2.3.3 面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥免疫細(xì)胞表達(dá)DUX4直接靶基因

既往研究表明，DUX4 及其靶基因的異常表達(dá)主要發(fā)生在肌源性細(xì)胞中， 但尚未有研究發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞是否也可直接表達(dá)DUX4 及其靶基因[18，19]。 為證實(shí)上述問題，將Yao Z 等[11]鑒定的DUX4 直接靶基因集與筆者研究中免疫細(xì)胞的表達(dá)基因重疊， 結(jié)果表明少量DUX4 直接靶基因也在免疫細(xì)胞中異常表達(dá)（圖5），證實(shí)免疫細(xì)胞可能是FSHD 的非肌源性貢獻(xiàn)者。

圖5 FSHD 免疫細(xì)胞的DUX4 靶基因重疊熱圖Fig. 5 Heat map of DUX4 target gene overlap of FSHD immune cells

2.4 面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥中纖維/脂肪祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性

2.4.1 兩組纖維/脂肪祖細(xì)胞的差異基因

為研究FSHD 組FAPs 的異質(zhì)性， 分別比較了FSHD 重度組、輕度組與對照組之間的DEG，并鑒定了一組與疾病相關(guān)的功能性DEG。 結(jié)果表明，下調(diào)的功能性DEG 在FSHD 兩組間差異很小， 主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞正常功能的基因； 上調(diào)的功能性DEG 在重度組明顯增加，如成脂因子PPARG；促凋亡、促炎癥基因神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子1 基因 （netrin 1 gene，NTN1）、軸突導(dǎo)向受體蛋白3 基因（roundabout guidance receptor 3 gene，ROBO3）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白6 基因（insulin like growth factor binding protein 6 gene，IGFBP6） 等僅在重度組上調(diào)。 此外， 還發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)與FAPs 誘導(dǎo)纖維及脂肪化密切相關(guān)的關(guān)鍵基因： 骨形態(tài)發(fā)生蛋白5 基因 （bone morphogenetic protein 5 gene，BMP5）， 核受體亞家族4A 組成員1 基因（nuclear receptor subfamily 4 group A member 1 gene，NR4A1）， 磷酸二酯酶10A 基因（phosphodiesterase 10A gene，PDE10A） 和PPARG。 以上基因或可作為FAPs 的潛在治療靶點(diǎn)。 其中前3 個(gè)基因在兩組中均差異表達(dá)，與促纖維化狀態(tài)相關(guān)；PPARG 僅在重度組差異表達(dá)，促使FAPs 啟動(dòng)脂肪分化程序，轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞，與重度組中FAPs 介導(dǎo)的脂肪浸潤相關(guān)。 對FSHD 組FAPs 的DEG 進(jìn)行KEGG 功能富集分析，發(fā)現(xiàn)兩組下調(diào)通路差異不明顯，但重度組上調(diào)通路增加了過氧化物酶體增殖物激活受體通路和脂肪細(xì)胞的脂解調(diào)節(jié)通路，提示重度組FAPs 參與了脂質(zhì)沉積的病理過程（圖6）。

圖6 FSHD 中FAPs 的KEGG 富集分析Fig.6 Images of KEGG enrichment analysis of FAPs in FSHD

2.4.2 兩組纖維/脂肪祖細(xì)胞發(fā)育軌跡

為了解FAPs 在FSHD 中的發(fā)育軌跡，對6 個(gè)樣本中的FAPs 重新進(jìn)行了無監(jiān)督聚類分析， 將FAPs分為3 個(gè)亞群，并進(jìn)行了擬時(shí)序分析（圖7）。 結(jié)果表明，F(xiàn)SHD 組與對照組FAPs 的分布存在明顯差異，F(xiàn)SHD 組細(xì)胞多分布于軌跡2， 對照組細(xì)胞多分布于軌跡1。重度組FAPs 中幾種亞群的細(xì)胞同時(shí)存在，說明FAPs 失去了正常肌肉微環(huán)境中協(xié)調(diào)有序的分化狀態(tài)，而始終保持在促纖維化、脂肪替代的病理狀態(tài)。以上結(jié)果提示，F(xiàn)APs 很可能是造成FSHD 肌肉微環(huán)境中持續(xù)性病理性纖維化/脂肪化狀態(tài)的核心參與者，與FSHD 的雙側(cè)肌肉不對稱改變直接相關(guān)。

圖7 FAPs 擬時(shí)間軌跡分析Fig.7 Images of FAPs pseudo time trajectory analysis

3 討論

筆者研究采用單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序分析，全面表征了FSHD 雙側(cè)不對稱病變肌肉的細(xì)胞譜系組成和轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，揭示了免疫細(xì)胞、FAPs 等非肌源性細(xì)胞對FSHD 發(fā)病機(jī)制的貢獻(xiàn)。

FSHD 肌肉組織中共鑒定出10 種細(xì)胞類型，包括肌源性細(xì)胞和免疫細(xì)胞、FAPs 等主要非肌源性細(xì)胞類型。 既往研究表明，脂肪浸潤是DUX4 誘導(dǎo)的肌肉損傷的嚴(yán)重后果，反映了FSHD 疾病的嚴(yán)重程度，與臨床功能表現(xiàn)和疾病進(jìn)展相關(guān)[20]。筆者研究觀察到重度組中肌源性細(xì)胞比例明顯下降，脂肪細(xì)胞比例明顯升高，說明研究結(jié)果與FSHD 臨床表現(xiàn)之間具有一致性。Bosnakovski D 等[21]使用iDUX4pA 小鼠模型進(jìn)行的長期誘導(dǎo)研究表明，持續(xù)表達(dá)DUX4 的營養(yǎng)不良肌肉中含有顯著升高的FAPs，并伴有脈管系統(tǒng)缺陷，包括毛細(xì)血管構(gòu)象異常、 內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌數(shù)量減少等表現(xiàn)，這也與筆者在人類肌肉活檢中發(fā)現(xiàn)的改變一致。

DUX4 在FSHD 中的異常表達(dá)導(dǎo)致淋巴T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的肌內(nèi)浸潤，是FSHD 的主要組織學(xué)特征之一[22，23]。然而，巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞在FSHD 中的功能作用很大程度上仍然是推測性的。 在筆者研究中，F(xiàn)SHD 的免疫細(xì)胞表達(dá)一組與免疫調(diào)節(jié)和免疫炎癥相關(guān)的DEG， 這些基因可直接參與FSHD 的疾病進(jìn)展，造成肌肉微環(huán)境的免疫功能失調(diào)，證實(shí)了免疫細(xì)胞可以直接參與FSHD 疾病進(jìn)展。Banerji CRS 等[24]發(fā)現(xiàn)血液來源的永生化FSHD 淋巴母細(xì)胞系可以直接表達(dá)DUX4 及其靶基因，但迄今尚未有研究在FSHD患者肌肉活檢中明確檢測到免疫細(xì)胞或其他細(xì)胞類型直接表達(dá)DUX4 或其靶基因的證據(jù)。 因此，筆者研究重點(diǎn)關(guān)注了原發(fā)性肌內(nèi)浸潤的免疫細(xì)胞是否直接參與疾病機(jī)制的調(diào)控。 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在少量直接表達(dá)DUX4 靶基因的免疫細(xì)胞，但表達(dá)量較低， 特征基因主要是三結(jié)構(gòu)域蛋白基因（tripartite motif gene，TRIM）家族基因等。 這也證實(shí)了先前體外研究的結(jié)果，即DUX4 可以通過直接攻擊免疫細(xì)胞引發(fā)免疫微環(huán)境失調(diào)和炎癥反應(yīng)，而非僅通過肌源性細(xì)胞的間接作用。 因此，如果免疫系統(tǒng)是FSHD 的一個(gè)直接驅(qū)動(dòng)因素，則可能需要更有針對性的治療進(jìn)行干預(yù)。 此外，筆者研究還發(fā)現(xiàn)了巨噬細(xì)胞在FSHD 疾病進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。重度組肌肉表現(xiàn)出更高程度的巨噬細(xì)胞浸潤和與細(xì)胞吞噬、脂質(zhì)代謝及炎癥相關(guān)的信號(hào)通路上調(diào)，這表明巨噬細(xì)胞可能是FSHD 免疫失調(diào)微環(huán)境中的主要調(diào)控子， 并參與脂肪沉積的調(diào)控，導(dǎo)致肌肉脂肪替代等不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)果，以上發(fā)現(xiàn)可能為新的藥物靶點(diǎn)提供線索。

iDUX4pA 小鼠模型[21]發(fā)現(xiàn)，DUX4 誘導(dǎo)后FAPs的持續(xù)增加支持肌肉微環(huán)境促纖維化狀態(tài)的長期改變。 為了更好地闡明FAPs 在FSHD 患者中的作用，筆者研究通過snRNA-seq 技術(shù)分析了FSHD 肌肉活檢中FAPs 的轉(zhuǎn)錄組特征。 通過對FAPs 的整體分析，發(fā)現(xiàn)重度組FAPs 失去了正常肌肉微環(huán)境中協(xié)調(diào)有序的分化狀態(tài)，始終保持在促纖維化和脂肪浸潤的病理狀態(tài)。因此，F(xiàn)APs 很可能是造成FSHD 肌肉微環(huán)境中持續(xù)性病理性纖維化/脂肪化狀態(tài)的核心參與者，并與FSHD 的雙側(cè)肌肉不對稱改變直接相關(guān)。 FSHD與其他肌營養(yǎng)不良的區(qū)別特征之一是病變肌肉的雙側(cè)不對稱性，這主要與DUX4 引起的肌肉纖維化和脂肪替代程度不同有關(guān)。DUX4 的早期瞬時(shí)表達(dá)對肌肉有非常遠(yuǎn)期甚至是永久性的影響， 并可能導(dǎo)致FAPs的狀態(tài)改變，從而影響肌肉穩(wěn)態(tài)，為以后肌肉受到損傷時(shí)引發(fā)纖維化和脂肪變性做好準(zhǔn)備[19，21]。因此，如果DUX4 的既往表達(dá)促成了病變肌肉微環(huán)境中的促纖維化狀態(tài)，從而不再需要DUX4 的持續(xù)表達(dá)來驅(qū)動(dòng)疾病進(jìn)展，那么抑制后期纖維化的方法對于預(yù)防FSHD疾病進(jìn)展可能變得至關(guān)重要[25，26]。 筆者研究中還發(fā)現(xiàn)NR4A1、PDE10A、BMP5、PPARG 等異?；蚩赡苁菍?dǎo)致FSHD 肌肉纖維化和脂肪浸潤的重要靶點(diǎn)，這些新的見解可能在開發(fā)關(guān)于FAPs 的新治療方法上發(fā)揮積極作用。

最后，筆者研究存在如下局限性。首先，研究只納入了2 例FSHD 的雙側(cè)肌肉樣本進(jìn)行單細(xì)胞核測序，后續(xù)需要更多的樣本來充分探索FSHD 疾病的分子機(jī)制。其次，未來需要通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來確定肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞和FAPs 中涉及的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路及三者之間的相互作用關(guān)系，為FSHD 的靶向治療提供更廣闊的思路。最后，筆者研究結(jié)果僅限于FSHD1 患者肌肉樣本的單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組特征，需要進(jìn)一步的工作來充分表征FSHD2 患者表型和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的相關(guān)性。

4 結(jié)論

筆者研究成功構(gòu)建了FSHD 患者肌肉組織的單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄譜，揭示了FSHD 中雙側(cè)肌肉的細(xì)胞譜系組成和轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性， 探索了免疫細(xì)胞和FAPs 在FSHD 肌肉微環(huán)境中的作用機(jī)制， 并提出CD36、PPARG、LGALS1、BMP5、NR4A1、PDE10A 等異?；蚴菨撛诘闹委煱悬c(diǎn)，有助于FSHD 的治療和預(yù)后。