毛田米

(貴州省地質(zhì)礦產(chǎn)中心實(shí)驗室，貴州 貴陽 550018)

2022年我國稻谷總產(chǎn)量為2億t左右，與上年相比減產(chǎn)了2%，但仍穩(wěn)定在2億t以上水平[1]。雖然我國擁有豐富的稻谷資源，但我國對稻谷的加工水平較低，每年在稻谷的各個加工領(lǐng)域產(chǎn)生了大量富含大米蛋白的副產(chǎn)物如碎米、米渣等，利用這些副產(chǎn)物采用酶法制備大米免疫活性肽可以提高大米的綜合利用率和附加值，具有重要的社會效益和較高的經(jīng)濟(jì)效益。

目前國內(nèi)關(guān)于大米免疫調(diào)節(jié)肽的報道不多，明確氨基酸序列的大米活性肽的報道更是少見。主要由于蛋白酶酶切位點(diǎn)具有一定的隨機(jī)性和不確定性，導(dǎo)致酶解過程中產(chǎn)生了大量分子量大小相近而氨基酸序列不同的肽段[2]。如要對酶法制備的肽進(jìn)行生理功能、結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系的深入研究，就必須先對酶解物進(jìn)行分離純化與鑒定。

本研究擬以小鼠巨噬細(xì)胞增殖指數(shù)SI為考察指標(biāo)，采用凝膠過濾色譜對試驗前期經(jīng)大孔吸附樹脂色譜、001×7強(qiáng)陽離子交換樹脂色譜分離得到的具有較高免疫活性的001×7-pH 7組分進(jìn)一步分離純化，探索凝膠色譜分離純化大米免疫活性肽的試驗條件，以期從大米蛋白酶解物中分離得到免疫活性更強(qiáng)、純度更高的組分。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑與設(shè)備

1.1.1 試驗原料與試劑

Sephadex G-10葡聚糖凝膠，Sigma公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉(AR)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞，贏潤生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗儀器

玻璃層析柱(1.6×100 cm)，上海華美試驗儀器廠；DELTA320 pH計，江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗儀器廠；自動核酸蛋白分離層析儀、HD-A電腦采集器，上海青浦滬西儀器廠；EV311型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京萊伯泰科食品有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵，鞏義市予華食品有限公司；FD-1型真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司；HH CP-01型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠；MLS-3750型滅菌鍋，日本三洋有限公司；SW-OJ-1FD型超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DNM-9602型酶標(biāo)分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.1.3 大米免疫活性肽的來源

本文研究對象為從大米蛋白胰蛋白酶酶解物中經(jīng)大孔吸附樹脂色譜、001×7強(qiáng)陽離子交換樹脂色譜得到的具有較高免疫活性的001×7-pH 7組分。

1.2 試驗方法

1.2.1 凝膠前處理

將一定量Sephadex G-10葡聚糖凝膠溶于水后經(jīng)沸水溶脹2 h，冷卻至室溫，真空抽濾去除氣體后裝柱；將1.6 cm×100 cm的玻璃層析柱垂直固定在蛋白純化儀的支架上，將預(yù)處理好的Sephadex G-10緩慢裝入層析柱中，先加入蒸餾水，蒸餾水體積占柱體積10%～15%為宜，后緩慢加入膠液，保證凝膠液面水平，打開出液口排出多余蒸餾水，使柱內(nèi)膠面上部保留2～3 cm蒸餾水為宜；再將玻璃層析柱上兩端的進(jìn)出液管口分別與儀器上相應(yīng)的進(jìn)出液位置相連，打開機(jī)器，用3～5倍柱體積蒸餾水沖洗機(jī)器和柱子，待機(jī)器紫外檢測值穩(wěn)定后上樣[3]。

1.2.2 不同洗脫劑種類對凝膠色譜分離效果的影響

稱取001×7-pH 7經(jīng)冷凍干燥的組分0.12 g分別用不同pH值的緩沖液充分溶解：檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(0.05 mol/L，pH 5.0)、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.0)、蒸餾水、Na2CO3-NaHCO3緩沖液(0.05 mol/L，pH 10.0)，配制成4 mL濃度為30 mg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm孔徑的濾膜進(jìn)行過濾后上樣，分別以對應(yīng)pH的緩沖液或蒸餾水在15 mL/h洗脫速度下進(jìn)行洗脫，同時用紫外檢測器在220 nm處進(jìn)行檢測。

1.2.3 不同上樣濃度對凝膠色譜分離效果的影響

分別稱取001×7-pH 7經(jīng)冷凍干燥的組分0.10 g，0.12 g，0.14 g，0.16 g，充分溶解于4 mL蒸餾水，配制成濃度分別為25 mg/mL、30 mg/mL、35 mg/mL、40 mg/mL的樣品溶液，經(jīng)0.45 μm孔徑的濾膜進(jìn)行過濾后上樣，分別以蒸餾水在15 mL/h洗脫速度下進(jìn)行洗脫，同時用紫外檢測器在220 nm處進(jìn)行檢測。

1.2.4 不同洗脫流速對凝膠色譜分離效果的影響

稱取001×7-pH 7經(jīng)冷凍干燥的組分0.12 g用蒸餾水充分溶解，配制成4 mL濃度為30 mg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm孔徑的濾膜進(jìn)行過濾后上樣，以蒸餾水進(jìn)行洗脫，洗脫速度分別為10 mL/h、15 mL/h、20 mL/h、25 mL/h，同時用紫外檢測器在220 nm處進(jìn)行檢測。

對照凝膠色譜圖選擇合適的洗脫劑、上樣濃度和洗脫速度，從而確定凝膠過濾色譜的試驗條件。繼而，在該分離條件下進(jìn)行分離純化，收集各洗脫組分進(jìn)行旋蒸、冷凍干燥，以SI值(增殖指數(shù)：stimulating idex，SI)為考察指標(biāo)，通過MTT試驗檢測各洗脫組分對小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力的影響，篩選出免疫活性最強(qiáng)的組分。

1.2.5 MTT試驗

小鼠巨噬細(xì)胞增殖試驗采用MTT法，取對數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞，細(xì)胞濃度為7×105個/mL、100 μL接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h后，加入大米免疫活性肽，空白對照組加等量的無菌水，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育20 h；在終止孵育前4 h加入20 μL MTT(5 mg/L)；棄掉每孔中的液體，向孔中加入150 μL二甲基亞砜，避光條件下輕震5 min[4]，在492 nm采用酶標(biāo)儀檢測吸光度(OD值)，并按下式計算SI值。

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同洗脫劑種類對凝膠色譜分離效果的影響

本研究在確定上樣濃度30 mg/mL、上樣量4 mL、洗脫速度15 mL/h的條件下，考察了蒸餾水、pH 5.0檸檬酸-Na2HPO4、pH 7.0 NaH2PO4-Na2HPO4、pH 10.0 Na2CO3-NaHCO34種緩沖液對凝膠色譜分離效果的影響，圖1為采用不同種類緩沖液洗脫時Sephadex G-10對組分001×7-pH 7進(jìn)行分離的凝膠色譜圖。

比較圖1可以看出，以蒸餾水作為洗脫劑時的分離效果要好于以緩沖液作為洗脫劑時的分離效果。圖1a、圖1b分別是以pH 5.0和pH 7.0緩沖液作為洗脫劑的凝膠色譜圖，明顯可看出這兩種pH值的緩沖液分離效果不好，第一個峰與后面的峰完全沒有分開；圖1d為pH 10.0緩沖液的凝膠色譜圖，其分離效果較pH 5.0、pH 7.0緩沖液要好，有4個洗脫峰，但峰形不好，沒有呈正態(tài)分布。通過比較可知，以蒸餾水為洗脫劑時分離效果最好，分辨率高，峰形呈正態(tài)分布，如圖1c所示，因此最終選擇蒸餾水為最佳洗脫劑。

2.2 不同上樣濃度對凝膠色譜分離效果的影響

在上樣量4 mL、流速15 mL/h、洗脫劑為蒸餾水的條件下，主要考察了不同上樣濃度(25、30、35、40 mg/mL)對凝膠色譜分離效果的影響，圖2為用不同上樣濃度洗脫時Sephadex G-10對組分001×7-pH 7進(jìn)行分離的凝膠色譜圖。

由圖2可知，以蒸餾水為洗脫劑，洗脫速度保持在15 mL/h恒定不變時，上樣濃度在25～35 mg/mL范圍內(nèi)，分離效果較好，分辨率高，峰的形狀較好，呈正態(tài)分布；當(dāng)上樣濃度達(dá)到40 mg/mL時，峰與峰之間的分離較差，分辨率下降，造成分離效果變差的原因可能是濃度過高使流動相不穩(wěn)定，從而使洗脫峰變形或重疊[5]；對分離效果較好的3個圖進(jìn)行比較，最終選擇30 mg/mL為最佳上樣濃度，在該濃度下分離效果最好，峰形呈正態(tài)分布，且濃度又不至于過低而影響分離組分的收集。

2.3 不同洗脫速度對凝膠色譜分離效果的影響

在上樣濃度30 mg/mL、上樣量4 mL、洗脫劑為蒸餾水的條件下，主要考察了不同洗脫速度(10、15、20、25 mL/h)對凝膠色譜分離效果的影響，圖3為用不同洗脫速度洗脫時Sephadex G-10對組分001×7-pH 7進(jìn)行分離的凝膠色譜圖。

由圖3可知，隨著洗脫速度的增大，出峰時間縮短，峰寬變窄，峰的高度下降，峰面積相應(yīng)的減小，分離效果都比較好，分辨率較高，峰形呈正態(tài)分布，說明流速在15～25 mL/h對分離效果的影響較小。緩慢的流速可使樣品與凝膠基質(zhì)充分平衡，達(dá)到理想的分離效果，如圖3b所示；流速過低會造成樣品在凝膠床內(nèi)的橫向擴(kuò)散增大，使峰寬變寬，降低分辨率。此外，還延長了洗脫時間，降低工作效率，如圖3a所示；流速過高會增大柱壓，不僅會對凝膠造成機(jī)械損傷，還會影響分離效果[5]。充分考慮峰形、分辨率及工作效率等因素，最終選擇15 mL/h為最佳洗脫速度，在該洗脫速度下的分離效果最好。

2.4 凝膠過濾色譜洗脫組分的MTT試驗結(jié)果分析

圖5中，**與pH 7組分相比，差異極其顯著P< 0.01；pH 7為未經(jīng)凝膠色譜分離的大米免疫活性肽。

以蒸餾水為洗脫劑，采用上樣體積4 mL、上樣濃度30 mg/mL、洗脫速度15 mL/h的凝膠過濾色譜分離條件對001×7-pH 7組分進(jìn)行分離純化，得到4個組分F1、F2、F3、F4，結(jié)果如圖4所示，收集這4個組分進(jìn)行MTT試驗，結(jié)果如圖5所示。從圖5可知，經(jīng)Sephadex G-10分離得到的4個洗脫組分的SI值均高于未經(jīng)凝膠色譜分離的001×7-pH 7組分(1.319，125 μg/mL)，其中F4組分的SI值最大，為1.518(125 μg/mL)，與001×7-pH 7組分相比，F(xiàn)4組分對小鼠巨噬細(xì)胞增殖具有極顯著的促進(jìn)作用(P<0.01)。肽鏈的長度與生物活性有密切的關(guān)系[6]，已有研究報道，肽分子量大小對免疫細(xì)胞的增殖活性具有顯著的影響[7]。Hu Hou等[8]采用Sephadex G-15對阿拉斯加魚骨架蛋白胰蛋白酶酶解物進(jìn)行分離純化，研究發(fā)現(xiàn)分子量較低的P4組分顯著的促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖，與本試驗結(jié)果相符；李艷偉等[9]采用Sephadex G-15凝膠過濾色譜對豬血蛋白胰蛋白酶酶解物進(jìn)行分離純化，研究發(fā)現(xiàn)分子量較低的組分D具有較強(qiáng)的免疫活性。

色譜柱：1.6 cm×100 cm；檢測波長：220 nm；上樣量：30 mg/mL，4 mL；洗脫劑：蒸餾水，流速：15 mL/h圖4 最佳分離條件下SephadexG-10分離001×7-pH 7組分的圖譜Fig.4 The separation of fraction 001×7-pH 7 by Sephadex G-10 gel filtration chromatography under the optimal condition

圖5 各洗脫組分F(1～4)對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖活性的影響Fig.5 The effect of fractions F(1～4)on proliferation of Mouse Macrophage RAW264.7

3 結(jié) 論

(1)凝膠過濾色譜分離純化001×7-pH 7組分的較優(yōu)試驗條件：樹脂類型Sephadex G-10；色譜柱1.6 cm×100 cm；檢測波長220 nm；上樣體積4 mL；洗脫劑蒸餾水；上樣濃度30 mg/mL；洗脫速度15 mL/h。

(2)MTT試驗發(fā)現(xiàn)在較優(yōu)試驗條件下經(jīng)Sephadex G-10分離所得的4個洗脫組分的SI值均高于未經(jīng)凝膠色譜分離的001×7-pH 7組分(1.319，125 μg/mL)，其中F4組分的SI值最大，為1.518(125 μg/mL)，與001×7-pH 7組分相比，F(xiàn)4組分對小鼠巨噬細(xì)胞增殖具有極顯著的促進(jìn)作用(P<0.01)。