張亞碩，阿如娜，馬鑫彥，龐宗然，魯碧楠

（中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081）

非酒精性脂肪性肝?。∟on-Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是指除外由酒精和其他對肝臟有明確損害致病因素所引起的，以脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)過度沉積為主要病變特征的臨床病理綜合征[1]。與肥胖、脂代謝紊亂、糖尿病等多種代謝性疾病有緊密關(guān)聯(lián)[2]。近年來，NAFLD 發(fā)病率逐年攀升，2019 年的一項Meta 分析顯示[3]，在全球NAFLD 患病率中亞洲NAFLD 總體患病率為30%，中國大陸NAFLD 患病率也接近30%。NAFLD 是肥胖和T2DM 常見的并發(fā)癥，極大的增加了這些慢性代謝性疾病的復(fù)雜性，并導(dǎo)致患者食欲不振，體能減弱，腹部會出現(xiàn)脹痛，對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的不利影響[4-7]。目前針對NAFLD 多采用飲食調(diào)理、加強鍛煉、減肥手術(shù)治療代謝狀態(tài)、抗氧化保肝藥等手段，達(dá)到了一定的干預(yù)作用。然而，對于NAFLD 的治療，目前還沒有美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)上市的特效藥。所以對于NAFLD 的發(fā)病機制全面并且不斷的深化研究以及開發(fā)治療NAFLD 新藥物至關(guān)重要。以中醫(yī)藥為基礎(chǔ)開發(fā)抗非酒精性脂肪肝藥物具有辨證論治和多成分、多靶點、多途徑的治療優(yōu)勢和特色。

荔枝核別名荔仁，形狀大致為圓形或長圓形，其表面光滑亮澤，顏色呈棕色或棕紅色。是我國民間常用的藥食兩用植物，具有理氣、祛寒、止痛等功效。荔枝核的藥理研究表明其具有三大作用包括抗氧化、降血糖、保肝[8]。已有實驗證實荔枝核具有抑制乙肝病毒，抗肝纖維化，抗肝損傷等保肝作用[9]。有動物實驗證實，對于肝炎模型動物，肝組織及血清超氧化物歧化酶（SOD），荔枝核具有提高其活力的作用，以及降低丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性的作用，使肝細(xì)胞免受肝類疾病損傷，從而實現(xiàn)治療肝損傷作用[8]。已有實驗證實，用給非酒精性脂肪性肝病大鼠模型灌胃荔枝核提取物，可使治療組大鼠肝臟的脂肪變性、炎癥和壞死改善，并顯著降低丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇[10]。但到目前為止，尚不明確荔枝核延緩非酒精性脂肪性肝病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過計算機技術(shù)檢索各類數(shù)據(jù)庫信息，收集與有效化合物、疾病有關(guān)靶點，篩選并預(yù)測出最佳靶點及通路[11]。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)用于中藥藥效物質(zhì)和作用機理的研究，因為中藥的特點包括多成分、多靶點、多途徑、整體調(diào)控等，所以中藥結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)會成為中藥研究的新方法[12]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探究預(yù)測荔枝核治療非酒精性脂肪肝的作用機制，并通過功能和通路富集分析得到荔枝核治療非酒精性脂肪肝的的相關(guān)信號通路和靶點，最后通過實驗和分子對接進(jìn)行驗證，為荔枝核提取物在防治NAFLD 的應(yīng)用和開發(fā)方面提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C57BL/6 雄性小鼠 SPF 級，8 周齡，（20±2 g），60 只，本研究動物實驗倫理經(jīng)中央民族大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)倫理審查委員會審批通過，審查號為：ECMUC-2021002A0。所有動物實驗符合《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南》要求；荔枝核 北京同仁堂提供，中央民族大學(xué)藥學(xué)院臨床中藥學(xué)教研室鑒定為無患子科植物荔枝（Litchi chinensisSonn.）的干燥種子；鹽酸二甲雙胍片 華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司；小鼠血清生化指標(biāo)試劑盒 南京建成生物科技有限公司；4%多聚甲醛固定液 Biosharp 公司；HFD 飼料（D12492，60%脂肪供能比）/LFD 飼料（D12450J，10%脂肪供能比） 斯貝福生物技術(shù)有限公司。

正置白光拍照顯微鏡 Nikon 公司；RNA 提取液 Servicebio 公司；熒光定量PCR 儀 Bio-rad 公司；冷凍干燥機 北京科德遠(yuǎn)揚科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 篩選荔枝核活性成分 有相關(guān)文獻(xiàn)研究表明，荔枝核具有很多藥效成分，其藥理作用研究表明有保肝作用[8]。通過TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫以“荔枝核”為關(guān)鍵詞，收集荔枝核化學(xué)組成成分，按照化學(xué)成分的藥動學(xué)參數(shù)[吸收、分布、代謝及排泄（ADME）]進(jìn)行其活性成分篩選，將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥20%、類藥性（druglikeness，DL）≥0.1[13]作為篩選條件。

1.2.2 荔枝核活性成分靶點預(yù)測 在TCMSP 上篩選出的荔枝核的活性成分通過Uniprot（https://www.uniprot.org/）網(wǎng)站將蛋白質(zhì)名稱轉(zhuǎn)化為Gene Symbol，將“Homo sapiens”設(shè)定為物種類型，得到靶點名稱并去重[14]，篩選藥物靶點。

1.2.3 非酒精性脂肪性肝病靶點獲取 通過兩個數(shù)據(jù)平臺GeneCards（https://www.genecards.org/）和 OMIM（https://omim.org/），以“non-alcoholic fatty liver disease”“NAFLD”等為檢索關(guān)鍵詞，獲取 NAFLD 靶點；借助UniProt（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，將“Homo sapiens”設(shè)定為物種類型，得到靶點名稱并去重，建立疾病靶點庫。

1.2.4 關(guān)鍵靶點獲取 分別將荔枝核活性成分靶點和非酒精性脂肪性肝病靶點輸入在線平臺（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）制作靶點韋恩圖，獲取關(guān)鍵靶點。

1.2.5 構(gòu)建成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò) 將藥物和疾病的交集基因?qū)朐诰€平臺STRING（https://cn.string-db.org/）[15]，設(shè)定物種類型為“Homo sapiens”，可信度值設(shè)為0.4，即可得到PPI 互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.6 關(guān)鍵靶點富集分析 利用數(shù)據(jù)庫，輸入疾病與靶點的交集基因，進(jìn)行生物富集分析和GO 分析以及KEGG 分析，以“Homo sapiens”為物種的設(shè)定類型，P＜0.05 認(rèn)為具有顯著差異，并將結(jié)果可視化。

1.2.7 “成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖建立 利用Cytoscape3.9 軟件平臺獲取“成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.8 荔枝核乙醇提取物制備 荔枝核種子經(jīng)過破壁機粉碎后，放入燒瓶中加入75%的乙醇，以荔枝核與乙醇質(zhì)量為1:20 的比例進(jìn)行回流提取有效成分，每次回流提取2.5 h，回流兩次，合并藥液，合并兩次得到的藥液用冷凍干燥機干燥制得粉末，粉末加入等比例的水制成低、中、高濃度劑量放入冰箱中冷藏備用。

1.2.9 實驗動物及模型建立 動物每天進(jìn)食進(jìn)水，22 ℃設(shè)為飼養(yǎng)環(huán)境的保持溫度，飼養(yǎng)環(huán)境的保持濕度為50%～60%，一天分別光照12 h，黑暗時間12 h。先適應(yīng)性飼養(yǎng)一周實驗動物，然后開始建立DIO（飲食誘導(dǎo)的肥胖）小鼠模型，實驗組給予HFD 飼料喂養(yǎng)（D12492，60%脂肪供能比），對照組飼以LFD 飼料（D12450J，10%脂肪供能比），共18 周。

1.2.10 分組及給藥 將DIO 小鼠隨機分為六組，每組10 只，分別為模型組（model），二甲雙胍陽性對照組（MET），荔枝核提高劑量組（LZH-H），荔枝核中劑量組（LZH-M），荔枝核低劑量組（LZH-L），另選取10 只相同周齡的LFD 小鼠作為空白組（control）。設(shè)置低、中、高給藥劑量分別為65、260、 1040 mg·kg-1，每日一次。模型組與空白組：每日給予相同容積的溶媒（蒸餾水）。每個組將10 mg·kg-1設(shè)定為給藥量，連續(xù)給藥6 周。

1.2.11 HE 染色 小鼠肝臟取材后對小鼠肝臟組織切片成相同大小進(jìn)行HE 染色，觀察各組肝臟空泡化程度和脂肪油滴量。

1.2.12 試劑盒檢測小鼠血清ALT、AST、TG、TC含量 小鼠處死后，取血清于高速離心機4500 r/min，10 min，靜置取上層，用血清生化儀進(jìn)行分析。

1.2.13 熒光定量PCR 小鼠肝臟取材后各組取3 只小鼠肝臟研磨，分別提取各組RNA，取100 mg組織，加入到勻漿管中研磨，12000 r/min 離心10 min取上清，加入250 μL 三氯甲烷，顛倒離心管15 s，充分混勻，靜置3 min，4 ℃下12000 r/min 離心10 min，將400 μL 上清轉(zhuǎn)移到新的離心管加入0.8 倍體積的異丙醇混勻，-20 ℃放置15 min。4 ℃下12000 r/min離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA。加入15 μL Water Nuclease-Free 溶解RNA，55 ℃孵育5 min，使用Nanodrop 2000 檢測RNA 濃度及純度，并將濃度稀釋到200 ng/μL，然后配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，分別加入5 × Reaction Buffer 4 μL，Oligo （dT）18 Primer（100 μmol/L）0.5 μL，Random Hexamer primer （100μmol/L） 0.5 μL，Servicebio?RT Enzyme Mix 1 μL，提取的RNA×10 μL，最后再加入RNase free water使反應(yīng)體系到20 μL 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取0.2 ml PCR 管，配制反應(yīng)體系，加入2×qPCR Mix 7.5 μL，2.5 μmol/L基因引物（上游+下游）1.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）2.0 μL，Water Nuclease-Free 4.0 μL 進(jìn)行PCR 擴增，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3 管分別在95 ℃，30 s 預(yù)變性，95 ℃，15 s 及65 ℃→95 ℃變性。60 ℃，30 s 退火/延伸共40 個循環(huán)，每升溫0.5 ℃，采集一次熒光信號，用ΔΔCT 法處理結(jié)果，得出數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析使用SPSS19.0 軟件，每組實驗數(shù)據(jù)重復(fù)測量三次，方差分析用xˉ±s 表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行組間多重比較，數(shù)據(jù)都保留兩位有效數(shù)字，繪圖軟件用GraphPad Prism 8.0.1 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝核乙醇提取物組分及靶點

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，當(dāng)條件設(shè)定為OB≥20%、DL≥0.1 時，篩選得到21 個荔枝核成分，其中18 個有效成分和358 個靶點基因。荔枝核提取物有效成分見表1，其余不符合篩選條件的為荔枝核提取物其他成分，見表2。

表1 荔枝核提取物有效成分Table 1 Litchi kernel active ingredients

表2 荔枝核提取物其他成分Table 2 Other components of lychee kernel extract

2.2 疾病靶點預(yù)測與篩選

如圖1，疾病靶點通過兩個數(shù)據(jù)平臺GeneCards和OMIM 預(yù)測得到，得到623 個與非酒精性脂肪性肝病有關(guān)的疾病靶點，通過韋恩圖取交集得到52 個疾病與藥物交集基因（見表3）。

圖1 藥物與疾病靶點交集圖Fig.1 Intersection of drug and disease target

表3 52 個交集基因Table 3 52 intersecting genes

2.3 荔枝核蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析

將荔枝核與非酒精性脂肪性肝病得到的交集靶點基因上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫，以Homo sapiens 為物種類型，進(jìn)行分析，以中等置信度＞0.4 為篩選條件[16]，下載其tsv 格式的數(shù)據(jù)表格，將表格導(dǎo)入Cytoscape3.9.0 軟件中，利用cytoNCA 插件，依據(jù)介數(shù)中心數(shù)根據(jù)節(jié)點之間路徑通過的邊數(shù)或者邊權(quán)重的大小進(jìn)行排序。結(jié)果見圖2，其中INS、TNF、HSP90AA1、PPARG、PPARA 為關(guān)聯(lián)最為密切的基因靶點。

圖2 荔枝核蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Litchi nucleoprotein interaction network diagram

2.4 GO 和KEGG 富集分析

對荔枝核治療NAFLD 的潛在的52 個靶點通過metascape 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果顯示（如圖3）GO 功能富集分析中得到生物過程（BP）條目484 條，細(xì)胞組成（CC）條目7 條，分子功能（MF）條目 74 條，GO 富集分析可得22 個差異基因參與的生物過程主要是氧化應(yīng)激的過程（response to oxidative stress）（P＜0.01），細(xì)胞組分主要是膜微區(qū)（membrane microdomain）、脂筏（membrane raft）（P＜0.01），分子功能主要為蛋白酶結(jié)合（P＜0.01）；

圖3 GO 荔枝核治療NAFLD 疾病的主要靶點的GO 富集分析結(jié)果Fig.3 GO enrichment analysis results of the main targets of GO litchi nucleus in the treatment of NAFLD disease

KEGG 通路富集篩選取前20 條信號通路（P＜0.05），結(jié)果顯示（如圖4）涉及癌癥通路（pathways in cancer）、動脈粥樣硬化通路（Fluid shear stress and atherosclerosis）、糖尿病并發(fā)癥的信號通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、氧化應(yīng)激通路（Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species）等，通過微生信網(wǎng)站將結(jié)果可視化。

圖4 KEGG 富集分析結(jié)果Fig.4 Results of KEGG enrichment analysis

2.5 “成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及分析

通過Cytoscape 3.9.0 軟件構(gòu)建“成分-靶點-通路-疾病”四部分聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示（如圖5）Excel“荔枝核成分-靶點”“靶點-作用通路”“疾病-作用通路”的列表，將其導(dǎo)入 Cytoscape3.9.0 中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。按“介數(shù)中心數(shù)”值調(diào)節(jié)節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的大小。18 個有效成分中，與通路直接作用的成分有5 個，分別是EIC、亞油酸甲酯（METHYL LINOLEATE）、β-廣藿烯（β-patchoulene）、谷甾醇（sitogluside）、鈷烯（copaene）等，也充分說明荔枝核是多成分-多靶點在NAFLD 中發(fā)揮作用。

圖5 “成分-靶點-通路-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 "Component-target-pathway-disease" interaction network diagram

2.6 分子對接結(jié)果

如圖6，根據(jù)PPI 互作網(wǎng)絡(luò)分析的靶點結(jié)果，對互作關(guān)系最密切的五個靶點做了分子對接驗證，我們得到以下結(jié)果：化合物和靶點蛋白存在很好的結(jié)合作用。且五個對接結(jié)果的結(jié)合能均小于-3.8 kJ/mol，具體結(jié)合能見表4，據(jù)結(jié)合模式可以很清晰的看到化合物與蛋白口袋相結(jié)合的氨基酸殘基，如：LZH 與INS、HSP90AA1、PPARA、PPARG 結(jié)合的活性氨基酸殘基有ALA-14、ASN-106、GLN-277、TYR-119、GLU-314 等。

圖6 LZH 與INS、TNF、HSP90AA1、PPARG、PPARA 結(jié)合Fig.6 LZH is combined with INS, TNF, HSP90AA1, PPARG, PPARA

表4 分子對接結(jié)合能Table 4 Molecular docking binding energy

2.7 荔枝核提取物對小鼠肝臟脂肪病變的影響

如圖7 所示，正常組（CON）小鼠的肝細(xì)胞排列有序，厚薄均勻且富含彈性的結(jié)締組織構(gòu)成了正常組的肝細(xì)胞，肝小葉中央為中央靜脈，肝細(xì)胞和肝血竇在其周圍以放射狀形狀排布，肝細(xì)胞排列規(guī)則、整齊，肝竇無明顯擴張或擠壓；未見明顯炎癥改變（如圖中方框圈出區(qū)域）。模型組（MOD）小鼠中央靜脈、匯管區(qū)周圍及肝實質(zhì)內(nèi)均可見大量的肝細(xì)胞呈氣球樣變，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染，多見胞質(zhì)呈空泡狀，多見肝細(xì)胞脂肪變性，可以看到，胞質(zhì)內(nèi)有數(shù)量不等的圓形空泡（如圖中方框圈出區(qū)域）。荔枝核提取物介入治療后，給藥組低中高劑量組中肝臟組織結(jié)構(gòu)均得到改善，肝細(xì)胞排列有序，組織結(jié)構(gòu)清晰，脂質(zhì)液泡不明顯，接近于對照組（如圖中方框圈出區(qū)域），意味著荔枝核提取物可以減少肝臟組織中的脂肪沉積并改善肝臟組織結(jié)構(gòu)。

圖7 小鼠肝臟HE 染色結(jié)果（200×）Fig.7 Results of HE staining of mouse liver (200×)

2.8 荔枝核提取物對小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和脂代謝的影響

如圖8 與對照組相比，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活性在模型組中顯著升高，經(jīng)荔枝核提取物干預(yù)后有所降低，說明荔枝核提取物對NAFLD 小鼠肝功能保護(hù)具有良好效果。

圖8 小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶AST、ALT 的變化Fig.8 Changes of serum aminotransferase AST and ALT in mice

如圖9 與模型組相比，荔枝核提取物可以明顯降低小鼠血清膽固醇（TC）（圖9A）、甘油三酯（TG）（圖9B）和低密度脂蛋白（LDLC）（圖9C）含量及提高高密度脂（HDLC）（圖9D）蛋白含量，這一結(jié)果說明荔枝核提取物有明顯改善NAFLD 小鼠血脂代謝紊亂的作用。

圖9 小鼠脂代謝變化Fig.9 Changes in lipid metabolism in mice

2.9 熒光定量PCR 實驗驗證

分別對各組取3 只樣本對其進(jìn)行PCR 操作，同時選用PPI 互作網(wǎng)絡(luò)得到的關(guān)系最密切的前三個基因做目的基因。由圖10 可知，與模型組相比，荔枝核提取物對INS（A）基因表達(dá)影響不大，INS 基因表達(dá)倍數(shù)基本相同；與模型組相比，荔枝核提取物高劑量組有降低主要調(diào)控炎癥反應(yīng)的腫瘤壞死因子TNF（B）基因的表達(dá)的趨勢，由于樣本量較少，統(tǒng)計學(xué)差異并不明顯；與模型組相比，荔枝核提取物高劑量組有降低熱休克蛋白HSP90AA1（C）基因表達(dá)的趨勢，而低、中劑量組則對HSP90AA1 表達(dá)基本無影響，由于樣本量較少，統(tǒng)計學(xué)差異并不明顯。這一結(jié)果說明荔枝核提取物可能是通過調(diào)控TNF、HSP90AA1 基因表達(dá)來發(fā)揮治療NAFLD 的作用。后續(xù)將加大樣本量再次對TNF 和HSP90AA1 的基因表達(dá)進(jìn)行驗證。

圖10 熒光定量INS、TNF、HSP90AA1 基因表達(dá)Fig.10 Fluorescence quantitative expression of INS, TNF, HSP90AA1 genes

3 討論與結(jié)論

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）主要是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主，包括肝臟脂肪合成。病因包括飲食、代謝、遺傳、腸道微生態(tài)及炎癥等引起的以肝臟損傷為主要表現(xiàn)的代謝綜合征。因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的與代謝相關(guān)的通路以及炎癥通路符合實際情況。

PPI 核心靶點INS、TNF、HSP90AA1、PPARG、PPARA 等化合物可能是荔枝核提取物治療非酒精性脂肪性肝病的關(guān)鍵成分。INS 基因編碼胰島素，胰島素是一種肽激素，主要調(diào)節(jié)碳水化合物和脂質(zhì)代謝[17]。TNF 基因包括TNF-α，其主要控制著炎癥發(fā)展過程，是一種主要的促炎因子，參與包括炎癥、增殖、凋亡和浸潤與轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)效應(yīng)[18]。國外研究提示，口服亞油酸和雙歧桿菌患者肝臟及脂肪組織中不飽和脂肪酸含量明顯增多，炎癥細(xì)胞因子TNF-α及干擾素γ含量下降[19]。說明TNF 與可能與脂肪的合成有相互關(guān)系。

GO 富集分析結(jié)果表明，荔枝核提取物治療非酒精性脂肪肝的機制主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、小分子代謝過程等生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是NAFLD 疾病中從SFL 進(jìn)展到NASH 過程中對肝臟一個非常重要的打擊因素，可引起活性氧產(chǎn)物（ROS）的產(chǎn)生增多、線粒體結(jié)構(gòu)功能紊亂等。有研究表明，使用一些抗氧化劑可通過減少氧化應(yīng)激，對肝臟脂肪變性產(chǎn)生預(yù)防和治療作用。抑制氧化應(yīng)激可能是荔枝核提取物改善小鼠非酒精性脂肪肝的重要機制。

KEGG 富集分析說明，荔枝核提取物的主要活性成分可能是通過介導(dǎo)癌癥通路、動脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥的信號通路、氧化應(yīng)激通路等途徑治療非酒精性脂肪肝。 荔枝核提取物治療或許可以作用于PNNS，增強神經(jīng)元活性和突觸可塑性。荔枝核提取物可能通過心血管相關(guān)機制改善認(rèn)知行為[18]。

分子對接結(jié)果表明，荔枝核提取物含有多個供受體，荔枝核提取物能夠與 INS、TNF、 HSP90AA1、PPARG、PPARA 靶點蛋白的氨基酸的活性基團(tuán)形成較強氫鍵相互作用，與口袋的疏水性殘基形成疏水相互作用，共軛相互作用等，從而促進(jìn)小分子與蛋白位點的結(jié)合，該結(jié)果驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果， 荔枝核提取物與INS、TNF、HSP90AA1、PPARG、PPARA 蛋白靶點匹配好，是潛在的有治療活性的化合物。

由實驗結(jié)果分析可得，荔枝核提取物高劑量組給藥對小鼠肝臟效果良好，小鼠肝臟肝細(xì)胞排列規(guī)則，脂肪變性和炎癥改變并不明顯。給藥干預(yù)后，血清甘油三酯和膽固醇的相關(guān)指標(biāo)也有所降低，轉(zhuǎn)氨酶的活性也有所降低，說明荔枝核提取物能夠很好的預(yù)防非酒精性脂肪性肝病。

根據(jù)熒光定量PCR 驗證結(jié)果可得，由圖10A可知，各組INS 基因表達(dá)相似，各組均無顯著性差異，給藥組對小鼠INS 基因的表達(dá)并不起作用，這與我們前期做的動物實驗荔枝核提取物對小鼠降糖效果并不明顯的實驗結(jié)果如出一轍，說明荔枝核提取物對INS 基因的表達(dá)調(diào)控作用影響不大；由圖10B 可得，二甲雙胍陽性藥使TNF 基因表達(dá)降低，腫瘤壞死因子TNF 主要調(diào)控體內(nèi)的炎癥、免疫反應(yīng)，病理條件下，TNF 基因的過多表達(dá)會引起一系列的炎癥，導(dǎo)致機體細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死等，圖中結(jié)果可以看出給藥組低中高劑量組也能使TNF 基因表達(dá)降低，說明荔枝核提取物能夠降低炎癥因子的表達(dá)，荔枝核提取物可能是通過緩解炎癥反應(yīng)來發(fā)揮治療非酒精性脂肪性肝病的作用，不過統(tǒng)計學(xué)差異不大（P＞0.05）,實驗數(shù)據(jù)量少，存在一定的局限性；由圖10C 可得，熱休克蛋白HSP90AA1 基因表達(dá)在模型組中表達(dá)量較高，HSP90AA1 其具有高度保守性，具有包括細(xì)胞保護(hù)、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，給藥低中劑量組對HSP90AA1 的基因表達(dá)影響不大，但是陽性藥組卻可以降低HSP90AA1 的基因表達(dá)，本實驗具有一定的局限性，并且HSP90AA1 基因在肝臟方面的文獻(xiàn)報道較少，荔枝核藥物對NAFLD 疾病的治療作用在HSP90AA1 基因表達(dá)上尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

本實驗運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，預(yù)測了荔枝核提取物治療非酒精性脂肪性肝病的活性成分與重要靶點，然后用STRING 數(shù)據(jù)庫對荔枝核有效成分與NAFLD疾病靶點做互作網(wǎng)絡(luò)分析，并進(jìn)一步采用分子對接對互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系密切的五個靶點進(jìn)行驗證，以及動物體外實驗對荔枝核提取物的藥效進(jìn)行了進(jìn)一步探索，初步明確了荔枝核提取物的主要活性成分可能是多靶點、多途徑抑制脂質(zhì)從頭合成和氧化應(yīng)激從而發(fā)揮抗脂肪肝作用，為后續(xù)荔枝核提取物的抗非酒精性脂肪性肝病分子機制作用的深入研究思路提供了一定方向。