李夢雨,孫玉江,李超程,呂毅航,范洪先,鄭新寶,肖海霞,賈斌*

(1 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,新疆 石河子 832003;2 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 青島 266109;3 新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所,新疆 烏魯木齊 830000)

阿膠和驢乳產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展,使驢皮和驢乳出現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)狀,驢繁殖力低成為制約驢產(chǎn)業(yè)發(fā)展最直接的問題[1]。因此,研究驢的性控技術(shù),擴大繁殖母驢數(shù)量,實現(xiàn)高效快速擴繁種群,定向培育母畜群體勢在必行。

睪丸決定因子TDF(testis-determining factor)的發(fā)現(xiàn),使胚胎階段的性別分化成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)在Y染色體短臂上存在可以調(diào)控精細胞轉(zhuǎn)化為精子的基因[2],分別是睪丸決定因子SRY、精原細胞增殖因子Eif2s3y[3]和影響精子成熟的轉(zhuǎn)錄因子Zfy2[4]。多種研究表明,Zfy基因是C2H2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(ZNFs)的家族成員之一,當敲除Zfy的雙等位基因發(fā)現(xiàn)細胞生長和增殖出現(xiàn)缺陷[5]。隨后研究發(fā)現(xiàn),Zfy基因通過“鋅指”結(jié)構(gòu)域來調(diào)控其他基因的表達,影響精子的發(fā)生過程[6]。RNAi技術(shù)作為疾病靶向基因治療的新手段,已被用于各種疾病的治療。應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默Zfy基因表達,使精子在生精階段相關(guān)基因表達量變化,從而影響Y精子活力、畸形率等,Y精子與卵子結(jié)合的幾率降低,而X精子不受影響,從而達到精子發(fā)生階段控制性別的目的。

本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)針對驢Zfy基因編碼區(qū)設(shè)計RNA干擾片段,構(gòu)建shRNA串聯(lián)載體,通過睪丸注射技術(shù),干擾Zfy基因表達,使精子在發(fā)生階段Zfy基因表達下降,從而影響Y精子的發(fā)育,降低受精幾率,最終實現(xiàn)多產(chǎn)母驢的目標。為快速擴繁種群提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑及儀器

無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司);胎牛血清、DMEM/F12(美國Gibco公司);胰島素、FSH、睪酮、視黃酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、維生素A、C、E(美國杰華科技有限公司);丙酮酸、胰蛋白酶、DNase(北京索萊寶科技有限公司);脂質(zhì)體2000(invitrogen);TBGreen?PremixExTaqTMⅡ(TaKaRa);QI Aamp DNA Mini and Blood Mini Hand book(凱杰生物工程有限公司)。核酸蛋白檢測儀(德國Thermo公司);熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試驗動物

驢睪丸組織采自新疆石河子九昌驢業(yè)有限公司屠宰的青年健康新疆驢新鮮睪丸。

種公驢、空懷母驢由新疆喀什澤普縣金胡楊牧業(yè)有限公司提供,6頭4～6歲青年健康德州公驢,若干頭經(jīng)產(chǎn)健康新疆母驢。經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準,倫理批準號分別為2020-051-01、2019-061-01,自覺遵守試驗動物福利倫理原則,保障動物福利及安全。

1.3 主要試驗方法

1.3.1 設(shè)計shRNA序列

根據(jù)NCBI提供的驢Zfy基因與Zfx基因的CDS區(qū)序列,選擇兩者堿基差異較大區(qū)域設(shè)計4段siRNA。分別添加loop(頸環(huán))、靶點反義序列及終止密碼子合成shRNA干擾片段,為每段shRNA添加U6啟動子。將設(shè)計好的序列交由上海吉凱生物技術(shù)有限公司合成。siRNA序列信息如表1所示。

表1 siRNA序列信息

1.3.2 構(gòu)建shRNA串聯(lián)干擾載體

選擇4.7 kb質(zhì)粒載體CV250,將合成好的shRNA片段與載體重組,構(gòu)建CV250-2shRNA串聯(lián)干擾載體,并分別命名為CV250-1、CV250-2。shRNA序列和串聯(lián)載體構(gòu)建如圖1所示。

圖1 shRNA序列和CV250-2shRNA串聯(lián)載體構(gòu)建

1.3.3 細胞水平驗證串聯(lián)干擾載體

采集成熟驢睪丸組織,采用兩步酶消化法分離出睪丸支持細胞和生精細胞,并放入完全培養(yǎng)液[7]中在35 ℃、5% CO2、濕度為95%的條件下培養(yǎng)24 h,用脂質(zhì)體2 000作為轉(zhuǎn)染試劑將1.3.2中保存的載體轉(zhuǎn)染到生精細胞中,每組重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染58 h后提取生精細胞的總RNA,設(shè)計qRT-PCR引物,以驢GAPDH基因為內(nèi)參基因,以重組載體轉(zhuǎn)染的細胞為試驗組,未進行轉(zhuǎn)染的細胞為對照組,檢測重組串聯(lián)干擾載體轉(zhuǎn)染生精細胞后,Zfy基因的相對表達量,計算重組串聯(lián)干擾載體的干擾效率,選擇高效重組串聯(lián)干擾載體。試驗所用引物如表2所示。

表2 Zfy、Zfx、GAPDH引物設(shè)計序列

1.3.4 體內(nèi)驗證串聯(lián)干擾載體

將1.3.3中經(jīng)細胞水平篩選的高效重組載體CV250-1用于動物體內(nèi)干擾試驗。根據(jù)驢睪丸體積使用睪丸注射法將質(zhì)粒注射進入驢睪丸組織中,共注射3針,每隔10天注射1次,每頭驢每側(cè)睪丸每次注射3 mg質(zhì)粒,第3針結(jié)束后間隔6天進行人工授精。

因驢的妊娠期時間約365 d,妊娠周期較長。因此,為加快試驗進程,參照前人的研究[7],選擇18周孕驢外周靜脈血血漿進行胎兒游離DNA性別鑒定,統(tǒng)計后代性別,得到重組干擾載體干擾后代的雌性率。設(shè)計牙釉蛋白引物,以對照組(陽性對照:種公驢DNA;陰性對照:空懷母驢DNA)和試驗組(懷孕母驢)的胎兒游離DNA為模板,進行PCR擴增及電泳檢測。牙釉蛋白引物見表3。

表3 AMEL引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本試驗采用Excel整理初始數(shù)據(jù),qRT-RCR數(shù)據(jù)采用2-△△CT進行計算,采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(AVONA),統(tǒng)計結(jié)果以平均數(shù)±標準誤(Mean±SD)表示,“*”表示(P<0.05)差異顯著,“**”表示(P<0.01)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 shRNA串聯(lián)干擾載體的構(gòu)建

菌液PCR電泳結(jié)果如圖2所示,得到重組載體CV250-1質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR擴增出1 101 bp陽性克隆轉(zhuǎn)化子,CV250-2質(zhì)粒擴增出1 110 bp陽性克隆轉(zhuǎn)化子,測序結(jié)果與菌液PCR結(jié)果一致,表明干擾載體構(gòu)建成功。

1:ddH2O;2:空載自連組;3:GAPDH;M:Marker;5-10:1-6號陽性克隆菌。圖2 菌液PCR電泳結(jié)果圖

2.2 干擾載體在生精細胞中的功能驗證

體外共培養(yǎng)生精細胞和支持細胞,在顯微鏡下觀察到貼壁生長的支持細胞和附著于支持細胞上的生精細胞,生精細胞多呈圓形,中間可明顯觀察到黑色細胞核。用2個重組干擾載體和1個空白組轉(zhuǎn)染生精細胞24 h后,觀察到轉(zhuǎn)染干擾載體組有綠色熒光,表明干擾載體成功轉(zhuǎn)染進入細胞,在轉(zhuǎn)染組熒光表達量達到最高58 h時,使用熒光顯微鏡激發(fā)綠色熒光,結(jié)果如圖3所示。

A:剛分離出來的生精細胞;B:轉(zhuǎn)染58 h生精細胞(20倍);C:轉(zhuǎn)染58 h生精細胞(40倍);D:轉(zhuǎn)染58 h生精細胞熒光觀察。圖3 驢生精細胞轉(zhuǎn)染串聯(lián)干擾載體熒光圖

以未轉(zhuǎn)染細胞為對照組、轉(zhuǎn)染干擾載體的細胞為試驗組,將提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,qRT-PCR檢測結(jié)果如圖4所示,與對照組細胞mRNA的相對表達量103.04±11.68%相比,CV250-1干擾組的相對表達量下調(diào)了76.37±6.36%,差異極顯著(P<0.01);CV250-2干擾組的相對表達量下調(diào)了67.73±4.94%,差異顯著(P<0.05)。CV250-1和CV250-2經(jīng)細胞水平篩選,皆可有效干擾細胞內(nèi)Zfy基因表達,可用于驢體內(nèi)試驗。由于CV250-1具有更好的干擾效果,后續(xù)選擇CV250-1用于動物體內(nèi)試驗。

肩注*表示差異顯著(P<0.05),同行肩注**表達差異極顯著(P<0.01);下同。圖4 驢對照組、試驗組生精細胞Zfy基因mRNA相對表達量

2.3 串聯(lián)干擾載體的體內(nèi)檢測效果評估

性控精液(睪丸注射Zfy基因串聯(lián)干擾載體)、非性控精液(空白處理組)人工授精后B超檢查受胎結(jié)果如表4所示,性控組的受胎率為61.72%,非性控組的受胎率為67.4%。

表4 性控精液與非性控精液受胎率統(tǒng)計表

使用陽性對照(種公驢)、陰性對照(空懷母驢)血液DNA、性控組懷孕母驢血漿提取的胎兒游離DNA為模板,PCR擴增AMEL基因,結(jié)果如圖5所示。1號泳道公驢陽性對照擴增出2條帶,2號泳道為空懷母驢陰性對照擴增出1條帶,符合預(yù)期,3號泳道為無酶水空白對照擴增結(jié)果無條帶。從性控組結(jié)果可明顯看出泳道5、8與公畜陽性對照相同,確定子代為雄性;泳道4、6、7、9、10、11與母畜陰性對照相同,確定子代為雌性。

統(tǒng)計胎兒性別鑒定結(jié)果,并分析后代性別比例,結(jié)果如表5所示:CV250-1干擾載體性控組子代雌性率為71.05%(P<0.05)。

表5 性控與非性控子一代性別數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 討論

鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Zfy基因曾作為睪丸決定因子的候選基因而備受關(guān)注[8]。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)有兩個Y染色體的基因足以使生殖細胞在輔助受精中起作用并產(chǎn)生活的后代[9],即睪丸決定因子SRY和精原增殖因子Eif2s3y。隨著SRY基因的功能被不斷挖掘,Zfy基因被逐漸的遺忘了,花了20多年時間才重新出現(xiàn),扮演新的生精角色。Yamauchi[10]的研究表明,小鼠的Y染色體上Zfy2促進精子形態(tài)發(fā)生,提高圓形精子細胞注射(ROSI) 的成功,并且是形成精子的必要條件,能夠在卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)注射后產(chǎn)生活的后代。Zfy2基因的存在使圓形精子細胞能夠啟動和經(jīng)歷頭部形態(tài)發(fā)生和完整的尾部發(fā)育。通過研究發(fā)現(xiàn)添加Zfy2基因到雄性 Y 染色體缺陷的個體中,發(fā)現(xiàn)圓形精子細胞階段減數(shù)分裂后停滯,證明了Zfy2在輔助受精中負責精子功能的形成[4]。在本研究中,當干擾Zfy基因后,發(fā)現(xiàn)子一代的性別相比于對照組發(fā)生明顯偏移,影響了圓形精子細胞的正常發(fā)育,使Y精子的受精幾率降低,X精子不受影響,與理論相符。但在后續(xù)的研究中還需驗證注射干擾載體后,對下游基因表達產(chǎn)生的影響。在驢中,Y 染色體上只有一個單一的Zfy基因,沒有Zfy突變的描述,因此,關(guān)于Zfy基因在精子發(fā)生中的生物學(xué)功能可能引發(fā)研究員們對性控研究的重新評估。

汪存利[11]的研究表明,體外培養(yǎng)生精細胞會隨著支持細胞功能的衰落而退化,要想穩(wěn)定的培養(yǎng)生精細胞還需探尋與支持細胞功能相近的存活時間長的飼養(yǎng)層細胞。本試驗培養(yǎng)驢的生精細胞,在這些研究的基礎(chǔ)上進行改進,在支持細胞貼壁后即進行轉(zhuǎn)染試驗,以防止生精細胞退化影響試驗結(jié)果。但無法進行生精細胞的生長傳代,在后續(xù)的研究中還需要探索生精細胞的生長及傳代的方法。

睪丸注射是將外源基因整合到雄性生殖系細胞中,從而獲得轉(zhuǎn)基因精子的方法[12-13]。Amaral等[14]在研究中發(fā)現(xiàn),使用睪丸注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠,會導(dǎo)致小鼠生殖器官損壞,生精細胞的數(shù)量降低,曲細精管的功能損壞。李福兵[15]的研究認為睪丸間質(zhì)注射是注射過程中影響了曲細精管完整性,侵染質(zhì)粒通過缺口進入生精細胞,或者是通過睪丸組織體內(nèi)的體液循環(huán)和滲透作用進入生精細胞完成侵染。Bichun等[16]將pEGFP-N1質(zhì)粒注入雞睪丸,從30個受精卵中隨機篩選出23只雛雞,成功地得到13只轉(zhuǎn)基因雞(檢出率56.5%)。He等人[17]成功獲得了轉(zhuǎn)基因羊應(yīng)用睪丸注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)(陽性率2.0%)。在本研究中發(fā)現(xiàn),睪丸間質(zhì)注射法對睪丸組織產(chǎn)生了一定影響,引起睪丸腫脹,嚴重會引起睪丸組織出血等狀況,需要精密的技術(shù)支持。在本研究中,注射干擾載體對驢睪丸組織產(chǎn)生可恢復(fù)性損傷,在注射干擾載體8個月后,對種公驢進行精液品質(zhì)檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),精液活力降低、睪丸腫脹及精液中帶血等問題皆已恢復(fù),精子活力及身體狀況恢復(fù)正常水平。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明,成功構(gòu)建出驢Zfy基因重組載體CV250-1、CV250-2,CV250-1能更好的抑制種公驢睪丸組織Zfy基因的表達,細胞水平干擾效率為76.37%,體內(nèi)試驗子一代雌性率為71.05%,可顯著影響子代雌性率。