申鵬云，孫小茁，周勝元

1 天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617；2 天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院治未病中心

抑郁癥（MDD）是一種慢性精神疾病，也是最嚴(yán)重的精神疾病之一，其能夠損害人的精神以及軀體功能，已經(jīng)成為21世紀(jì)自殺率上升的重要原因［1］。閾下抑郁（SD）是處于健康和MDD之間的一種狀態(tài)，指具有某些抑郁的臨床癥狀，但由于病程或者癥狀不滿足MDD診斷標(biāo)準(zhǔn)的一種狀態(tài)或一類個體［2］，具體表現(xiàn)為輕度焦慮、精神緊張、情緒失落、興趣減退、敏感善疑、思維減慢、煩躁失眠等［3］。根據(jù)亞健康的定義，SD屬于心理亞健康狀態(tài)，具有向疾病或健康狀態(tài)轉(zhuǎn)變的特點(diǎn)［4］，這一觀點(diǎn)也得到了張金鵬等［5］、有明妍等［6］研究的支持。相較于健康人群，SD人群更容易發(fā)展為MDD。研究發(fā)現(xiàn)，許多SD患者在隨訪中有持續(xù)的抑郁癥狀，1/3～1/2的患者報(bào)告有中度功能障礙，10%～25%的患者會在幾年內(nèi)發(fā)展成MDD。因此，雖然SD還未達(dá)到MDD的程度，但是如果任其發(fā)展，將帶來嚴(yán)重的后果，是一種不可忽視的疾?。?-8］。SD動物模型的建立對于探索其發(fā)病機(jī)制具有重要意義，有助于減少其發(fā)病并指導(dǎo)其治療。但目前醫(yī)學(xué)界對于SD的認(rèn)知還處于起步階段，動物實(shí)驗(yàn)更少，原有的動物模型也幾乎是由MDD動物模型演化而來，更有部分研究直接照搬MDD動物模型，且關(guān)于SD模型的評價方法也缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本文對SD動物模型的造模方法與評價方法作一綜述，為研究者根據(jù)實(shí)際需求選用合適的造模方法和模型評價方法提供參考。

1 SD動物模型的造模方法

SD屬于心理亞健康狀態(tài)，處于健康與疾病之間。在動物實(shí)驗(yàn)中，通常使用小鼠和大鼠模擬SD癥狀，可以通過測量動物的行為表現(xiàn)、神經(jīng)遞質(zhì)水平、神經(jīng)元活動等指標(biāo)來評估動物是否出現(xiàn)了SD癥狀，并探討其可能的治療方法。由于SD與MDD是平行的兩個概念，而二者之間也存在遞進(jìn)關(guān)系，所以SD與MDD動物模型的造模方法基本一致，都是通過給予模型動物一定應(yīng)激源，如孤養(yǎng)、空瓶應(yīng)激、晝夜顛倒等，模擬人類不健康生活和習(xí)慣引起的抑郁情緒等。但是，要使實(shí)驗(yàn)動物在研究期間能夠維持SD狀態(tài)，還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)激源刺激量和造模時間［9］。目前常用的SD造模方法有不完全性慢性不可預(yù)知性溫和刺激法、藥物誘導(dǎo)法、閾下社會挫敗應(yīng)激法、光周期紊亂法、快速眼動睡眠剝奪法、基因突變法等。

1.1 不完全性慢性不可預(yù)知性溫和刺激法 在使用這個方法造模過程中，動物會接連受到各種不同類型的應(yīng)激，如冷水浴、電擊、不規(guī)律飲食和水源、孤養(yǎng)、空瓶刺激、光源紊亂等，而且應(yīng)激的種類和時間都是無法預(yù)測的，該模型可以模擬出長期慢性壓力對人們產(chǎn)生的負(fù)面影響。一般情況下，MDD動物模型的建立會在28 d內(nèi)每日施加不規(guī)律的刺激，而SD動物模型可以間隔時間給予應(yīng)激源。孟彥［10］在建立心理亞健康動物模型時，僅在21 d的應(yīng)激期里每天給予空瓶刺激10 min，再隨機(jī)選取其中9 d予以飲食不規(guī)律、晝夜紊亂、社會挫敗應(yīng)激；該造模方法與慢性不可預(yù)知性溫和刺激法的模型建立方法完全相同，只不過是在刺激量以及時間上有所縮短，來模擬人類生活中相對較輕的負(fù)面影響而形成的SD狀態(tài)；經(jīng)過驗(yàn)證，該法并未造成大鼠明顯生理病理改變，僅有輕微焦慮、活動減少等表現(xiàn)，也表明了該方法是可行的。

1.2 藥物誘導(dǎo)法 在使用該方法建立的模型中，研究者會使用一些特定的藥物及方法誘發(fā)抑郁和焦慮等情緒障礙，常用的藥物有利血平、激素（去甲腎上腺素、氫化可的松、皮質(zhì)酮、促腎上腺皮質(zhì)激素）、五羥色氨、苯丙胺、育亨賓、阿樸嗎啡等。其中，利血平誘導(dǎo)法最為常用且成熟，激素誘導(dǎo)僅次于利血平誘導(dǎo)法。使用該方法建立的模型可以幫助研究者更好地理解藥物對情緒障礙的影響機(jī)制。在MDD動物模型建立過程中，每天需按體質(zhì)量注射一定量藥物，誘導(dǎo)時間為10～42 d［11］。目前還沒有研究使用藥物來誘導(dǎo)建立SD模型，但馮飛等［12］研究發(fā)現(xiàn)，利血平4 mg/kg是建立MDD模型最為合適的劑量。因此，如果使用該法誘導(dǎo)建立SD模型時可以相對減少藥物劑量以及縮短誘導(dǎo)時間。藥物誘導(dǎo)的動物模型既可預(yù)測抗抑郁藥物的治療效果，還能探索抑郁的潛在機(jī)制，操作簡便、易行，多用于抗抑郁藥物的初篩。

1.3 閾下社會挫敗應(yīng)激法 閾下社會挫敗應(yīng)激法是將實(shí)驗(yàn)動物暴露于反復(fù)的社交壓力下，比如在一個競爭性的社交環(huán)境中與強(qiáng)壯的同伴對抗［13］。這種持續(xù)的社交壓力會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物出現(xiàn)多種行為和生理學(xué)改變，包括情緒和認(rèn)知缺陷、代謝障礙、免疫功能受損等。相較于慢性社交挫敗應(yīng)激模型，該方法降低了刺激強(qiáng)度和刺激周期，引起小鼠輕度快感缺乏和不明顯的社交回避行為，可以模擬現(xiàn)實(shí)生活中同輩壓力帶來的情緒失落、敏感善疑等SD表現(xiàn)。當(dāng)前有研究采用該方法建立動物模型用于檢測小鼠對應(yīng)激刺激的敏感性［14］，尚未應(yīng)用在SD動物造模中，仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

1.4 光周期紊亂法 光周期是調(diào)節(jié)動物在24 h內(nèi)生物節(jié)律的重要因素之一，光周期紊亂法是指通過改變光照時間和暗度擾亂其生物節(jié)律，從而導(dǎo)致其產(chǎn)生抑郁表現(xiàn)的一種方法。光作為外部刺激，可通過視網(wǎng)膜和松果體傳遞到大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致身體產(chǎn)生一系列激素和神經(jīng)傳遞物質(zhì)的變化，并影響到生物鐘的節(jié)律。動物如果被暴露在相對較長的黑暗時段中，這種環(huán)境可以模擬出季節(jié)性情感障礙，即冬季抑郁癥，主要表現(xiàn)為沮喪、焦慮、厭食、失眠以及焦慮等。根據(jù)發(fā)病機(jī)制可以適度調(diào)整光周期來建立SD動物模型，這個模型對于理解動物的行為和代謝適應(yīng)具有重要意義，也可反映環(huán)境因素對生物體生理學(xué)調(diào)節(jié)的重要性［15-16］。

1.5 快速眼動睡眠剝奪法 在使用這個方法建立模型時，實(shí)驗(yàn)動物會被隔離在一個新環(huán)境中，并且在睡眠時會受到強(qiáng)制性干擾，如輕微電擊等。胡曉輝等［17］使用小平臺水環(huán)境法將大鼠放置在高于水面1 cm的水槽中，睡眠時肌張力降低的大鼠會落入水中，從而剝奪其睡眠，導(dǎo)致其出現(xiàn)抑郁樣行為，且發(fā)現(xiàn)剝奪時間與抑郁行為的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)研究表明，睡眠剝奪可對人體產(chǎn)生較大影響，并引起情緒、行為、學(xué)習(xí)、記憶等方面的失調(diào)，表現(xiàn)出與SD相似的癥狀，而SD患者也常伴隨睡眠方面的問題［18］。該方法簡單易行，變量較少、可控，造模時間短，非常適用于SD動物模型的建立。

1.6 基因突變法 一些基因突變可以導(dǎo)致人類出現(xiàn)情緒障礙，比如MDD和雙相情感障礙等。因此，研究者會使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來建立這類具有基因缺陷的動物模型，以便更好地研究情緒障礙的發(fā)病機(jī)制。然而，目前發(fā)現(xiàn)的遺傳基因位點(diǎn)的可重復(fù)性和特異性均較差，仍不能精確建立SD動物模型，尚需進(jìn)一步對SD的遺傳機(jī)制和遺傳位點(diǎn)進(jìn)行研究，為未來轉(zhuǎn)基因動物模型的建立提供依據(jù)［19］。

2 SD動物模型的評價方法

2.1 行為學(xué)評價 常用的行為學(xué)評價方法有蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、明暗箱實(shí)驗(yàn)、曠野實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等，除此之外，還有一些比較少見的評價方法，如休克逃避實(shí)驗(yàn)、顱內(nèi)自刺激實(shí)驗(yàn)、新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)、灑水實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)等。這些評價方法的操作雖不一樣，但都是為了檢測動物快感缺乏、焦慮恐懼、絕望等情緒變化。

2.1.1 蔗糖偏好實(shí)驗(yàn) 蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从硠游锏目旄腥狈?，而快感缺乏是MDD的核心評價指標(biāo)，也能夠在一定程度上反映SD的興趣減退等癥狀。既往當(dāng)大鼠糖水偏愛率＜50%且相對對照組下降＞30%時，被認(rèn)為MDD造模成功。張瀟等［20］建立的SD大鼠模型糖水偏愛率約為54.0%，對照組約為78.6%，這表明模型動物還未達(dá)到MDD的快感缺乏嚴(yán)重程度，但是存在一定抑郁癥狀，符合SD的特點(diǎn)。

2.1.2 懸尾實(shí)驗(yàn) 懸尾實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从硠游锏男袨榻^望狀態(tài)，通過尾巴固定將小鼠懸掛6 min，記錄后4 min小鼠靜止不動的時間占比，一般健康小鼠為100 s左右，不動時間越長表明抑郁絕望程度越嚴(yán)重。楚玉璽等［21］建造的小鼠抑郁模型不動時間為178 s左右。因此，SD動物模型懸尾實(shí)驗(yàn)的不動時間應(yīng)當(dāng)介于MDD模型和健康對照模型之間。

2.1.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从硠游锏慕箲]狀態(tài)，具體操作方法是將動物放置于距離地面一定高度的十字架上，模擬人類在高空時的恐懼、焦慮、不安等心理狀態(tài)［22］。十字架一支為有保護(hù)區(qū)，一支為無保護(hù)區(qū)，一般記錄動物5 min內(nèi)在保護(hù)區(qū)和非保護(hù)區(qū)的時間占比，用于反映模型動物的焦慮嚴(yán)重程度，無保護(hù)區(qū)停留時間越短提示焦慮程度越嚴(yán)重。有研究總結(jié)過往實(shí)驗(yàn)中健康對照組無保護(hù)區(qū)停留時間占比為20%～40%，抑郁模型組無保護(hù)停留時間占比＜20%［23］。建造SD模型后使用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評價時，無保護(hù)區(qū)停留時間占比應(yīng)為20%左右，且明顯高于抑郁組、低于空白組，可以定義為模型建立成功。

2.1.4 明暗箱實(shí)驗(yàn) 明暗箱實(shí)驗(yàn)是利用動物對明亮地方具有天然的厭惡和好奇傾向而設(shè)計(jì)出來的，以暗箱中活動時長、穿箱次數(shù)、在明暗箱的活動時長以及活動頻次等為檢測指標(biāo)，通常高焦慮水平的動物在明箱中活動的時間和頻次會明顯低于低焦慮水平的動物［24］。

2.1.5 曠野實(shí)驗(yàn) 曠野實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的較常用的情緒相關(guān)行為學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)，其基于動物對陌生開放場地的摸索好奇以及慌張畏懼情緒，通過記錄動物首次進(jìn)入中央?yún)^(qū)的潛伏期、中央?yún)^(qū)停留時間、穿行次數(shù)、總運(yùn)動路程、時間、速度、水平爬格次數(shù)、垂直站立次數(shù)等指標(biāo)判斷模型動物的抑郁情況［25］。MDD模型的上述指標(biāo)均低于健康對照模型。由于當(dāng)前模型動物種類繁多，實(shí)驗(yàn)方法和場地也有差異，因此未能明確指標(biāo)數(shù)值，具體實(shí)驗(yàn)中可參考其他評價指標(biāo)。

2.1.6 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是將動物放置在狹窄的注水空間中5～6 min，實(shí)驗(yàn)動物最開始會掙扎一段時間，之后會表現(xiàn)出靜止不動的行為絕望狀態(tài)，觀察其不動、攀爬和游泳的時間，以此判斷實(shí)驗(yàn)動物的抑郁程度。正常嚙齒類動物的不動時間占檢測時間的30%～80%，不動時間占比越高提示抑郁程度越嚴(yán)重。然而SD個體在癥狀上不至于出現(xiàn)絕望或自殺行為，因此SD動物模型的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白對照比較應(yīng)無明顯差異或差異較?。?6］。

2.2 體征觀察、體質(zhì)量測定 觀察動物皮膚毛色、精神行為狀態(tài)、進(jìn)食情況、體質(zhì)量變化等，可以反映動物的抑郁情況。正常動物眼睛明亮、性情溫和、鼻唇干凈、皮毛光澤、自主活動多、體質(zhì)量增長正常。受到應(yīng)激的SD動物模型會表現(xiàn)出不同程度的攻擊性、精神萎靡、皮毛光澤度下降、自主活動減少、體質(zhì)量增長異常等。

2.3 臟器指數(shù)測定 臟器指數(shù)是將動物處死解剖，稱重清洗后的心肝脾肺腎等器官，以此反映動物器官是否有明顯病變，判斷機(jī)體是否發(fā)生器質(zhì)性損傷。SD屬于亞健康狀態(tài)，病理上不會出現(xiàn)明顯的臟器腫脹、出血、萎縮等變化。因此，臟器指數(shù)某種程度上可以從側(cè)面客觀評價模型建立是否合理［20］。

2.4 腦成像檢查 SD模型動物也會出現(xiàn)與人類相近的神經(jīng)影像異常。ACCROMBESSI等［27］建立了青春期SD動物模型，發(fā)現(xiàn)其前額葉皮層、運(yùn)動和軀體感覺皮層、導(dǎo)水管周圍灰色核、紅色核、紋狀體、伏隔核、海馬體、杏仁核、丘腦和小腦均存在不同程度的代謝活動增強(qiáng)，這與人類抑郁患者的腦成像檢查變化相似。

綜上所述，動物模型是開展SD動物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，動物實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚴刮覀冞M(jìn)一步探究SD的內(nèi)在發(fā)病機(jī)制，從而為SD的臨床診斷和治療提供更多參考依據(jù)。許多情緒疾病的動物模型造模方法及評價方法已有統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn)和專家共識，然而已有的SD動物造模研究較少，多是將MDD造模方法進(jìn)行修改，減少其應(yīng)激源刺激量和刺激時間，從而建立SD動物模型。SD造模的精確應(yīng)激源刺激量、刺激時間或誘導(dǎo)藥物量等均缺乏統(tǒng)一且準(zhǔn)確的認(rèn)識，評價方法也多以MDD動物實(shí)驗(yàn)評價指標(biāo)作為參考，或者以健康對照組和MDD組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義作為造模成功的標(biāo)志，這樣的方法無疑是存在爭議的。即便造模成功，SD模型可能向MDD或健康狀態(tài)轉(zhuǎn)變，如何確保建造的動物模型一直處于SD狀態(tài)，這也是值得探討的問題。因此，研究者應(yīng)根據(jù)實(shí)際需求選用合適的造模方法和模型評價方法，以尋求最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。