李 斌，張 慧，于 鵬，鄒 明，梁 曉，張啟迪*

（1.青島大沽河流域國家農(nóng)業(yè)科技園發(fā)展服務中心，山東青島 266225；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東濰坊 261061；3.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東青島 266109）

大腸桿菌是畜禽機體腸道內(nèi)最為常見的細菌，只有10%～15%大腸桿菌存在致病性。大腸桿菌抗原結(jié)構(gòu)復雜，其鞭毛、莢膜、菌毛等都是菌體的主要抗原結(jié)構(gòu)，也構(gòu)成了大腸桿菌多種血清型。目前已確定的菌體抗原對豬、家禽能產(chǎn)生致病作用的大腸桿菌血清型以O1、O2、O35和O78最為常見[1]。近年來隨著畜禽集約化養(yǎng)殖模式的飛速發(fā)展，豬、家禽大腸桿菌病的發(fā)病率也呈一定的上升趨勢，且該病發(fā)病率多為11%～69%，死亡率為3.8%～72.9%，致死率為40.2%～90.3%[2]。另外，無公害和健康養(yǎng)殖的發(fā)展趨勢又使養(yǎng)殖企業(yè)（戶）無法大規(guī)模使用抗生素，無疑對大腸桿菌病的防治提出了更高的要求。

中藥以其毒副作用小，安全性高和不易產(chǎn)生耐藥性等特點，近年來在畜禽減抗、替抗的道路上愈發(fā)受到重視。本試驗所采用的金黃湯劑，是針對豬、家禽大腸桿菌病的臨床特性，以黃連為主藥，添以金銀花、甘草等7 種中草藥按照一定的比例研制而出。為探明此藥的臨床治療效果，本文通過建立大腸桿菌病小鼠模型進行金黃湯劑不同劑量的給藥治療，觀察小鼠治療前后的采食量、治愈率和死亡率，為后期畜禽健康養(yǎng)殖中臨床用藥提供理論支撐。

1 材料

1.1 試驗菌株、培養(yǎng)基、動物及試驗藥品

大腸桿菌O78在-20℃環(huán)境下保存。

營養(yǎng)瓊脂（202028）、麥康凱瓊脂（批號：201929）、LB 肉湯培養(yǎng)基（202012）均購自北京陸橋技術(shù)有限公司。

昆明系小鼠（180 只，體重18～22g，雌雄各半）購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001。

黃連（202111）、苦參（202201）、黃柏（202201）、甘草（202203）均購自安徽廣印堂制藥有限公司。金銀花（202112）購自亳州仁益中藥材銷售有限公司。

1.2 試驗儀器

本試驗使用的實驗儀器如表1 所示。

表1 本試驗使用的試驗儀器及其生產(chǎn)商

2 方法

2.1 金黃湯劑的制備

稱取金銀花和黃連等中藥共100g，加入10倍量蒸餾水，浸泡30min 后，水煮1h，用4 層紗布過濾藥液后再加入10 倍量蒸餾水，浸泡45min，水煮時間為45min，煎煮3 次。合并三次所得藥液，溫火濃縮至1g/mL。將所得藥液放于4℃冰箱中過夜后，在6000r/min 下離心10min，取上清液，滅菌密封備用。

2.2 試驗前準備

2.2.1 試驗動物飼養(yǎng)

小鼠購進后，飼養(yǎng)于小鼠專用實驗房內(nèi)，室溫22～24℃，濕度為50%～70%，照明/黑暗12h 交替進行，正常飼養(yǎng)3～5d。飼養(yǎng)籠具使用前用新吉爾滅浸泡消毒。雌雄小鼠分籠飼養(yǎng)，每個籠具配有水壺和不銹鋼網(wǎng)罩，自由采食、飲水。飼喂小鼠全價固體飼料，飼料中不添加任何抗生素或抗菌藥物。

2.2.2 大腸桿菌菌懸液的制備

將于-20℃保存下的大腸桿菌O78復蘇后在LB 肉湯中增殖。采用十倍稀釋法，用1mL 無菌吸管吸取3.6mL LB 肉湯于各試管中，吸取0.4mL 菌液于第一支試管中吹打混勻，后吸取0.4mL 于第二支試管中，依次稀釋至第12 支試管。分別吸取1mL 10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11和10-12共8 個稀釋度菌液與30～40℃的營養(yǎng)瓊脂混合加入培養(yǎng)皿中（每組設置3 個重復），待營養(yǎng)瓊脂凝固后放入37℃環(huán)境中培養(yǎng)12～14h 至長出菌落。根據(jù)《中華人民共和國食品安全國家標準》（GB4789.3-2010）中規(guī)定[3]，選取菌落數(shù)在30～300 個的平板，進行菌落計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果除以涂布體積后乘以稀釋倍數(shù)為該菌液的濃度。

2.2.3 小鼠大腸桿菌病模型的建立

取60 只小鼠均等分成6 組，每組小鼠雌雄各半，分別腹腔注射0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5mL大腸桿菌菌液和0.5mL 滅菌生理鹽水。觀察小鼠精神狀態(tài)、反應能力和采食引水等狀態(tài)。記錄各組小鼠發(fā)病時間，臨床癥狀、死亡情況和器官病理變化等。將死亡的小鼠剖檢，進行大腸桿菌分離鑒定，確定是因大腸桿菌所引起的發(fā)病死亡，同時確定正式攻毒劑量。

2.3 金黃湯劑小鼠藥效學試驗

試驗于2022 年5 月在山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院藥理實驗室內(nèi)進行。取小鼠120 只，體重(20±1)g，隨機分成6 組，每組雌雄各半，即金黃湯劑高、中、低劑量組、20%氟苯尼考組、攻毒組和空白組。除空白組外，每組小鼠均腹腔注射0.2mL 大腸桿菌菌液。待小鼠出現(xiàn)精神萎靡，不愿采食等臨床現(xiàn)象后，各試驗組按照表2 所示進行分組給藥，24h 內(nèi)給藥2 次，每次間隔12h，連用7d，用藥期間記錄各組小鼠采食量，死亡數(shù)等，同時計算各組動物的治愈率、有效率和死亡率，并計算總有效率。

表2 金黃湯劑劑量分組

2.4 試驗觀察指標

參考《獸用化藥中藥研究技術(shù)指導原則匯編（2022 年）》上所示要求，從中選取以下幾項作為試驗觀察記錄指標：

治愈率：藥效學試驗過程中，經(jīng)用藥后被毛散亂、眼瞼分泌物、趴臥不動等臨床癥狀消失，采食和精神狀態(tài)恢復正常的動物只數(shù)與發(fā)病動物數(shù)比值。

有效率：藥效學試驗過程中，經(jīng)用藥后上述臨床癥狀有所減輕，采食和精神狀態(tài)有所改善的動物只數(shù)與發(fā)病動物數(shù)比值。

總有效率：藥效學試驗結(jié)束后，試驗動物治愈數(shù)和有效數(shù)總和占動物治療數(shù)的百分比。

3 結(jié)果

3.1 攻毒劑量的確定

各組小鼠在注射大腸桿菌菌液4h 后與生理鹽水組相比，出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降等臨床癥狀，6h 后出現(xiàn)眼瞼分泌物增多，被毛粗亂，由圖1 可知，0.4mL 和0.5mL 組在攻毒6h 后小鼠開始有死亡，12h 后各劑量組小鼠均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。12～48h 為小鼠死亡高峰期，72h 后已沒有小鼠在出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。綜合圖1、表3，0.4mL 和0.5mL 組小鼠死亡率為100%，且死亡高峰期在攻毒后6～12h，發(fā)病急，致死率高，不適合做藥效學試驗。0.3mL 組小鼠與0.4mL 和0.5mL 組相比，雖然死亡時間延長，但死亡率仍偏高。而0.1mL 組發(fā)病率和死亡率低。根據(jù)藥效試驗評價的需要，即攻毒劑量對應的死亡率在60%～90%范圍內(nèi)的作為動物模型的最佳攻毒劑量[4]。故本試驗選取0.2mL 2.16×108CFU/mL 菌液作為正式試驗的攻毒劑量。

圖1 各組小鼠死亡時間及只數(shù)

表3 各組小鼠發(fā)病率和死亡率

3.2 細菌鑒定

將死亡的小鼠進行剖檢檢查，發(fā)現(xiàn)肝臟、心臟和胃粘膜表面有許多出血點，肝臟腫大，腸系膜有多個出血點。

取病變組織涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性桿菌（圖3）。細菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基生長良好，菌落表面光滑，邊緣整齊。在麥康凱中培養(yǎng)呈現(xiàn)紅色菌落（圖2），可以確定是大腸桿菌感染所致。

圖2 麥康凱培養(yǎng)結(jié)果

圖3 革蘭氏染色結(jié)果（放大倍數(shù)：物鏡40×目鏡10）

3.3 金黃湯劑小鼠藥效學試驗結(jié)果

從圖4 和表4 數(shù)據(jù)中可以看出，攻毒4h 后灌服藥物，與攻毒組相比，高劑量組和20%氟苯尼考組能夠起到明顯的治療作用，死亡數(shù)有明顯的降低；高、中劑量組死亡只數(shù)與20%氟苯尼考組相比差距較小，而低劑量組與20%氟苯尼考組相比差距較大；金黃湯劑各劑量組以及20%氟苯尼考組的治愈數(shù)均高于攻毒組；低劑量組與高、中劑量組和20%氟苯尼考組相比存在顯著性差異（P＜0.05），高、中劑量組與20%氟苯尼考組相比差異性不顯著（P＞0.05）。所以，金黃湯劑對大腸桿菌有一定的治療作用。

圖4 各組小鼠用藥后死亡情況

表4 各組治療情況統(tǒng)計

3.4 感染大腸桿菌對小鼠采食量影響

金黃湯劑對感染大腸桿菌的小鼠采食量影響，結(jié)果如圖5 所示。第3 天攻毒后除空白組外，其余5 組采食量均出現(xiàn)明顯的降低，第8 天時，20%氟苯尼考組、高、中劑量組的采食量有較為明顯的上升，到第10 天時采食量已經(jīng)接近空白組，低劑量組采食量增長緩慢，而攻毒組的采食量在攻毒下降后沒有增長的趨勢。

4 討論

4.1 小鼠大腸桿菌病病理模型的建立

建立細菌性疾病病理模型是研究抗菌藥物抗菌活性最常用的方法之一，從而為臨床應用提供劑量參考。趙榮山[5]曾報道稱腹腔注射2.7×108CFU/mL 大腸桿菌菌液成功構(gòu)建小鼠大腸桿菌病模型；李春花[6]則用1.4×1011CFU/mL 大腸桿菌菌液構(gòu)建了小鼠大腸桿菌病模型。綜合他人的研究經(jīng)驗和結(jié)果，本試驗在構(gòu)建大腸桿菌病病理模型時，按照10 的倍數(shù)稀釋菌液，經(jīng)試驗最終確定攻毒劑量為0.2mL 2.16×108CFU/mL，能夠滿足臨床藥效試驗評價要求并成功構(gòu)建小鼠大腸桿菌病的病理模型。本試驗最終確定的菌液濃度與已有報道的菌液濃度不同，可能是不同血清型的大腸桿菌致病力不同，或者是同種動物不同個體對同一病原體有不同的抵抗力。所以，在構(gòu)建動物病理模型時還需考慮試驗動物的品種、大小和病原微生物的種類等相關(guān)因素。

4.2 影響中藥治療效果的因素

臨床藥效試驗結(jié)果證明金黃湯劑對大腸桿菌有較好的治療作用，但與抗生素比較相對較弱，這可能與中藥有效成分提取方法和抗菌機制有關(guān)。孫春華[7]和張洪利[8]發(fā)現(xiàn)對同種中草藥，若采用不同的提取方法，金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果就會不同。在抗菌和治療機制上，中藥多是通過增強動物機體免疫力來起到治療作用[9]，在細菌毒素清除效果上不及抗生素，故其治療效果會產(chǎn)生差異。本試驗中金黃湯劑的總有效率雖與20%氟苯尼考沒有顯著性差異，但是總有效率不及抗生素，可能是該復方中藥的抑菌機制和氟苯尼考不同所致，故在日后生產(chǎn)臨床治療中，需要考慮上述問題。

4.3 金黃湯劑對小鼠治療情況

從最終的試驗結(jié)果分析，金黃湯劑高劑量組能夠減少小鼠的死亡數(shù)，其治療效果與氟苯尼考對照無明顯差異，中劑量組效果次之，而低劑量組的死亡數(shù)較高，對大腸桿菌的治療效果較差；各組總有效率經(jīng)卡方檢驗后，高、中劑量組與20%氟苯尼考組間差異不顯著，說明金黃湯劑對大腸桿菌病有較好的治療效果，在生產(chǎn)以及臨床用藥上有一定的應用前景。

但在試驗中，高、中劑量組在治療劑量上相差一倍，治療效果卻差異不顯著，且各組小鼠在第7 天（治療第4 天）后很少在發(fā)生死亡現(xiàn)象，第8 天（治療第5 天）后已接近正常采食量。因此，綜上因素推薦中劑量0.4mL 作為小鼠用藥的治療劑量。

5 結(jié)論

通過大腸桿菌建立小鼠發(fā)病動物模型，在小鼠體重20g 條件下，按照0.4mL 連用7d 的劑量對小鼠進行灌服，治療5d 后小鼠發(fā)病癥狀有明顯好轉(zhuǎn)。