梁 健 蘇 睿 宋泉生 伍 亮

骨缺損(bone defect)是指因感染、創(chuàng)傷、腫瘤等因素引起的骨質短缺、骨的結構完整性破壞,增加了骨折不愈合、延遲愈合及骨不連的風險,提高了患肢功能障礙及殘疾概率的疾病[1]。骨骼對于較小的缺損具有自我修復的能力,但較大面積缺損會嚴重影響骨骼的完整性,導致骨骼無法自我修復[2]。骨移植技術被認為是修復骨缺損的有效方式,常見的骨移植材料有自體骨、同種異體骨和人工骨,其中自體骨因具有良好的組織相容性,移植后不會產生免疫排斥反應,是治療骨缺損的金標準,但因其供應的骨量有限,且容易引起供體部位的感染、不愈合等并發(fā)癥,難以應用于大面積骨缺損的修復,限制了其在臨床上的應用[3,4]。異體骨移植會產生免疫排斥反應,增加傳染病的風險,且價格相對昂貴,難以普及臨床[5]。隨著組織工程的飛速發(fā)展,研究發(fā)現,負載中藥活性單體的復合支架對于骨缺損的治療具有明顯的促進作用[6,7]。

柚皮苷(naringin, NAR)是一種黃酮類化合物,是中藥骨碎補的主要有效活性單體成分,可以通過提高堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性、Runt相關的轉錄因子2(RUNX2)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)等成骨相關基因的表達促進骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化,促進成骨細胞的鈣化,并可改變核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)相互作用和誘導破骨細胞凋亡來抑制破骨細胞生成[8,9]。此外,還具有良好的促進血管生成的作用。將柚皮苷與生物支架制成復合物,可以有效修復骨缺損。本文通過總結應用負載柚皮苷的支架材料修復骨缺損的相關研究進行綜述,以期為后續(xù)的臨床和科研工作者提供相應依據。

一、柚皮苷對骨細胞的影響

1.柚皮苷對成骨細胞的影響:骨組織的穩(wěn)定依賴于成骨細胞與破骨細胞分化和凋亡的動態(tài)平衡,當這種平衡被打破,將會導致骨代謝疾病的發(fā)生[10]。成骨細胞是調節(jié)骨形成的細胞,對骨骼的生長和維持至關重要,通過分泌相關活性物質骨鈣素、硬化素等,促進骨形成,維持骨量的相對穩(wěn)定[11]。

劉小坡等[12]應用柚皮苷灌服老年大鼠骨質疏松性骨折模型發(fā)現,4周后能明顯觀察到大鼠股骨組織骨小梁數量明顯增加,并且出現較多的成熟小梁狀骨,同時BMP-7的表達量明顯上調,表明柚皮苷可以促進新骨形成。侯婷婷等[8]通過使用含有柚皮苷的復合支架對人牙髓干細胞進行體外培養(yǎng)發(fā)現,應用含有柚皮苷的復合支架可以增加ALP的活性,提高RUNX2、BMP-2蛋白的表達量,促進礦化結節(jié)的形成,表明柚皮苷可以促進人牙髓干細胞的增殖以及成骨分化。覃浩然等[13]通過使用不同濃度的柚皮苷對兔骨髓基質細胞進行體外干預發(fā)現,48h后細胞內有明顯的鈣沉積物形成,并且可增加細胞內骨保護素(osteoclastogenesis inhibitory factor,OPG)、RUNX2 mRNA和蛋白表達水平,促進兔骨髓基質細胞成骨分化。

2.柚皮苷對破骨細胞的影響:破骨細胞是骨組織中唯一的骨吸收細胞。RANKL/RANK/OPG信號通路是調節(jié)破骨細胞分化、成熟的重要信號通路[14]。破骨細胞分泌的受體RANK是成骨細胞所分泌的RANKL的信號受體,兩者相互結合可促進破骨細胞的活化和成熟,并且抑制其凋亡[15]。OPG是一種調節(jié)骨吸收的可溶性蛋白,又稱破骨細胞生成抑制因子,具有誘導破骨細胞凋亡、抑制骨吸收的作用[16]。OPG可競爭性結合RANK,阻斷RANKL與RANK結合,阻止破骨細胞的分化和成熟,發(fā)揮骨保護因子的作用[15]。

秦紅霞等[16]對成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)進行培養(yǎng),3天后檢測OPG和RANKL的表達水平,發(fā)現在脂多糖刺激下OPG表達水平均較低,RANKL表達水平較高,而加入柚皮苷后能明顯增加成骨細胞增殖能力、ALP活性,同時提高OPG/RANKL的比值,表明柚皮苷通過上調成骨細胞OPG/RANKL的比值,抑制破骨細胞的分化和骨吸收。此外,趙志虎等[15]研究顯示,在成骨細胞-破骨細胞共培養(yǎng)體系中,柚皮苷可以促進成骨細胞OPG、RANKL的表達,提高OPG/RANKL的比值,抑制破骨細胞的分化。

二、負載柚皮苷的羥基磷灰石復合材料

羥基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)和納米羥基磷灰石(nano-hydroxyapatite, n-HAP)具有良好的生物相容性、生物活性、生物降解性、無毒性和骨傳導性,在體內能夠與骨骼形成強有力的結合,并讓藥物緩慢結合并釋放到骨骼上,在降解同時釋放的無機離子可誘導骨生長,促進骨缺損的修復,作為促進骨再生的藥物輸送載體而受到骨組織工程的廣泛關注[17,18]。

1.柚皮苷復合納米羥基磷灰石-膠原蛋白:nHAp是人體骨、牙無機組成的主要成分,植入體內后可被人體組織吸收和取代,有效促進骨骼的生長,是一種理想的骨修復材料,被廣泛應用于骨科、口腔組織工程等領域[19,20]。膠原具有良好的生物相容性,有助于促進細胞的增殖和成骨分化[21]。納米羥基磷灰石/膠原(collagen, COL)復合材料結合了納米羥基磷灰石、膠原的優(yōu)勢,具有良好的生物相容性、可降解性以及骨傳導性,通過提高血管內皮生長因子水平促進局部微血管的形成,加速骨缺損部位修復,是一種相對理想的、新型可降解的骨替代材料[22]。侯婷婷等[8]研究發(fā)現,柚皮苷-羥基磷灰石/膠原復合支架(NAR-HAP/COL)具有良好的結構和生物性能,在體內不易降解,能夠為種子細胞的生長、增殖、分化和黏附提供優(yōu)良條件,在體外可促進人牙髓干細胞的增殖以及成骨分化。左艷萍等[23]采用原位合成法制備柚皮苷-納米羥基磷灰石膠原復合材料(NAR-nHAP/COL),發(fā)現該材料抗壓強度為119.74MPa,與人體骨骼接近,且柚皮苷的化學結構基本穩(wěn)定,性能良好,有利于柚皮苷生物活性的發(fā)揮。然而,李晉玉等[24]將骨碎補總黃酮置于納米羥基磷灰石-膠原復合材料與成骨細胞-血管內皮細胞共培養(yǎng)體系中發(fā)現,成骨細胞和血管內皮細胞均表現出良好貼附、生長和增殖能力,但骨碎補總黃酮并不能促進該共培養(yǎng)體系中血管內皮細胞的增殖,認為血管內皮細胞的增殖可能與成骨細胞分泌成纖維細胞生長因子-2 (fibroblast growth factor-2, FGF-2)有關。

2.柚皮苷復合羥基磷灰石-殼聚糖:殼聚糖是一種具備良好的生物相容性、吸附性、生物降解性以及骨傳導性的聚合物,在促進神經修復、傷口愈合、藥物運輸方面具有較大優(yōu)勢,是治療骨缺損的理想材料[25]。梁衛(wèi)寰等[26]采用共沉淀的方法制備載柚皮苷的羥基磷灰石/殼聚糖人工骨載藥體系,發(fā)現該復合物具有良好的抗壓強度以及藥物緩釋作用,在降解的過程中可以緩慢釋放柚皮苷,可持續(xù)地發(fā)揮促進成骨的作用,并且其藥物釋放速率以及降解速率隨殼聚糖含量的增大而增大。盧育南等[27]將柚皮苷-殼聚糖/羥基磷灰石復合支架植入大鼠顱骨骨缺損模型中,4周后發(fā)現該支架可提高缺損部位骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和血管內皮生長因子的表達,同時CT掃描顯示新生骨廣泛填充了缺損孔隙,骨缺損修復良好,與對照組比較,殼聚糖/羥基磷灰石為柚皮苷提供了良好的載體,加速新生骨組織的形成。

3.柚皮苷復合羥基磷灰石-絲素蛋白:絲素蛋白(silk fibroin, SF)作為一種天然聚合物,具有優(yōu)異的機械強度、良好的生物相容性、可塑性以及生物可降解性,可與其他生物材料結合形成復合支架,模擬自然骨環(huán)境,誘導成骨,是目前組織工程中的研究熱點材料之一[28]。Zhao等[29]研究發(fā)現,運用鑲嵌柚皮苷的復合絲素蛋白/羥基磷灰石 (NG/SF/HAP) 支架培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞,與不含柚皮苷的SF/HAP支架比較,柚皮苷可以促進人臍帶間充質干細胞長入SF/HAP支架并促進成骨分化,并且在 NG/SF/HAP支架中培養(yǎng)的細胞的成骨和血管生成能力優(yōu)于在 SF/HAP支架中培養(yǎng)的細胞,表明摻入柚皮苷的SF/HAP復合支架具有具有骨誘導性、血管生成活性以及骨再生的潛力。Yu等[30]先把柚皮苷加載到明膠微球(GM)中,在將這些微球被封裝在絲素蛋白 (SF)/納米羥基磷灰石 (nHAP) 支架中制成柚皮苷/明膠微球/納米羥基磷灰石/絲素蛋白 (NG/GMs/nHAP/SF)三維支架,并指出該支架具有良好的生物相容性、生物力學強度,并促進BMSCs黏附、增殖和體外鈣結節(jié)的形成,植入實驗動物體內后可促進骨缺損的修復。

三、展 望

柚皮苷是中藥骨碎補的主要有效單體成分,是一類天然存在的二氫黃酮類化合物?，F代藥理學研究發(fā)現,柚皮苷可通過促進成骨細胞的增殖和抑制破骨細胞的分化,進而促進骨形成,調節(jié)骨代謝,可用于治療骨質疏松癥、骨缺損等骨科疾病。羥基磷灰石是一種天然的生物材料,是人體骨骼中的主要無機成分之一,具有良好的生物相容性、降解性和骨傳導性,可與膠原蛋白、殼聚糖、絲素蛋白等生物材料結合形成復合支架,并作為藥物載體負載柚皮苷,增強成骨分化、促進骨形成的能力,是組織工程的研究熱門材料,可用于骨缺損的修復。目前,負載柚皮苷的羥基磷灰石復合支架材料修復骨缺損仍處于細胞實驗和動物實驗階段,均取得明顯的修復骨缺損的治療效果,在理論和實踐上表明了負載柚皮苷的羥基磷灰石復合支架材料的安全性和有效性,然而,尚未有關于臨床應用的報道。隨著骨組織工程和再生醫(yī)學的飛速發(fā)展,期望今后深入開展負載柚皮苷的羥基磷灰石復合支架研究,為骨缺損的治療提供更多途徑。