劉北安，張詠鑫，葉 琳*

（1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518020 ；2.深圳市眼科醫(yī)院，暨南大學(xué)附屬深圳眼科醫(yī)院，深圳市眼病防治研究所，廣東 深圳 518040）

淚液是由淚腺分泌的水樣液體，由多種成分構(gòu)成，如蛋白質(zhì)、糖類、脂類、水和電解質(zhì)等[1]。淚液成分的相對穩(wěn)定是眼部健康的基本前提，而其成分顯著變化會引起一系列眼部疾病。近年來，關(guān)于淚液的研究逐漸成為熱點。有學(xué)者認(rèn)為，可以此為突破口進(jìn)一步探究眼科相關(guān)疾病的診斷及治療。本文從淚液采集、淚液成分檢測方法和淚液成分檢測在眼部疾病診治中的應(yīng)用三個方面闡述淚液檢測的相關(guān)研究進(jìn)展，為眼科臨床工作提供參考。

1 淚液采集和保存

研究發(fā)現(xiàn)，淚液收集方法的選擇關(guān)系著樣本質(zhì)量，因此需要采用合適的收集方法。為了保證樣本質(zhì)量以及研究結(jié)果的可信度，應(yīng)在無刺激、麻醉的條件下收集。目前收集的方法有以下幾種：玻璃微毛細(xì)管采集法、Schimer 試紙收集法和纖維素海綿收集法。進(jìn)行大量淚液成分的檢測時，主要是采用玻璃微毛細(xì)管收集樣本，且此法比較利于后期成分的分析[2]。干眼癥患者由于眼淚少，用玻璃微毛細(xì)管難以收集。對于干眼癥患者、敏感患者和兒童，Schirmer 試紙收集是一種較為簡便而快捷的方法。但是，試紙條離心后所得樣本量較少，離心操作還會引起強(qiáng)烈反應(yīng)，引起不必要的分析物稀釋[3]。纖維素海綿是從眼外收集眼淚，對患者刺激小，但某些細(xì)胞因子容易與海綿結(jié)合，在提取過程中造成困難，且這種方法也可能刺激眼淚分泌反射，引起不必要的稀釋。

除了上述收集淚液方法外，王東華教授提出，在淚液采集過程中可使用淚小管吻合術(shù)中的硅膠管，此方法對眼表的刺激最小、淚液采集量較大；但是，尚有不少問題有待解決，如在顯微鏡下采集眼淚時硅膠管的最佳傾斜角度、硅膠管的重復(fù)利用率以及成本問題等。隨著相關(guān)研究的不斷深入，研究人員開始使用眼前接觸尖端（PCT）來獲取樣本。研究人員指出，此方法與使用玻璃毛細(xì)管相比，安全性更高，患者易于接受。除了收集方法的影響，標(biāo)本的保存方法也同樣干擾淚液成分，目前研究認(rèn)為，淚液標(biāo)本的保存溫度包括4℃、-20℃、-70℃以及-80℃（具體根據(jù)用途確定）。

2 淚液成分檢測

淚液成分檢測包括免疫組分檢測、蛋白質(zhì)組學(xué)檢測及其他分子的檢測。淚液中的免疫組分較為復(fù)雜，比如有腫瘤標(biāo)志物、自身抗體等。而在這些組分中，腫瘤標(biāo)志物、自身抗體、IgE 有較強(qiáng)的特異性，對疾病的治療起著非常關(guān)鍵的作用。需要指出的是，細(xì)胞因子的檢測不能直接診斷疾病，然而臨床醫(yī)師可基于檢測結(jié)果評估患者的免疫狀態(tài)，有助于病因分析，為干預(yù)方案的制定提供支持。免疫組分主要成分為蛋白質(zhì)，檢驗與蛋白組學(xué)檢測手段類似。隨著質(zhì)譜技術(shù)及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，淚液的蛋白質(zhì)檢測也起著越來越重要的作用，為人類研究眼部疾患發(fā)病機(jī)制、進(jìn)行疾病的診治提供依據(jù)。據(jù)文獻(xiàn)報道，淚液中含1543 種蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)對眼部功能的維持具有重要作用，如殺菌保護(hù)作用、參與免疫反應(yīng)、清除脂質(zhì)穩(wěn)定淚膜、濕潤角膜以及為結(jié)膜角膜等提供營養(yǎng)，并可加快眼表上皮愈合?，F(xiàn)階段，醫(yī)學(xué)界已經(jīng)提出了眾多檢測淚液蛋白的方法，其中比較常用的是液相多重珠陣列、固相芯片膜微陣列、同位素標(biāo)記相對和絕對定量等[4]。

3 淚液成分檢測在眼部疾病診治中的應(yīng)用

3.1 干眼癥

干眼癥是最常見的一種眼部疾病。本病是多種因素共同作用的結(jié)果，病理特征為淚膜不穩(wěn)定，并伴有多種眼部癥狀。其病因包括淚膜不穩(wěn)定、高滲透性、眼表炎癥損傷以及神經(jīng)感覺異常等。目前已有許多關(guān)于干眼癥的淚液蛋白組學(xué)研究，據(jù)文獻(xiàn)報道干眼癥患者的淚液中蛋白比健康人群多，并指出本病的形成主要與異常蛋白質(zhì)引起的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。迄今為止，許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種干眼癥患者淚液中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。Perumal 等[5]利用蛋白組學(xué)研究方法對健康組和患者組的淚液樣本進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)患者組淚液中S100-A8 蛋白顯著增加，且含有大量的蛋白4、蛋白3 等；同時，與健康組相比，該組樣本中細(xì)胞外糖蛋白、α- 烯醇化酶等含量較少。Zhou 等[6]在干眼癥患者淚液中發(fā)現(xiàn)了多種下調(diào)的蛋白質(zhì)，比如載脂蛋白-1、乳鐵蛋白等，以及6 種表達(dá)呈上升趨勢的蛋白質(zhì)，其中包括α1酸性糖蛋白1、S100A8/ 鈣粒蛋白、S100A9/ 鈣粒蛋白B。其他研究也證實這些下降的蛋白在干眼癥患者淚液中的含量越少，疾病越嚴(yán)重[7]。Versura 等[8]在總結(jié)前人研究經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，對比蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼患者和正常人淚液蛋白質(zhì)的差異，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白-1、乳鐵蛋白和親脂蛋白A-C 含量均降低，清蛋白含量上升，而鋅-α2糖蛋白水平維持在恒定狀態(tài)。干眼癥患者淚液中涉及的蛋白質(zhì)改變復(fù)雜多樣，目前尚未有統(tǒng)一的結(jié)論，但不可否認(rèn)的是大部分蛋白質(zhì)的變化與免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此，這提示我們，臨床上關(guān)于干眼癥的治療可集中于抗炎及免疫調(diào)節(jié)。

3.2 過敏性結(jié)膜炎

過敏性結(jié)膜炎是一種常見病和多發(fā)病，從本質(zhì)上看，屬于變態(tài)反應(yīng)性疾病。本病的形成與眾多因素有關(guān)，一般呈季節(jié)性發(fā)作?？蓪⑵溥M(jìn)一步細(xì)分為巨乳頭性結(jié)膜炎、春季角結(jié)膜炎等。已有多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)，此病患者的淚液成分會發(fā)生變化。其中比較具有代表性的研究是，Li 等[9]發(fā)現(xiàn)患者淚液樣本中總蛋白濃度及部分淚液蛋白含量增多，其中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的含量增加較明顯。Leonardi 等[10]發(fā)現(xiàn)春季角結(jié)膜炎患者淚液樣本的組分也會發(fā)生顯著變化，其中血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白含量較健康組多，且差異顯著；由此得出的結(jié)論是，淚液蛋白升高的程度與眼病嚴(yán)重程度相關(guān)，同時其轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅素、乳球蛋白β 表達(dá)明顯增加。研究發(fā)現(xiàn)，過敏性結(jié)膜炎患者淚液樣本中組分較正常人更高的還有嗜酸細(xì)胞陽離子蛋白、IgE等[11]。許多研究還顯示，過敏性結(jié)膜炎患者淚液樣本中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、γ 干擾素、TFN-α 的濃度均有不同程度的增高[12]。有人發(fā)現(xiàn)，春季角結(jié)膜炎患者淚液中MMP-1、MMP-9 的水平和活性明顯增加[13]。總而言之，大量實驗表明過敏性結(jié)膜炎患者淚液中促炎細(xì)胞因子的數(shù)量較正常人更多，故而在干預(yù)時要以遠(yuǎn)離變應(yīng)原和抗炎治療為主。

3.3 甲狀腺相關(guān)性眼?。═AO）

甲狀腺相關(guān)性眼病（thyroid associated ophthal mopathy，TAO）是由甲狀腺功能障礙引起的自身免疫性疾病，是成人常見的眼眶病。近年來，為更好地評估TAO 的活動性及分層，許多學(xué)者對TAO 患者的淚液進(jìn)行分析。有人經(jīng)過一系列檢測發(fā)現(xiàn)在TAO患者的淚液樣本中有多種細(xì)胞因子的表達(dá)升高，如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-18 和TFN-α。Huang 等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)，活動期TAO 組淚液中IL-6、IL-8 的水平明顯高于靜止期TAO 組及正常對照組；活動期TAO 組與靜止期TAO 組TNF-α 的水平均明顯高于正常對照組；與正常對照組相比，活動期TAO 組的IL-17 水平更高，靜止期TAO 組的IL-2 水平更高。Song 等研究發(fā)現(xiàn)，TAO 患者淚液中CD40、CD40 配體、IL-21、IL-6 和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3α 的表達(dá)增加，而GM-CSF、IL-1SRI 和IL-13 表達(dá)下降。Chen等研究發(fā)現(xiàn)TAO 患者眼淚樣本中含量較正常人更高的組分有IL-15 和IL-17。Cai 等也展開了類似研究，并發(fā)現(xiàn)靜止期IL-7 的含量最高，活動期則恰好相反。由此得出的結(jié)論是，IL-7 在眼表免疫平衡中扮演著重要角色。以上研究表明，炎癥損傷是TAO 眼表病變的主要誘發(fā)因素。此外，江利紅等[15]發(fā)現(xiàn)TAO 患者淚液中的溶菌酶數(shù)量較正常人更多，同時乳鐵蛋白水平上調(diào)。由此得出，它們可能參與了TAO 的炎癥反應(yīng)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起組織損傷，加速炎癥的進(jìn)展。Aass 顯示，TAO 患者淚液中有多種蛋白的水平失調(diào)，這些蛋白可能有助于更好地了解TAO。尤其是溶菌酶C、催淚蛋白、抗白蛋白酶和鋅結(jié)合α2- 糖蛋白1 的上調(diào)提示淚腺會參與TAO 的發(fā)病。以上研究結(jié)果提示，TAO 患者的淚液成分可以幫助人們更好地揭示本病的形成原理、可作為早期疾病診斷的生物標(biāo)志物，并啟發(fā)我們探索新的TAO 治療方案。

3.4 圓錐角膜

圓錐角膜（keratoconus，KC）是我國重要的致盲性眼病之一，危害性較大。該病的病因復(fù)雜，治療困難，預(yù)后效果差。有研究指出，探討用于KC 早期診斷的生物標(biāo)志物將對臨床干預(yù)本病有重要意義。You 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，KC 患者淚液中糖蛋白類分泌型卷曲相關(guān)蛋白-1（secreted frizzled-related-protein-1，SFRP-1）的水平顯著降低。Jun 等[17]發(fā)現(xiàn)KC 患者淚液中IL-6 的水平升高，而IL-12、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-13 和CCL5 的 水 平 降 低。Yenihayat 等[18]發(fā)現(xiàn)KC 患者淚液中角蛋白Ⅱ型細(xì)胞骨架1、血清清蛋白、免疫球蛋白γ-1、載脂蛋白A1 等的表達(dá)減少，與此同時，樣本中溶菌酶C、脂蛋白的表達(dá)增加，因此推測這些蛋白與KC 的形成有關(guān)。Pannebaker 等[19]做了更進(jìn)一步的研究，結(jié)果表明，KC 患者M(jìn)MP-1 的表達(dá)增加，推測一些特征性蛋白質(zhì)也參與了KC 的發(fā)生和發(fā)展，但是這些蛋白如何作用于KC 的發(fā)生和發(fā)展仍需要進(jìn)一步探討。Balasubramanian 等研究發(fā)現(xiàn)，KC 患者眼淚中組織蛋白酶B 的水平會升高3 倍多，而聚合免疫球蛋白受體的數(shù)量則明顯減少，纖維蛋白原α 鏈的水平明顯下降，抑素s 和胱抑素SN 的含量也顯著降低。有研究人員指出，角蛋白1 型細(xì)胞骨架14 僅存在于KC 患者的眼淚中。他們認(rèn)為淚液中蛋白質(zhì)的變化（即蛋白酶抑制劑含量的降低以及蛋白酶含量增多）可反映KC 所涉及的分子機(jī)制，為KC 的治療及預(yù)防提供指導(dǎo)。Shetty 等發(fā)現(xiàn)KC 患者淚液中MMP-9 和IL-6 水平較高，并提出環(huán)孢素A 可用于治療KC。Sorkhabi 等發(fā)現(xiàn)KC 患者淚液中IL-10 的水平明顯低于對照組，而IL-6、IL-1β、IFN-γ 則明顯增加，表明KC 的發(fā)病機(jī)制可能涉及復(fù)雜的慢性炎癥事件。以上關(guān)于KC 淚液分析的研究都為KC 的診斷和治療提供了新的思路，但是具體的治療方案仍需要大量的實驗論證。

3.5 青光眼

青光眼是不可逆性失明的重要影響因素，早期診斷仍缺乏有效途徑。Pieragostino 等[20]在研究中發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，未接受治療原發(fā)性開角型青光眼（POAG）患者的淚液中有25 種上調(diào)蛋白。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白直接參與了炎癥反應(yīng)、自由基清除等過程。經(jīng)前列腺素類似物（PGA）治療后，POAG 患者的淚液中有12 種上調(diào)蛋白被下調(diào)。Roedl等[21]發(fā)現(xiàn)，POAG 患者淚液中同型半胱氨酸含量較正常人更多，這表明淚液中同型半胱氨酸含量較高可能是青光眼發(fā)生的危險因素。Ghaffariyeh 等[22]對正常眼壓性青光眼（normal-tension glaucoma，NTG）和健康對照組淚液中的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，相比于健康對照組，NTG 患者淚液中BDNF 的含量較低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；由此可見，眼淚中的BDNF 可能是早期檢測NTG 的有效生化標(biāo)志物。Wong 等通過鑒定124 種淚液蛋白發(fā)現(xiàn)，長期使用抗青光眼藥物的患者（藥物治療組）與非藥物治療組比較，S100-A9、S100-A8 的水平顯著增加，干預(yù)時間不足一年患者的淚液樣本中脯氨酸豐富蛋白4 的含量較少。此外還發(fā)現(xiàn)，患者若使用局部抗青光眼藥物1年以上，其眼表發(fā)生炎癥反應(yīng)的概率更高，這一研究結(jié)論對青光眼的干預(yù)具有重要意義。

4 總結(jié)

綜上所述，淚液成分檢測可用于多種眼部疾病的病因研究、輔助診斷、治療和治療監(jiān)測，進(jìn)而改善患者的生活質(zhì)量。需要指出的是，盡管目前部分眼科疾病的淚液成分檢測仍缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展以及相關(guān)研究的不斷深入，淚液成分檢測有望成為眼科疾病診療的重要步驟。淚液成分檢測有著許多優(yōu)點，如淚液標(biāo)本采集無創(chuàng)、所需淚液樣本少、檢測準(zhǔn)確性高、檢測速度快、操作簡便、經(jīng)濟(jì)可靠等。因此，淚液成分檢測有良好的臨床應(yīng)用前景，值得在臨床上大力推廣。