陳曉靜

結(jié)直腸癌為臨床常見病,且近年因人們生活結(jié)構(gòu)與飲食習(xí)慣的不斷轉(zhuǎn)變,促使該病的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,臨床尚未完全明晰,通常認(rèn)為該病是遺傳、環(huán)境等多種因素共同作用而引發(fā)[3-4]。結(jié)直腸癌病死率較高,及時(shí)明晰本病的發(fā)病機(jī)制,指導(dǎo)臨床施行針對(duì)性的治療,對(duì)于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。伴隨分子生物學(xué)與遺傳學(xué)的持續(xù)發(fā)展,臨床在分子水平致癌機(jī)制的研究中愈發(fā)深入。環(huán)氧化酶-2(COX-2)能夠于病理?xiàng)l件下被多種損傷迅速激活,尤其是在惡性腫瘤中表現(xiàn)為高表達(dá)[5]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)是該病的發(fā)病原理之一,但臨床關(guān)于微衛(wèi)星穩(wěn)定性(MSS)與結(jié)直腸癌發(fā)生的關(guān)系并不明確[6]。MSS說明腫瘤發(fā)生的過程無錯(cuò)配修復(fù)基蛋白(MMR)參與,存在其他分子機(jī)制?；诖?本研究分析兩者表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征以及預(yù)后之間的聯(lián)系,以及時(shí)明晰結(jié)直腸癌患者的發(fā)病機(jī)制,指導(dǎo)臨床進(jìn)行針對(duì)性的治療。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2018年2月至2019年2月收治的64例結(jié)直腸癌患者,采集所有患者的病灶組織新鮮樣本(病灶組)與正常腸黏膜(距癌組織≥5 cm)新鮮標(biāo)本(對(duì)照組)。納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者的病歷有關(guān)資料齊全;患者經(jīng)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢查證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn):存在酒精、藥物依賴史者;合并凝血功能異常者;存在免疫系統(tǒng)病癥者;嚴(yán)重電解質(zhì)紊亂者;合并嚴(yán)重的腦器質(zhì)性疾病者;存有心肝腎等重要臟器功能不全者;合并血液系統(tǒng)疾病者;存有精神疾病,無法配合進(jìn)行研究者。所有患者中男性38例,女性26例;年齡34～75歲,平均年齡(61.48±2.39)歲;腫瘤直徑3～9 cm,平均直徑(6.45±0.87)cm;分化程度:25例高分化,18例中分化,21例低分化;臨床分期:35例Ⅰ+Ⅱ期,29例Ⅲ+Ⅳ期。

1.2 方法

標(biāo)本采集:采集全部患者病灶組織新鮮樣本與正常腸黏膜(距癌組織≥5 cm)新鮮標(biāo)本,全部樣本均經(jīng)由10%福爾馬林固定,脫水、凈蠟、包埋,切成4 μm切片,之后評(píng)分為兩份,于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。COX-2、MSS檢測(cè):采用免疫組化法檢測(cè)COX-2表達(dá),應(yīng)用3%過氧化氫(H2O2)室溫賦育10 min去除過氧化物酶,微波爐內(nèi)高溫抗原修復(fù)10 min;二甲苯脫脂后,行免疫組織化學(xué)染色,COX-2滴加抗COX-2單克隆抗體(稀釋度1∶200,北京中杉金橋生物計(jì)數(shù)有限公司),陰性對(duì)照組以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗,于4 ℃環(huán)境下過夜,之后以PBS反復(fù)清洗3次,5 min/次,蘇木精染色,封片鏡檢。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):嚴(yán)格按照染色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞所占百分比乘積判定,其中染色強(qiáng)度:0分:無色;1分:淡黃色;2分:棕黃色;3分:棕褐色。陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分:計(jì)數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞,陽性表達(dá)率10%之下提示無明顯陽性反應(yīng),10%以上提示陽性反應(yīng),其中陽性表達(dá)率≤5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,>50%為3分;兩者相乘為最終評(píng)分,其中陰性為0～1分,陽性為2分及以上。MSS檢測(cè):采用免疫組化法測(cè)定病灶組織內(nèi)錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表達(dá),固定病灶組織,包埋,石蠟切片;考片、脫蠟后,以PBS清洗3次,3 min/次,之后以30%H2O2-甲醇混合液浸泡切片10 min,放進(jìn)染缸(檸檬酸鈉),煮沸10 min,恢復(fù)到室溫;之后依據(jù)1∶300稀釋兔抗MLH1、MSH2、MSH6、PMS2,50 μL滴至切片組織之上,于4 ℃環(huán)境下過夜;完畢后室溫平衡0.5 h,PBS洗滌3次,二抗于組織之上,并以室溫溫育0.5 h;染色、水洗、吹干,封片鏡檢。陽性判斷:MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均不見表達(dá)缺失(即染色均為陽性)判定為陽性;陰性判斷:4個(gè)修復(fù)蛋白內(nèi)任意1個(gè)或1個(gè)以上表達(dá)缺失則判斷為陰性。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)病灶組與對(duì)照組COX-2、MSS陽性表達(dá)率對(duì)比。(2)COX-2、MSS表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。(3)COX-2、MSS陽性表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 病灶組與對(duì)照組COX-2、MSS陽性表達(dá)情況對(duì)比

病灶組COX-2、MSS陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見表1。

2.2 COX-2、MSS表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

COX-2、MSS陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05);與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及腫瘤直徑密切相關(guān)(P<0.05),見表2。

表2 COX-2、MSS表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系(例,%)

2.3 COX-2、MSS陽性表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier結(jié)果顯示:COX-2、MSS陽性表達(dá)患者的3年生存率明顯低于COX-2、MSS陰性表達(dá)患者,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見圖1～2。

圖2 MSS陽性表達(dá)者Kaplan-Meier生存曲線分析

3 討論

結(jié)直腸癌具有較高的患病率、致死率,亦是影響人們身心健康的重大常見疾病[7-8]。結(jié)直腸癌早期確診、治療后患者預(yù)后較為好,但結(jié)直腸癌早期無明顯特異性癥狀,導(dǎo)致多數(shù)患者經(jīng)臨床診斷時(shí)已位于中晚期,且多伴有轉(zhuǎn)移,難以完全根治,預(yù)后較差[9-10]。因此,需探尋具有特異性的生物標(biāo)志物,以盡早診斷結(jié)直腸癌,從而指導(dǎo)臨床施行更為規(guī)范的個(gè)體化治療,以提高生存率。

COX-2為前列腺素合成所需酶之一,正常組織內(nèi)其較少表達(dá),但在胃癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)為高表達(dá)。相較于MSI,MSS指的是MLH1、MSH2、MSH6 3個(gè)MMR均無表達(dá)缺失,存在其他分子機(jī)制致癌。但臨床關(guān)于COX-2、MSS與結(jié)直腸癌患者的關(guān)系尚未探明,還需進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果顯示,病灶組的COX-2、MSS陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組,表明COX-2、MSS與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系緊密。其原因?yàn)镃OX-2存在原癌基因活性,可參與細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲并阻礙細(xì)胞凋亡,并會(huì)加快腫瘤增殖[11-12]。而MMS能夠激活下游TGF-β/Smads信號(hào)通路,從而加快腫瘤惡化[13-14]。本研究結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌患者的COX-2、MSS陽性表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及腫瘤直徑密切相關(guān),說明COX-2、MSS的陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌惡性程度有關(guān)。其原因在于COX-2可加快腫瘤細(xì)胞增殖,增強(qiáng)癌細(xì)胞入侵功能,并阻礙機(jī)體中的抗腫瘤免疫反應(yīng)。COX-2還可通過刺激腫瘤細(xì)胞分泌前列腺素,加快內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng),促使血管形成,并通過提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子濃度,誘導(dǎo)腫瘤血管形成,促使病情加重[15]。本研究Kaplan-Meier結(jié)果顯示:COX-2、MSS陽性表達(dá)患者的3年生存率明顯低于COX-2、MSS陰性表達(dá)患者,差,提示COX-2、MSS陽性表達(dá)的患者預(yù)后較差,臨床需予以積極的重視。

綜上所述,COX-2、MSS在結(jié)直腸癌患者機(jī)體內(nèi)表達(dá)水平較高,COX-2、MSS與患者的臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān),且表達(dá)水平越高則患者預(yù)后越差,臨床可通過檢測(cè)COX-2、MSS水平為患者后續(xù)治療的開展提供參考。