李海泳，李夢鈺，高 闖，許 豪，殷貴鴻，董純豪，牛吉山，李巧云

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)馬克思主義學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家小麥工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州450046；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

病害嚴重影響小麥的產(chǎn)量與品質(zhì)[1]，黑胚病是危害小麥籽粒的病害，其典型癥狀是籽粒胚部有黑∕褐色斑點，嚴重時病斑擴展至整個籽粒并引起籽粒皺縮[2]。小麥黑胚病除影響籽粒外觀、引起小麥?zhǔn)召徏墑e下降而減少麥農(nóng)收入外[3]，還降低種子的發(fā)芽率、抑制小麥幼苗生長[4-5]，此外，感病籽粒中殘留的真菌毒素[6-7]，也嚴重影響國家糧食安全與人民健康。近年來，黑胚病在世界范圍內(nèi)頻繁發(fā)生，成為影響小麥安全生產(chǎn)的重要病害之一[1-2，8-9]。

推廣抗病品種是應(yīng)對黑胚病危害最經(jīng)濟有效的措施，然而小麥黑胚病抗性是數(shù)量性狀[2，8-10]，癥狀的形成與發(fā)展受致病菌與環(huán)境的雙重影響[11-12]，同一小麥品系的調(diào)查結(jié)果在不同的年度及地點間往往不穩(wěn)定[8-9]。以自然條件下的黑胚率為依據(jù)篩選的抗病品系不一定真正抗病，也可能是致病菌菌源不充分或氣象因子不適合導(dǎo)致的結(jié)果[13-14]，前人研究也表明了這一點，如LI 等[15]對自然條件下篩選的155 份抗病小麥品系[4]接種6 種不同的致病菌進行鑒定，只有3.6%、50.9%、60.0%、1.8%、47.3%、58.8%的品系分別抗麥根腐平臍蠕孢（Bipolaris sorokiniana）、鏈格孢（Alternaria alternata）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）、嘴突凸臍蠕孢（Exserohilum rostratum）、附球菌（Epicoccum sorghinum）與Curvularia spicifera引起的黑胚病，而同期自然大田條件下，80.5%以上小麥品系表現(xiàn)抗病。王絲雨等[14]研究也表明，在山農(nóng)4143 和宛原白1 號雜交構(gòu)建的327 個重組自交系群體中，自然大田條件下75.1%的自交系表現(xiàn)抗病，而接種B.sorokiniana條件下，只有25.4%的自交系表現(xiàn)抗病?？梢姡挥性诮泳b定條件下才能篩選真正抗黑胚病的種質(zhì)。受發(fā)病時期的限制，小麥黑胚病的接菌鑒定只能在灌漿期進行[16]，收獲脫粒后才能觀察病情，耗費時間長且程序煩瑣，這給小麥黑胚病抗性育種帶來一定的困難，再加上實用分子標(biāo)記[9-10]與優(yōu)異抗病種質(zhì)資源缺乏的現(xiàn)狀[4，15]，小麥黑胚病抗性育種進展緩慢。

小麥黑胚病致病菌復(fù)雜，涉及6 個屬、8 個種的真菌，其中A.alternata與B.sorokiniana是小麥黑胚病的優(yōu)勢病原菌[5，11，17-18]。除引起黑胚病外，B.sorokiniana還是根腐病、葉枯病、穎枯病等多種小麥病害的致病菌[19-20]。相對于B.sorokiniana引起的其他病害，葉枯病的鑒定，尤其是苗期葉枯病的鑒定比較快，而且鑒定條件可控、鑒定結(jié)果也易于觀察。李巧云等[21]在前期對B.sorokiniana黑胚病與葉枯病聯(lián)合鑒定方法的研究中發(fā)現(xiàn)，B.sorokiniana引起的葉枯病與黑胚病抗性之間存在一定的負相關(guān)現(xiàn)象。如果能以B.sorokiniana葉枯病的病葉面積推測黑胚率，將大大縮短黑胚病抗性鑒定時間、提高鑒定的效率。因此，為進一步分析黑胚率與葉枯病病葉面積的關(guān)系，對經(jīng)接菌鑒定篩選的50個黑胚病抗性不同的小麥品系[15]進行2 a的黑胚病、葉枯病接菌鑒定，分析B.sorokiniana葉枯病與黑胚病之間的相關(guān)性，旨在為小麥育種中黑胚病抗性快速鑒定方法的建立提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與種植

國家小麥工程技術(shù)研究中心遺傳育種課題組（本課題組）前期依據(jù)2010—2012年連續(xù)3 a自然大田條件下的小麥黑胚率，從400 余份育種親本及高代系材料中篩選出抗黑胚病小麥品系155 個[4]，于2016—2017 年連續(xù)2 a 對篩選的抗病品系及部分感病品系接種6 種不同黑胚病致病菌進行鑒定，篩選針對不同致病菌的抗病材料[15]。本研究所用的50份小麥品系是經(jīng)前期接菌鑒定的抗、感B.sorokiniana黑胚病的材料，包括山農(nóng)530070、溫麥10 號、鄭麥366 等6 份抗病材料，溫麥8 號、山農(nóng)4143、GM11-269 等輕感品系18 個，11-252（LWX)、揚麥5 號、周麥19 號等中感品系18 個，11-504（LWX)、國麥222、節(jié)燕98-7等高感品系8個[15]。

在2018—2019 年與2019—2020 年2 個小麥生長季（下文分別簡寫為2019 與2020），將供試50 個小麥品系種植在滎陽試驗田（河南省滎陽市豫龍鎮(zhèn)后王村）。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個材料1 行，3次重復(fù)。行長1 m，行距20 cm，株距5 cm，每年10月中旬種植，人工開溝點播。澆水、施肥管理以及蟲害、草害防治同當(dāng)?shù)赜N田。

1.2 小麥品系黑胚病抗性的接菌鑒定

致病菌為本課題組分離鑒定的小麥黑胚病優(yōu)勢病原菌B.sorokiniana的強致病菌株Ta-BP33[12]。致病菌的擴繁及孢子懸浮液制作參照王絲雨等[14]的方法進行，鑒定用的孢子液濃度為5×104個∕mL。

采用孢子液噴灑+套袋保濕的技術(shù)[21]，參照XU等[11]的程序進行接菌鑒定，即開花期掛牌標(biāo)記生育時期一致的穗子，花后10 d 在標(biāo)記的穗子上噴灑B.sorokiniana孢子液（1.5 mL∕穗）作為B.sorokiniana接種處理（Bs），對照（CK）噴灑滅菌蒸餾水，然后用透明塑料袋保濕5 d。每品系每重復(fù)接菌鑒定5穗。

待小麥成熟時收獲樣品，曬干、手工脫粒后統(tǒng)計每個樣品的病粒數(shù)（病斑直徑＞1 mm）與總籽粒數(shù)，計算黑胚率（X），X=病粒數(shù)∕總粒數(shù)×100%[22]。依據(jù)黑胚率進行黑胚病6 級抗性評價，分別是免疫（I）、高抗（HR）、抗（R）、輕感（SS)、中感（MS）與高感（HS），對應(yīng)的黑胚率（X）分別為X=0、X＜1.9%、2.0%≤X＜4.9%、5.0%≤X＜14.9%、15.0%≤X＜30.0% 與X≥30.0%[4，14-15]。

1.3 小麥品系苗期葉枯病病葉面積測定

參照李夢鈺等[23]的方法進行，于2019年與2020年11月挑選不同小麥品系的健康籽粒，在70%乙醇中浸泡2 min后用滅菌蒸餾水沖洗4次，然后放入直徑9 cm 的培養(yǎng)皿中（提前加2 層滅菌濾紙），每皿5個品系，每個品系15 粒種子，4 次重復(fù)。將每個培養(yǎng)皿加4 mL 滅菌蒸餾水后放在培養(yǎng)箱中，25 ℃暗培養(yǎng)3 d，然后去培養(yǎng)皿蓋子，每個品系留下10 株發(fā)育一致的幼苗，在25 ℃光照11 h∕20 ℃黑暗13 h 交替條件下培養(yǎng)至一葉一心（5 d 左右）。將制備好的B.sorokiniana孢子懸浮液（制備方法及濃度同黑胚病抗性鑒定）用噴壺均勻地噴灑在幼苗葉片上，直至葉片上有液滴落下（約5 mL∕皿），作為B.sorokiniana接種處理（Bs），對照（CK）噴灑滅菌蒸餾水，然后罩上透明塑料罩保濕。25 ℃暗培養(yǎng)24 h后，25 ℃光照11 h∕25 ℃黑暗13 h 交替培養(yǎng)，每天早、晚2次在罩子內(nèi)噴水保濕，培養(yǎng)皿適時補水。在接菌后10 d 調(diào)查并記錄病斑面積，計算病斑面積占葉面積的百分率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2000 整理數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0 單因素方差分析中的Dunnett’s 程序進行黑胚率與病葉面積占比差異比較分析（以抗黑胚病品系山農(nóng)530070為對照），用雙變量相關(guān)（Bivariate correlation）方法進行黑胚率與病葉面積占比之間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 50個小麥品系的黑胚病發(fā)病率與葉枯病病葉面積占比

2 a 間50 個小麥品系黑胚病發(fā)病率（黑胚率）與苗期葉枯病病葉面積占比見表1。從表1 可以看出，在B.sorokiniana侵染條件下，50 個品系的黑胚率為1.7%（山農(nóng)530070，2019 年）～51.4%（鶴0927，2020 年），2 a 的平均黑胚率分別為15.9%與17.4%，而對照（滅菌蒸餾水處理）在2019 年與2020 年的黑胚率分別為2.7%與1.2%，均與接菌處理黑胚率差異顯著（P＜0.01，圖1A）?？梢?，B.sorokiniana侵染明顯加重了小麥黑胚病的發(fā)生。

圖1 接種Bipolaris sorokiniana條件下50個小麥品系的平均黑胚率（A）與病葉面積占比（B）Fig.1 Means of black point incidence and percentage of diseased leaf area among 50 wheat cultivars/lines under artificial inoculation with B.sorokiniana

表1 50個小麥品系的Bipolaris sorokiniana黑胚率與病葉面積占比Tab.1 Black point incidence and percentage of diseased leaf area caused by B.sorokiniana among 50 wheat cultivars/lines

在B.sorokiniana侵染條件下，50 個小麥品系苗期葉枯病病葉面積占比為15.1%（鶴0927，2020年）～96.5%（溫麥10 號，2020 年），2 a 的平均病葉面積占比分別為52.0%與52.7%。對照條件下，50 個供試品系2 a 的平均病葉面積占比分別為3.6%與3.4%，均與接菌處理的病葉面積占比差異顯著（P＜0.01，圖1B）。可見，B.sorokiniana侵染加重了小麥葉枯病的發(fā)生。

2.2 供試小麥品系的黑胚病抗性評價

按照6 級分類法對50 個小麥品系進行黑胚病抗性評價（表2），無論在接菌條件還是在對照條件下，50個小麥品系中沒有對黑胚病免疫的。在接菌條件下，2019 年的抗病與感病品系分別有6 個與44個，分別占供試品系的12.0%與88.0%；2020 年抗病與感病品系分別有5 個與45 個，分別占10.0%與90.0%；2 a均表現(xiàn)為抗病的品系只有3個，分別是山農(nóng)5300709、溫麥10號、11-253（LWX)。在對照條件下，94.0%以上的品系表現(xiàn)抗病，只有1 個品系2 a均表現(xiàn)為輕感黑胚病。

表2 50個小麥品系Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性評價結(jié)果Tab.2 Resistance evaluation of 50 wheat cultivars（lines）to black point caused by B.sorokiniana

2.3 小麥黑胚率與葉枯病病葉面積占比的相關(guān)性分析

將2 a 的黑胚率分別與苗期葉枯病葉面積占比進行相關(guān)性分析（表3），在B.sorokiniana侵染條件下，2019 年與2020 年黑胚率呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)r=0.909；2 a的葉枯病病葉面積占比也呈顯著正相關(guān)（P＜0.01，r=0.921），表明試驗結(jié)果在不同年度間的重復(fù)性較好。

表3 小麥黑胚率與葉枯病病葉面積占比的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between black point incidence and percentage of diseased leaf area of leaf blight in wheat

在接種B.sorokiniana條件下，不同年度的黑胚率與病葉面積占比均呈現(xiàn)顯著的負相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為-0.914～-0.845，以2020 年黑胚率與病葉面積占比的相關(guān)系數(shù)最高。

2.4 小麥品系黑胚病抗性預(yù)測與接菌鑒定結(jié)果的一致性分析

進一步以相關(guān)系數(shù)最高的2020 年小麥黑胚率與葉枯病病葉面積占比進行回歸分析，回歸方程為y=-0.585x+48.444（y與x分別是黑胚率與葉枯病病葉面積占比，圖2），以此回歸方程對50 個供試小麥品系進行黑胚病抗性預(yù)測，其抗感評價結(jié)果與接種B.sorokiniana鑒定評價結(jié)果一致的品系為45 個，預(yù)測準(zhǔn)確率為90.0%（表4）。

圖2 2020年接種Bipolaris sorokiniana小麥葉枯病病葉面積占比與黑胚率的回歸分析Fig.2 Regression analysis between black point incidence and percentage of diseased leaf area of leaf blight under inoculation condition with B.sorokiniana in 2020

表4 小麥品系黑胚病抗性接菌（B.sorokiniana）鑒定結(jié)果與抗性預(yù)測結(jié)果比較Tab.4 Comparison between resistance evaluation resucts under inoculation with B.sorokiniana and resistance prediction results

3 結(jié)論與討論

小麥黑胚病抗性由多基因控制，黑胚率廣義遺傳力在0.50～0.78 變動[4，8，12]。真菌是小麥黑胚病的病因[11，18]，但黑胚病的流行受環(huán)境因素尤其是灌漿期溫度、濕度等氣象因子的影響[12，24-26]。引起黑胚病的真菌種類復(fù)雜，其中A.alternata與B.sorokiniana是小麥黑胚病的優(yōu)勢病原菌[11，18，22]，許多學(xué)者的研究結(jié)果表明，B.sorokiniana的致病性強于A.alternata等其他致病菌[11，18，25]，以B.sorokiniana為致病菌開展研究對黑胚病抗性改良及其防治有重要意義。

在本研究中，B.sorokiniana侵染引起了嚴重的黑胚病，接菌鑒定的黑胚率顯著高于對照，2 a 的抗性鑒定結(jié)果重復(fù)性較好（相關(guān)系數(shù)為0.909），供試50個小麥品系的黑胚率差異顯著，其抗性鑒定結(jié)果與LI 等[15]報道的抗性鑒定結(jié)果基本一致，如6 個抗病品系在本研究中2 a 均抗病的有3 個，其他3 個為1 年抗、1 年輕感（輕感時黑胚率為5.1%～5.6%，略高于5.0%的感病標(biāo)準(zhǔn)）；8 個高感品系的鑒定結(jié)果全部為高感。供試50個小麥品系88%以上表現(xiàn)感病。小麥品系間黑胚病抗性差異較大且抗病品種少，這與前人的研究結(jié)果一致[4，9，13，16]。

在自然大田條件下表現(xiàn)抗病的很多品系，在接菌鑒定時往往感病[14-15]，本課題組前期對依據(jù)自然大田條件下黑胚率篩選的155個抗病品系進行接菌鑒定，只有6 個品系抗B.sorokiniana黑胚病[15]，因此僅僅依據(jù)自然條件下的黑胚率篩選抗病品系，結(jié)果是不太可靠的，要篩選真正的抗病品系，需要進行多年多點的接菌鑒定。然而，小麥黑胚病的接菌鑒定煩瑣、耗時，這在很大程度上制約著高產(chǎn)、抗黑胚病小麥的育種進程。建立黑胚病抗性的快速鑒定方法有助于推進黑胚病抗性改良進程。作為小麥黑胚病的優(yōu)勢病原菌，B.sorokiniana除引起黑胚病外，還是根腐病、葉枯病等多種小麥病害的致病菌[19-20，27]。與黑胚病的接菌鑒定相比，小麥葉枯病的鑒定尤其是苗期的室內(nèi)鑒定比較簡單、快速、條件可控，且不受生育時期的限制。如果可以用葉枯病的病葉面積推測黑胚病的發(fā)病率，將有助于提高黑胚病抗性育種中大量材料的篩選效率。

本研究結(jié)果表明，小麥B.sorokiniana黑胚率與苗期葉枯病的病葉面積占比存在顯著的負相關(guān)關(guān)系，以相關(guān)系數(shù)最高的2020年病葉面積占比與黑胚率的數(shù)據(jù)建立回歸方程，預(yù)測50個小麥品系的黑胚病抗性，與大田鑒定結(jié)果的一致性達到90.0%，為通過苗期葉枯病的病葉面積推測黑胚率提供了依據(jù)。在小麥等作物中，同一種致病菌引起多種病害的情況較為常見，如禾谷鐮刀菌能引起小麥根腐病與赤霉病[28-29]，B.sorokiniana可以引起根腐、葉枯、黑胚病等[27，30]。小麥對B.sorokiniana引起的不同病害的抗病機制可能不同，目前定位到的抗B.sorokiniana葉枯病位點有90 個[30]、抗黑胚病位點有126 個[10]，根據(jù)抗病位點的物理位置，2 種病害約70%抗性相關(guān)位點都不一致，可能意味著2 種病害的抗病機制不一致，另外，因為2 種病害的發(fā)病部位、癥狀形成時期差異較大，即使抗病基因相同，可能還存在其表達的時空特異性問題，究竟為什么B.sorokiniana葉枯病抗性與黑胚病抗性呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系，需要進一步研究。

小麥苗期B.sorokiniana葉枯病抗性的室內(nèi)鑒定條件易于控制、試驗時間短，這為小麥抗黑胚病育種中大量育種后代的抗性鑒定提供了一種快速簡便的鑒定方法。當(dāng)然，以苗期葉枯面積推測黑胚病抗性會存在一定的誤差，10.0%品系推測的抗性結(jié)果與接菌鑒定的抗性結(jié)果不一致，所以該預(yù)測方法僅適用于大量育種材料的初步篩選，且由葉枯面積推測的抗病品系必須再經(jīng)過接菌鑒定確認。另外，小麥對不同致病菌的抗性機制也不一致，如CONNER 等[16]對7 個小麥品種A.alternata與B.sorokiniana黑胚病抗性的接菌鑒定中，同一品種2 種菌引起的黑胚率差異顯著，所有抗病材料對A.alternata的抗性都強于感病對照品種，但僅3 個品種對B.sorokiniana黑胚病抗性強于感病對照。LI等[22]研究結(jié)果也顯示，小麥對不同黑胚病致病菌A.alternata、B.sorokiniana、F.equiseti等的抗性不相關(guān)。所以，其他菌引起的黑胚病發(fā)生率與B.sorokiniana葉枯病病葉面積是否有這種相關(guān)性，有待進一步研究。