宋 雪，劉思佳，何錄文，孟祥才

外源NO對龍膽次生代謝調(diào)控及質(zhì)量形成機制研究

宋 雪，劉思佳，何錄文，孟祥才*

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

探討外源一氧化氮（nitric oxide，NO）對龍膽次生代謝產(chǎn)物環(huán)烯醚萜苷積累及其質(zhì)量形成機制的影響。分別用水及0.02、0.10、0.50、2.00 mmol/L硝普納（sodium nitroprusside，SNP）溶液處理龍膽鮮根，研究活性氧、抗氧化酶活性、次生代謝產(chǎn)物相關(guān)酶活性及次生代謝產(chǎn)物積累之間的關(guān)系。0.50、2.00 mmol/L SNP處理組龍膽超氧陰離子、過氧化氫（H2O2）、NO含量在0～2 d顯著增加，第2天之后逐漸降低。丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，表明SNP可模擬再現(xiàn)生態(tài)脅迫的生理狀態(tài)。SNP處理組超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性在0～6 d均顯著升高，0.50 mmol/L SNP處理組過氧化氫酶（catalase，CAT）和過氧化物酶（peroxidases，POD）活性分別在0～2 d和2～4 d顯著升高。1,3-二磷酸甘油酸（1,3-disphosphoglycerate，1,3-DPG）含量及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）活性在0～4 d顯著增加，其中0.50、2.00 mmol/LSNP處理組效果顯著（＜0.01）。0.50 mmol/L SNP處理組羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR）和1-脫氧--木酮糖醇-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy--xylulose 5-phosphate reductoisomerase，DXR）活性在0～6 d顯著升高，第6天0.50 mmol/L SNP處理組龍膽中龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷和馬錢苷酸含量比第0天分別增加了34.5%、35.3%、1.8%和53.7%。SNP能夠再現(xiàn)龍膽逆境條件下的生理狀態(tài)，促進龍膽中環(huán)烯醚萜類化合物的生物合成，提高龍膽藥材質(zhì)量。

一氧化氮；龍膽；環(huán)烯醚萜苷；抗氧化酶；龍膽苦苷；獐芽菜苦苷；獐芽菜苷；馬錢苷酸

植物在環(huán)境脅迫下可產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），環(huán)境脅迫對植物傷害的本質(zhì)就是ROS[1]。植物對ROS的消除是個負反饋過程，ROS增多會激發(fā)植物自身的免疫系統(tǒng)，即活性氧能夠從細胞的基因表達、酶的合成和活性調(diào)節(jié)及酶促反應(yīng)等不同層次調(diào)控抗氧化酶活性及次生代謝，次生代謝產(chǎn)物多為藥用成分，在生態(tài)脅迫條件下能夠大量合成，因此生態(tài)脅迫可通過活性氧影響藥材質(zhì)量[2-3]。藥材質(zhì)量的形成是通過增加次生代謝形成的，通過人為調(diào)節(jié)植物的次生代謝，從而提高栽培藥材的質(zhì)量是中藥資源學(xué)的重點研究方向[4]。

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽Kitag.、龍膽B(tài)ge.、三花龍膽Pall.或堅龍膽Franch.的干燥根及根莖[5]，其主要藥用成分為環(huán)烯醚萜苷類，如龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷與馬錢苷酸等，這類成分具有較好的保肝、抗炎、解熱、抗病毒等藥理作用，廣泛應(yīng)用于臨床[6]，歷史上龍膽主產(chǎn)區(qū)黑龍江省龍膽開發(fā)盛期1965年產(chǎn)量為514.5 t，由于人口增加及中醫(yī)藥的發(fā)展導(dǎo)致中藥材的需求量不斷增加和野生資源也遭到嚴(yán)重破壞，近年來主產(chǎn)區(qū)野生東北龍膽蘊藏量已不到100 t，野生資源基本停止開發(fā)，目前栽培已成為商品基本來源，質(zhì)量下降，直接影響臨床療效[7-8]，如何提高栽培藥材質(zhì)量是當(dāng)今中藥資源研究領(lǐng)域急需解決的重點和難點問題。一氧化氮（NO）是一種重要的信號分子，可以以濃度相關(guān)的方式與清除ROS酶類共同應(yīng)對抗氧化脅迫，或者直接作為抗氧化劑消除ROS[9]。植物組織具有完整的代謝系統(tǒng)，研究顯示丹參、黃芩等某些藥用成分是在干燥過程中大量合成的[10-11]。本研究團隊對黃芩研究證明對處理鮮根提高次生代謝含量的效果優(yōu)于處理植株[12-14]，這可能是對藥用部位處理可避免光合作用的干擾，ROS也更容易到達藥用部位的緣故。因此本研究采用NO載體硝普納（sodium nitroprusside，SNP）處理龍膽鮮根，以不同濃度的SNP模擬環(huán)境脅迫，使栽培龍膽再現(xiàn)野生條件下的生理狀態(tài)，探究SNP對龍膽主要藥效成分環(huán)烯醚萜苷類的影響。

1 材料

1.1 樣品

樣品采自吉林省蛟河市，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)孟祥才教授鑒定為龍膽科植物龍膽B(tài)unge的根。

1.2 儀器

1200型高效液相色譜儀（安捷倫有限公司）；TGL-16LM型臺式高速冷凍離心機（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；SD40型制冰機（廣州市廣坤電器制造有限公司）；752型紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；DHG-9015A型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；CP225D型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Perkin Elmer公司）。

1.3 試劑

SNP、30%H2O2、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、-甲硫氨酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）、核黃素、氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）、愈創(chuàng)木酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、植物超氧陰離子ELISA試劑盒（批號R30343）均購于上海源葉生物科技有限公司；過氧化氫（H2O2）試劑盒（批號A064-1-1）、NO測定試劑盒（批號A012-1）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）活性測定試劑盒（批號A130-1-1）均購于南京建成生物工程研究所；植物1,3二磷酸甘油酸（1,3-disphosphoglycerate，1,3-DPG）ELISA檢測試劑盒（批號JM-110208P1）、植物羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR）ELISA試劑盒（批號JM-110182P1）、植物1-脫氧--木酮糖醇-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy--xylulose 5-phosphate reductoisomerase，DXR）ELISA檢測試劑盒（批號JM-110212P1）均購于江蘇晶美生物科技有限公司；龍膽苦苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%，批號20201018）、馬錢苷酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%，批號20201115）、獐芽菜苦苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%，批號20210122）、獐芽菜苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%，批號20210120）均購于成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 樣品處理

將龍膽鮮根洗凈，均勻分為5組，各組植株大小和質(zhì)量相近。連續(xù)8 d分別早晚2次噴灑水及0.02、0.10、0.50、2.00 mmol/L SNP溶液至鮮根表面濕潤不滴水，放于室溫環(huán)境中。于第0、2、4、6、8天（即2次取樣時間間隔48 h）按下述方法取樣：（1）每組取適量鮮根組織，來源于4株以上，切成碎塊，精密稱取每份0.30 g共35份，置?80 ℃冰箱供各種酶活性測定；（2）每組取30 g以上樣品，來源于5株以上，于55 ℃下干燥，粉碎過四號篩，用于測定龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷和馬錢苷酸含量。以傳統(tǒng)加工方法（即0 d）作對照，比較處理后各種指標(biāo)的差異。樣品重復(fù)3次。

2.2 植物超氧陰離子、H2O2、NO含量測定

2.2.1 超氧陰離子含量測定方法 取“2.1”項制備的0.30 g的樣品，加入5 mL預(yù)冷的生理鹽水，冰浴研磨，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液4 ℃保存?zhèn)溆谩２捎弥参锍蹶庪x子酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定。用紫外分光光度計在530 nm波長處，1 cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測定吸光度（）。以系列NO2標(biāo)準(zhǔn)含量為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測定管的值進而計算NO2含量。平行測定3次。將所測得數(shù)據(jù)代入公式計算。

超氧負離子含量＝2××VT/(W×VS)

為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的NO2含量，VT為超氧陰離子提取液總體積，W為樣品鮮質(zhì)量，VS為測定時加入提取液體積

2.2.2 H2O2含量測定方法 取“2.1”項制備的0.30 g每份的樣品，按照質(zhì)量?體積＝1∶9加入9倍預(yù)冷的緩沖液（pH 7.8），冰浴研磨，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液4 ℃保存?zhèn)溆谩２捎眠^氧化氫測試盒測定的方法，將上清液加反應(yīng)試劑混勻，于405 nm處測定值，雙蒸水調(diào)零。平行實驗3次。將測得數(shù)據(jù)代入公式計算。

H2O2含量＝(測定－空白)/(標(biāo)準(zhǔn)－空白)×標(biāo)準(zhǔn)/pr

標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，pr組織勻漿蛋白濃度

2.2.3 NO含量測定方法 取“2.1”項制備的0.30 g每份的樣品，放入冰浴的研缽中，加入預(yù)冷的緩沖溶液（PBS）研磨成勻漿，定容至5 mL，4 ℃ 10 000 r/min離心20 min，取上清液4 ℃保存?zhèn)溆茫艘杭礊榇置柑崛∫?。采用NO測定試劑盒，把酶液與反應(yīng)試劑混勻，于波長550 nm測定值，雙蒸水調(diào)零，平行實驗3次。將測定值代入公式計算。

NO含量＝(測定－空白)/(標(biāo)準(zhǔn)－空白)×標(biāo)準(zhǔn)/pr

標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，pr為組織勻漿蛋白濃度

2.3 抗氧化酶活性測定

采用參考文獻方法[15]測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性、過氧化物酶（peroxidases，POD）活性。

2.4 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定

采用硫代巴比妥酸-分光光度法測定MDA含量[15]。

2.5 初生代謝途徑關(guān)鍵酶活性測定

2.5.1 1,3-DPG含量測定方法 取“2.1”項制備的0.30 g每份的樣品，放入冰浴的研缽中，加入預(yù)冷的PBS（pH 7.8）研磨成勻漿，定容至5 mL，4 ℃ 10 000 r/min離心20 min，取上清液4 ℃保存?zhèn)溆?，用于測定1,3-DPG的含量。采用植物1,3-DPG ELISA檢測試劑盒進行測定，嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進行溫育操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔值。

2.5.2 PEPC活性測定方法 取“2.1”項制備的0.30 g每份的樣品，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量預(yù)冷的提取液研磨成勻漿，定容于10 mL，4 ℃ 10 000 r/min離心20 min，取上清液4 ℃保存?zhèn)溆?。采用植物PEPC ELISA檢測試劑盒，上清液與試劑按順序加入1 mL比色皿中，立即混勻，蒸餾水調(diào)零，加樣本的同時開始計時，記錄在340 nm波長下的初始吸光度（1）值和5 min后的吸光度（2）值，按公式計算PEPC活性。

PEPC＝1624×(1－2)/樣品鮮質(zhì)量

2.6 次生代謝途徑關(guān)鍵酶活性測定

2.6.1 HMGR活性測定 取“2.1”項制備的0.30 g每份的樣品，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量預(yù)冷的PBS（pH 7.8），研磨成勻漿，定容于5 mL，10 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液4 ℃保存?zhèn)溆谩２捎弥参锝?jīng)HMGR試劑盒，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定值。

2.6.2 DXR活性測定 取“2.1”項制備的0.30 g每份的樣品，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量預(yù)冷的PBS（pH 7.8），研磨成勻漿，定容于5 mL，10 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液4 ℃保存?zhèn)溆谩２捎弥参顳XR試劑盒，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定值。

2.7 活性成分含量測定

2.7.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、馬錢苷酸各適量，用甲醇溶液制成質(zhì)量濃度分別為2.799 2、1.009 2、0.103 5、1.017 6 mg/mL的混合對照品溶液。

2.7.2 供試品溶液的制備 精密稱取1.00 g龍膽藥材粉末，置于50 mL的錐形瓶中，加入甲醇溶液30 mL，搖勻，超聲提取60 min，放冷后稱定質(zhì)量，用甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.7.3 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為35 ℃；流動相為甲醇（A）-0.3%磷酸水溶液（B），洗脫梯度：0～15 min，20%～30% A；15～25 min，30%～37% A；25～30 min，37%～20% A；30～50 min，20% A；體積流量1 mL/min；檢測波長為240 nm，進樣量10 μL。

2.7.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取“2.7.1”項下對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 mL，分別用甲醇溶液定容至1 mL，制成系列質(zhì)量濃度龍膽苦苷對照品溶液，依法進樣測定龍膽苦苷的峰面積。取“2.7.1”項下對照品溶液0.1、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，分別用甲醇溶液定容至5 mL，制成系列質(zhì)量濃度獐牙菜苦苷、馬錢苷酸對照品溶液，依法進樣測定獐牙菜苦苷、馬錢苷酸的峰面積。取“2.7.1”項下對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別用甲醇溶液定容至1 mL，制成系列質(zhì)量濃度獐牙菜苷對照品溶液，依法進樣測定獐牙菜苷的峰面積。分別以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）進行回歸，得成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)（2）和線性范圍，見表1。

表1 龍膽中4種成分的線性關(guān)系

Table 1 Linear relationship of four components in G. scabra

成分回歸方程R2線性范圍/(mg·mL-1) 龍膽苦苷Y＝10 393 X＋282.220.999 80.279 9～2.799 2 獐牙菜苦苷Y＝16 174 X－145.990.999 90.020 2～0.302 8 獐牙菜苷Y＝15 076 X－8.683 80.999 90.005 2～0.051 8 馬錢苷酸Y＝11 807 X－65.6560.999 90.020 4～0.305 3

2.7.5 精密度試驗 取同一供試品（0.50 mmol/LSNP處理后第4天樣品），按“2.7.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.7.3”項下方法連續(xù)測定6次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d進樣分析，計算日間精密度。龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、馬錢苷酸的日內(nèi)和日間精密度的RSD分別為0.57%、0.88%，0.71%、1.08%，0.46%、0.98%，0.92%、0.82%，表明儀器精密度良好。

2.7.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品（0.50 mmol/LSNP處理后第4天樣品），按“2.7.2”項下方法制備供試品溶液，于制備后0、4、8、16、24 h按“2.7.3”項下色譜條件進樣分析，得到龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、馬錢苷酸峰面積的RSD值分別為0.77%、0.42%、1.10%、0.40%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.7 重復(fù)性試驗 取同一供試品（0.10 mmol/LSNP處理后第2天樣品），按“2.7.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.7.3”項下色譜條件進樣分析，得到龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、馬錢苷酸質(zhì)量濃度的RSD值分別為1.21%、1.23%、1.42%、1.12%，表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.7.8 加樣回收率試驗 取已測定的龍膽粉末（0.1mmol/L SNP處理后第4天樣品）0.10 g，共6份，精密稱定，分別加入適量質(zhì)量濃度的對照品，按“2.7.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.7.3”項下色譜條件進樣分析，計算加樣回收率得龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、馬錢苷酸加樣回收率分別為99.01 %、98.91%、98.98%、98.45%，RSD分別為1.11 %、1.05%、1.56%、1.44%。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度SNP溶液對超氧陰離子、H2O2、NO含量的影響

SNP處理組超氧陰離子含量呈先升高后降低的趨勢，而水組變化趨勢不明顯（圖1-A）。0.50 mmol/L SNP處理組在第2天超氧陰離子含量最高，相比第0天增加了29.0%，極顯著高于水組（＜0.01）。0.5、2.0 mmol/L SNP處理組H2O2含量呈先升高后降低再恢復(fù)到初始水平，而水組和低濃度組（0.02、0.10 mmol/L）H2O2含量變化趨勢不明顯（圖1-B）。0.50 mmol/L SNP處理組第2天時H2O2含量達到最高，比第0天增加了58.3%，極顯著高于水組（＜0.01）；在第6天呈降低的趨勢，比第0天增加18.4%。0.10、0.50、2.0 mmol/L SNP處理組NO含量呈先升高后降低的趨勢，而水組和0.02 mmol/L SNP處理組無明顯變化趨勢（圖1-C）。0.50 mmol/L SNP處理組在第2天NO含量達到最高值，比對照組增加了364.3%，并且極顯著高于水組（＜0.01）；在第6天比對照組增加了26.3%。研究結(jié)果表明，龍膽鮮根在0.5 mmol/L外源NO施加下ROS顯著且快速響應(yīng)。

第0天比較：*P＜0.01，**P＜0.05；與水組比較：#P＜0.01，##P＜0.05，下圖同

3.2 不同濃度SNP溶液對MDA含量的影響

0.10、0.50、2.00 mmol/L SNP處理組MDA含量呈先上升后下降再上升的趨勢，0.02 mmol/L SNP處理組MDA含量呈先上升后下降的趨勢，水組MDA含量呈緩慢增長趨勢（圖2）。0.50 mmol/L SNP處理組在第2天MDA含量最高，比第0天增加了98.4%，在第6天比第0天增加了57.6%，并且都極顯著高于水組（＜0.01）。研究結(jié)果表明，龍膽鮮根在0.50 mmol/L外源NO施加下對MDA含量有顯著影響。

圖2 不同濃度SNP溶液對MDA含量的影響()

3.3 不同濃度SNP溶液對SOD、CAT和POD活性的影響

SNP處理組SOD活性呈先升高后降低的趨勢，SNP處理組比水組變化趨勢明顯（圖3-A）。0.10、0.50 mmol/L SNP處理組在第6天SOD活性達到最高，分別比第0天增加了284.8%和235.5%，并且都極顯著高于水組（＜0.01）。0.10、0.50、2.00 mmol/L SNP處理組CAT活性在第2天達到峰值，水組和0.02 mmol/L SNP處理組CAT活性無明顯變化（圖3-B）。0.50 mmol/L SNP處理組在第2天時CAT活性最高，比第0天增加了66.0%，并且極顯著高于水組（＜0.01）。水組、0.50、2.00 mmol/L SNP處理組POD活性呈先降低后升高再降低最后基本恢復(fù)到初始水平的趨勢，低濃度組（0.02、0.10 mmol/L）POD活性無明顯變化（圖3-C）。0.50 mmol/L SNP處理組在第4天時POD活性達到最高，較第0天升高了72.9%，并且極顯著高于水組（＜0.01）；在第6天活性最低，比第0天降低了29.1%。研究結(jié)果表明，龍膽鮮根在0.50 mmol/L外源NO施加下SOD、CAT和POD顯著且快速響應(yīng)。

3.4 不同濃度SNP溶液對1,3-DPG含量及PEPC活性的影響

SNP處理組1,3-DPG含量總體呈先上升后下降的趨勢，SNP處理組比水組變化趨勢明顯（圖4-A）。0.50、2.00 mmol/L SNP處理組在第4天活性達到最高，較第0天分別提高了176.1%、214.1%，第6天分別較第0天提高了136.9%和187.0%，都極顯著高于水組（＜0.01）。SNP處理組PEPC活性總體呈先上升后下降的趨勢，SNP處理組比水組變化趨勢明顯（圖4-B）。0.50 mmol/L SNP處理組在第4天和第6天PEPC活性達到最高，較第0天提高了104.3%和90.7%，并且極顯著高于水組（＜0.01）。研究結(jié)果表明，龍膽鮮根在0.50 mmol/L外源NO施加下對1,3-DPG含量及PEPC活性有顯著影響。

3.5 不同濃度SNP溶液對HMGR、DXR活性的影響

SNP處理組HMGR活性呈先上升后下降的趨勢，水組變化趨勢不明顯（圖5-A）。0.50 mmol/L SNP處理組在第2天HMGR活性達到最高，比第0天提高了680.0%，第6天比第0天增加了205.0%，并且都極顯著高于水組（＜0.01）。SNP處理組DXR活性呈先升高后降低的趨勢，水組DXR活性變化趨勢不明顯（圖5-B）。0.50 mmol/L SNP處理組在第2天DXR活性達到最高，比第0天提高了94.5%，第6天比第0天增加了62.5%，都極顯著高于水組（＜0.01）。研究結(jié)果表明，龍膽鮮根在0.50 mmol/L外源NO施加下對HMGR、DXR活性有顯著影響。

圖3 不同濃度SNP溶液對SOD (A)、CAT (B)、POD (C) 活性的影響()

圖4 不同濃度SNP溶液對1,3-DPG含量(A) 及PEPC活性(B) 的影響()

3.6 不同濃度SNP溶液對環(huán)烯醚萜苷含量的影響

SNP處理組龍膽苦苷與獐芽菜苦苷含量變化趨勢基本相同，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，水組變化趨勢不明顯（圖6-A、B）。0.50 mmol/LSNP處理組在第6天龍膽苦苷與獐芽菜苦苷含量最高，分別比第0天增加了34.5%和35.3%，并且極顯著高于水組（＜0.01）。低濃度組（0.02、0.10 mmol/L）在第2天含量達到最高，但不如在第6天0.50 mmol/L SNP處理組含量升高顯著。SNP處理組獐芽菜苷含量先升高后降低的趨勢（圖6-C）。0.50 mmol/L SNP處理組在第6天獐芽菜苷含量比第0天增加了1.8%。0.50 mmol/L SNP處理組馬錢苷酸含量呈先降低后升高再降低的趨勢，其它處理組馬錢苷酸含量呈現(xiàn)降低的趨勢（圖6-D）。0.50 mmol/L SNP處理組在第6天馬錢苷酸含量最高，比第0天增加了53.7%，并且極顯著高于水組（＜0.01）。研究結(jié)果表明，龍膽鮮根在0.50 mmol/L外源NO施加下主要藥用成分環(huán)烯醚萜苷有顯著影響，在第6天含量達到最高值，龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷和馬錢苷酸含量分別較第0天提高了34.5%、35.3%、1.8%和53.7%。

圖5 不同濃度SNP溶液對HMGR (A)、DXR (B) 活性的影響()

圖6 不同濃度SNP溶液對龍膽中龍膽苦苷(A)、獐牙菜苦苷(B)、獐牙菜苷(C)、馬錢苷酸(D) 含量的影響()

4 討論

生態(tài)脅迫對植物傷害的生物學(xué)本質(zhì)是ROS。在植物受到環(huán)境脅迫時，會導(dǎo)致體內(nèi)ROS含量升高，超氧負離子是最先產(chǎn)生的ROS，而且很強的毒害作用[16]。H2O2雖然具有較低的破壞作用，但如果不及時消除，它也會通過芬頓反應(yīng)（Fenton）轉(zhuǎn)化為性質(zhì)活潑、破壞力極強的·OH。ROS可使抗氧化酶的活性升高或者次生代謝產(chǎn)物含量升高，或者二者均升高，來減少過量ROS積累對生物體的毒害作用，保證活性氧水平的相對穩(wěn)定[4,14]。

4.1 外源NO對NO、超氧陰離子、H2O2含量的影響

NO是一種重要的信號分子，ROS可以介導(dǎo)NO生成，NO也可以通過調(diào)節(jié)ROS代謝，促進ROS生成[17]。本實驗中超氧負離子、H2O2含量在前2天顯著增加，說明在SNP的作用下，導(dǎo)致ROS在前2天顯著增加，但在第2天后含量降低，其原因可能是由于植物代謝系統(tǒng)發(fā)生改變，加強了對過量ROS的消除[18]。在SNP作用下MDA含量總體呈上升的趨勢，但在第2～6天有下降的趨勢（圖2），與ROS含量變化結(jié)果相一致。MDA的含量常被用來表征植物遭受逆境脅迫的危害程度[19]，ROS的累積導(dǎo)致膜脂過氧化形成MDA。SNP可增加ROS和MDA含量，表明外源NO再現(xiàn)逆境下的生理狀態(tài)。

NO在較高濃度條件下對細胞具有毒害作用，而在較低濃度條件下具有細胞保護和刺激作用[20-21]，而NO對ROS的調(diào)節(jié)作用是通過抗氧化系統(tǒng)的蛋白質(zhì)巰基亞硝基化[22-23]，因此NO對ROS的調(diào)節(jié)作用是通過酶來完成的，在較高濃度條件下，NO也會破壞酶，這可能是2.00 mmol/L組ROS含量較低的原因。而0.02 mmol/L和0.10 mmol/L組具有明顯的劑量依賴關(guān)系，表明該劑量的NO尚未完全啟動相關(guān)酶。0.50 mmol/L組表現(xiàn)較好的效果。

4.2 外源NO對抗氧化酶活性的影響

當(dāng)植物遭受逆境脅迫時，其體內(nèi)ROS會過量積累，導(dǎo)致發(fā)生氧化性脅迫，抗氧化酶系統(tǒng)是對抗這種脅迫的主要途徑之一[24]?？寡趸赣蠸OD、POD、CAT、APX、DHAR、GR等[25]，其中SOD、CAT、SOD是其中最主要的酶。本實驗中超氧負離子、H2O2含量在前2天顯著增加，抗氧化酶系統(tǒng)也做出反應(yīng)，各抗氧化酶活性顯著增強。SOD是抵御ROS的第一道防線，能催化活性較高的超氧負離子生成活性很低的H2O2[26]，SOD活性在第0～6天0.50 mmol/LSNP處理組顯著增加，加強了對超氧負離子的消除，使超氧負離子含量在第2～6天呈顯著下降。CAT和POD是植物消除H2O2的2種主要酶類，它們分別在第0～2天、第2～4天0.50 mmol/L SNP處理組活性顯著升高，降低了H2O2含量。NO可通過直接與超氧負離子作用生成對植物毒害小的ONOO-，還可以與SOD、CAT、POD等抗氧化酶類中血紅素鐵結(jié)合來調(diào)節(jié)它們的活性，以此來調(diào)節(jié)超氧負離子和H2O2的含量[17]。以上說明外源NO可以顯著提高抗氧化酶活性，增強活性氧清除能力，使ROS水平處于動態(tài)平衡狀態(tài)，導(dǎo)致在第2天后含量降低（圖1）。較高濃度的NO也會破壞抗氧化酶，2.00 mmol/L組抗氧化酶活性并未達到最高水平，0.02 mmol/L和0.10 mmol/L SNP組劑量較低，SOD、CAT、POD等相關(guān)酶的活性也較低。

4.3 外源NO對1,3-DPG含量及PEPC活性的影響

本實驗中1,3DPG含量和PEPC活性升高。1,3-二磷酸甘油酸是葡萄糖糖酵解的的產(chǎn)物，說明在SNP作用下可加快葡萄糖分解速度，為后續(xù)的次生代謝途徑提供能量和物質(zhì)。

在非光合組織中，PEPC的主要作用是三羧酸循環(huán)中補充中間體，同時也是初生代謝與次生代謝的分支點，PEPC活性升高說明SNP調(diào)節(jié)了植物代謝途徑，為次生代謝產(chǎn)物生物合成提供更多原料[27]，能夠增強植物的次生代謝。有研究表明，低濃度NO提高PEPC酶活性及基因表達，可以使PEPC活性呈先增加后降低的趨勢[28-29]。在不同濃度處理中，0.50 mmol/L組PEPC活性較高，可使更多的物質(zhì)合成次生代謝產(chǎn)物。

4.4 外源NO對次生代謝產(chǎn)物環(huán)烯醚萜苷含量的影響

龍膽的主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類成分，苷類成分可以保護細胞減少ROS的傷害[30]。苷具有雙親性，既含有親水性的頭部（糖類成分），又含有疏水性的尾部（萜類成分）。苷類成分的生物學(xué)效應(yīng)主要是被動保護生物大分子或細胞器。通過膜技術(shù)與原子力顯微鏡研究證實植物的萜類物質(zhì)能夠容易整合到磷脂雙分子層中[31]，調(diào)節(jié)維持細胞膜的流動性和整體性[32]。甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）和2-甲基-赤蘚醇-4-磷酸（2-methyl erythritol 4- phosphate，MEP）2條途徑是合成萜烯類化合物的主要途徑，HMGR和DXR分別是2個途徑的關(guān)鍵限速酶，直接調(diào)控萜烯類化合物的生物合成[33]。有研究表明，波葉金桂在干旱脅迫下HMGR、DXR活性表現(xiàn)出先上升后下降[34]，本實驗中HMGR和DXR活性趨勢也同樣表現(xiàn)出先上升后下降（圖5），在0.50 mmol/L SNP處理組第2天活性最高，在第2～6天都高于第0天，說明外源NO可以顯著提高次生代謝酶活性，能夠促進萜烯類化合物合成，從而抵御脅迫。HMGR是萜類合成的最主要酶，不同濃度NO對幾種萜類成分的調(diào)控效果與HMGR活性呈明顯的正相關(guān)，其中0.50 mmol/L SNP處理組效果最佳。在0.50 mmol/L SNP處理組中，龍膽苦苷、獐芽菜苦苷和馬錢苷酸含量在第6天都顯著高于第0天（圖6），含量分別提高了34.5%、35.3%和53.7%，提高幅度之大鮮有報道。獐芽菜苷在第4天含量最高，第6天與第0天無顯著差異，可能有2方面原因：一方面是因為獐芽菜苷含量較低，受環(huán)境影響較大，含量有微小的變化可能就有明顯的變化趨勢；另一方面因為萜類合成途徑中最先產(chǎn)生的是獐牙菜苷，經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)，最后脫羥基形成龍膽苦苷[35]，作為中間產(chǎn)物含量較低。

ROS能夠增強植物的次生代謝從而改變藥材的質(zhì)量。龍膽藥材為正常采收期，采收后處理8 d，雖然存在呼吸作用會消耗一定量的營養(yǎng)物質(zhì)，但最總體產(chǎn)量不會產(chǎn)生較大影響，而逆境條件下對產(chǎn)量影響更大。通過不同濃度SNP對龍膽鮮根的處理，0.50 mmol/L SNP處理組能夠顯著增加超氧負離子、H2O2、NO和MDA的含量，再現(xiàn)植物逆境條件下的生理狀態(tài)，提高了抗氧化酶活性，同時也增加了初生代謝和次生代謝過程中關(guān)鍵酶活性和關(guān)鍵物質(zhì)的含量。0.50 mmol/L SNP處理組在第6天使龍膽藥材中有效成分龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷和馬錢苷酸4種萜類化合物含量分別增加34.5%、35.3%、1.8%和53.7%，藥材的質(zhì)量得到顯著提升。通過人為調(diào)控ROS再現(xiàn)龍膽逆境條件下的生理狀態(tài)，方法簡單易行，勞動力成本很低，還可顯著提高龍膽藥材質(zhì)量，可為優(yōu)質(zhì)藥材生產(chǎn)提供新的途徑。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Regulation of exogenous NO on secondary metabolism ofand its quality formation mechanism

SONG Xue, LIU Si-jia, HE Lu-wen, MENG Xiang-cai

Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

To explore the effect of exogenous nitric oxide (NO) on the accumulation of iridoid glycosides, a secondary metabolite of Longdan (), and its quality formation mechanism.The fresh roots ofwere treated with water, 0.02, 0.10, 0.50 and 2.00 mmol/L nipponate solution (SNP), respectively, the relationships between the activities of reactive oxygen species, antioxidant enzymes, enzyme activities related to secondary metabolites and the accumulation of secondary metabolites were investigated.The contents of superoxide anion, hydrogen peroxide (H2O2) and NO intreated with 0.50 and 2.00 mmol/L SNP increased significantly from 0—2 d , then decreased gradually. Malondialdehyde (MDA) contents were increased first and then decreased, indicating that SNP can simulate and reproduce the physiological state under ecological stress. The activity of superoxide dismutase (SOD) in SNP treatment group increased significantly from 0 to 6 d, the catalase (CAT) and peroxidase (POD) activities in 0.50 mmol/L SNP treatment group were increased significantly at 0—2 d and 2—4 d, respectively. The contents of 1,3-diphosphoglyceride (1,3-DPG) and the activities of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) were increased significantly at 0—4 dthe effects of 0.50 and 2.00 mmol/L SNP treatment groups were the most significantand (< 0.01). The activities of hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (HMGR) and 1-deoxy--xyketol-5-phosphate reductisomerase (DXR) in the 0.50 mmol/LSNP treatment group were significantly increased from 0—6 d, with this, the contents of gentiopicroside, swertiamarin, sweroside and loganic acid, the main active ingredients in, were increased by 34.5%, 35.4%, 1.8% and 53.7% respectively compared with those on the 0 day.SNP can rebuilt physiological status ofunder ecological stress, promote the biosynthesis of iridoid compounds, and improve the herbal medicine quality.

NO;Bge.; iridoid glycoside; antioxidant enzymes; gentiopicroside; swertiamarin; sweroside; loganic acid

R286

A

0253 - 2670(2023)17 - 5716 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.024

2023-02-02

2020年國際自然科學(xué)基金區(qū)域聯(lián)合項目（U20A2040）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?；鹈嫔享椖浚?019MS27）

宋 雪，在讀研究生，研究方向為生物技術(shù)與生藥資源開發(fā)。E-mail: Songxue1724@163.com

孟祥才，教授，研究方向為藥用植物生物學(xué)、栽培及質(zhì)量評價。E-mail: Mengxiangcai000@163.com

[責(zé)任編輯 時圣明]