陳一笑，王威宇，馮建有，秦雪梅，高曉霞*

? 藥理與臨床 ?

基于分子生物學(xué)及代謝組學(xué)的柴胡注射液抗肝癌作用機(jī)制研究

陳一笑1, 2, 3，王威宇1, 2, 3，馮建有1, 2, 3，秦雪梅1, 2, 3，高曉霞1, 2, 3*

1. 山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006 2. 山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006 3. 地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006

探究柴胡注射液抑制肝癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用與機(jī)制。體外培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞與人正常肝細(xì)胞（LO-2），給予不同質(zhì)量濃度的柴胡注射液干預(yù)，MTT法與劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖和遷移；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡；采用qRT-PCR及Western blotting技術(shù)檢測(cè)與周期阻滯、凋亡及遷移相關(guān)的基因與蛋白表達(dá)；代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)柴胡注射液干預(yù)前后肝癌細(xì)胞內(nèi)源性差異物的變化，采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析柴胡注射液調(diào)節(jié)的代謝通路。柴胡注射液（100～450 mg/mL）顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖（＜0.01、0.001），使細(xì)胞阻滯于S期與G2期（＜0.05），促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡（＜0.001），抑制肝癌細(xì)胞遷移（＜0.05、0.001），表明柴胡注射液具有顯著的抗肝癌作用。柴胡注射液顯著降低肝癌細(xì)胞中神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白2（neuronal pas domain protein 2，）、細(xì)胞分裂周期蛋白25A（cell division cycle 25A，）、周期蛋白依賴激酶2（cyclin-dependent kinase 2，）、細(xì)胞周期蛋白A（）、、、mRNA表達(dá)（＜0.01、0.001），下調(diào)NPAS2、CDC25A、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表達(dá)（＜0.001），上調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細(xì)胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）蛋白表達(dá)（＜0.01、0.001）。代謝組學(xué)結(jié)果顯示，柴胡注射液干預(yù)核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝途徑、糖酵解途徑、氨基酸代謝途徑、脂肪酸代謝途徑等。柴胡注射液對(duì)SMMC-7721細(xì)胞有阻滯及促凋亡的作用，其可能的機(jī)制為下調(diào)NPAS2-CDC25A使細(xì)胞阻滯于S期，下調(diào)CDC25B、CDK1、cyclin B1使細(xì)胞處于G2期阻滯，下調(diào)MMP-9/TIMP-1值抑制肝癌細(xì)胞遷移，調(diào)節(jié)核苷酸、脂質(zhì)與氨基酸代謝等通路，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

柴胡注射液；肝癌；凋亡；細(xì)胞周期；遷移；代謝組學(xué)

肝癌為臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有前期不易診斷、晚期致死率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅到患者的生命。由于肝腫瘤解剖部位特殊，因此外科通常以介入和手術(shù)治療為主，中西醫(yī)結(jié)合治療也是其重要的治療手段之一。柴胡是傘形科植物柴胡DC.或狹葉柴胡Willd.的干燥根，具有疏散退熱、疏肝解郁的功效[1]。柴胡對(duì)于肝臟性疾病，如肝纖維化、肝癌等療效顯著，臨床上將柴胡疏肝化瘀方與侖伐替尼聯(lián)合治療原發(fā)性肝癌取得較佳的治療效果[2]。研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬及線粒體功能，促進(jìn)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（organic aniontransporting polypeptide 1B1，Oatp1b1）表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而對(duì)阿霉素治療小鼠肝癌具有靶向?qū)б饔肹3]。柴胡注射液是柴胡經(jīng)水蒸氣蒸餾制成的滅菌水溶液[4]；臨床上將肝動(dòng)脈化療栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）與柴胡注射液配合治療肝癌取得較好的療效[5-7]；相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)也表明柴胡注射液具有體外抑制肝癌增殖的活性[8-9]。柴胡復(fù)方和柴胡制劑都表現(xiàn)出抑制肝癌增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的效果，然而柴胡注射液的抗肝癌作用機(jī)制并未有明確的研究。

腫瘤是一種與節(jié)律相關(guān)的疾病，在許多腫瘤研究中均有報(bào)道[10-12]。神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白2（neuronal pas domain protein 2，NPAS2）是產(chǎn)生和維持周期節(jié)律的重要調(diào)控因子，惡性腫瘤的發(fā)生與其異常表達(dá)有關(guān)[13]。NPAS2作為晝夜節(jié)律生物系統(tǒng)中的重要核心組件，可以調(diào)控多種與周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的增殖[14]。隨著癌癥惡性增殖機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（cyclin dependent kinase，CDKs）與細(xì)胞周期蛋白（cyclins）組成的蛋白復(fù)合物（CDKs-cyclins）在調(diào)控癌癥細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮著重大作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)cyclin E調(diào)控細(xì)胞G1/S期進(jìn)程，進(jìn)入S期后略微下降[16]。

代謝組學(xué)是借助色譜、質(zhì)譜及液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)對(duì)生物體內(nèi)的代謝物進(jìn)行定量分析，進(jìn)而解釋復(fù)雜性病理或生理變化的方法[17]。由于肝癌的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的代謝狀態(tài)密切相關(guān)，因此檢測(cè)差異代謝物的變化可以更好把握肝癌的發(fā)展階段和惡化狀態(tài)，這有利于臨床早期肝癌的診斷。本研究以人肝癌SMMC-7721細(xì)胞及人正常肝細(xì)胞（LO-2）為對(duì)象，采用分子生物學(xué)與代謝組學(xué)的方法，來(lái)探討柴胡注射液的抗肝癌作用與機(jī)制，從而在分子層面及代謝方面對(duì)柴胡注射液的抗肝癌機(jī)制有更深入的認(rèn)識(shí)，為臨床肝癌治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

SMMC-7721細(xì)胞和LO-2細(xì)胞均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

柴胡注射液（1 g/mL，批號(hào)Z20073102）購(gòu)自輔仁藥業(yè)；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)E709FA0003）購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；0.25%胰酶（批號(hào)13F09A67）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清（批號(hào)20170621）購(gòu)自天杭生物科技股份有限公司；MTT、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；分析級(jí)石油醚、醋酸乙酯購(gòu)自北京化工試劑；5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）購(gòu)自北京北大藥業(yè)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)PAB180007）購(gòu)自Bioswamp公司；SYBR Green PCR試劑盒（批號(hào)KM4101）購(gòu)自Kapa Biosystem公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)639505）購(gòu)自日本Takara公司；NPAS2抗體（批號(hào)H00004862-D01）、細(xì)胞分裂周期蛋白25A（cell division cycle 25A，CDC25A）抗體（批號(hào)PAB0425）購(gòu)自Abnova公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗體（批號(hào)HPA001238）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）抗體批號(hào)orb1248799）、細(xì)胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）抗體（批號(hào)orb804756）購(gòu)自Biorbyt公司、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)AB112）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)AG1208）購(gòu)自Beyotime公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號(hào)ab49822）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（貨號(hào)20536-1-AP）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；抗體β-actin（貨號(hào)20536-1-AP）；無(wú)水乙醇（批號(hào)10009218）、氯仿（批號(hào)10006818）、異丙醇（批號(hào)80109218）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)有限公司；乙腈、甲酸（質(zhì)譜級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

Infinite M200 Pro型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；Neofuge 1600R/1600型低溫離心機(jī)（力康集團(tuán)）；D180型細(xì)胞培養(yǎng)箱（瑞沃德生命科技有限公司）；NovoCyte型流式細(xì)胞分析儀（ACEA公司）；EPS300r型電泳儀、5200型化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）；Q Exactive UPLC-MS型超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SMMC-7721和LO-2細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2 MTT法檢測(cè)SMMC-7721和LO-2細(xì)胞增殖

SMMC-7721和LO-2細(xì)胞分別以1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，100 μL/孔，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁后，設(shè)置對(duì)照組、5-FU（25 μg/mL）組和柴胡注射液（以生藥量計(jì)50、100、200、250、350、450 mg/mL）組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組加入相應(yīng)藥物，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含10% MTT的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后棄上清液，加入100 μL DMSO，振蕩搖勻，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定吸光度（）值。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞周期及凋亡

SMMC-7721細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于6孔板中，設(shè)置對(duì)照組和柴胡注射液（200、250、350 mg/mL）組，檢測(cè)細(xì)胞周期；設(shè)置對(duì)照組和柴胡注射液（200 mg/mL）組，檢測(cè)細(xì)胞凋亡。對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組加入相應(yīng)藥物，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，按照文獻(xiàn)方法處理[18-19]，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡。

2.4 MTT法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞遷移

SMMC-7721細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，于孔中央用200 μL槍頭垂直“一”字劃痕，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌以清除細(xì)胞碎片。設(shè)置對(duì)照組和柴胡注射液（200 mg/mL）組，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，給藥組加入藥物，分別于0、12、24、36 h觀察劃痕傷口愈合情況并拍照，用Photoshop CS4軟件“多邊形套索工具”計(jì)算劃痕面積。

2.5 qRT-PCR檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞NPAS2、CDC25A、CDC25B、CDK1、CDK2、cyclin A和cyclin B1 mRNA表達(dá)

SMMC-7721細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于6孔板中，設(shè)置對(duì)照組和柴胡注射液（250 mg/mL）組，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，給藥組加入藥物，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見(jiàn)表1。

2.6 Western blotting檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞Bax、Bcl-2、Cyt-C、Caspase-3、NPAS2、CDC25A、MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)

SMMC-7721細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于6孔板中，設(shè)置對(duì)照組和柴胡注射液（250 mg/mL）組，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，給藥組加入藥物，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4 ℃充分裂解細(xì)胞，95 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清。BCA法進(jìn)行蛋白定量，蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入一抗（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗室溫孵育1 h，用ECL顯影，掃描條帶。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列(5’-3’)擴(kuò)增片段/bp NPAS2F: GCACTAAAGGACAAGGG93 R: TGGCGAATGACTGGTAT CDC25AF: CCTTGACAACCGATGC202 R: CAGGGATAAAGACTGATGAA CDC25BF: ACAGCGAAACCCCAAAGA243 R: TGATGGCAAACTGCTCGT CDK1F: GGAACTTCGTCATCCAAATA129 R: TACTGACCAGGAGGGATAGA CDK2F: GAAACAAGTTGACGGGAGA171 R: TGATGAGGGGAAGAGGAA cyclin AF: TGGAGTTGTGCTGGCTAC216 R: TCAGGGAGTGCTTTCTTT cyclin B1F: GCACTTTCCTCCTTCTCA100 R: CGATGTGGCATACTTGTT GAPDHF: CCACTCCTCCACCTTTG106 R: CACCACCCTGTTGCTGT

2.7 代謝組學(xué)研究

2.7.1 分組及給藥處理 取8 mL SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)液置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入8 mL柴胡注射液（250 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以不加入藥物的SMMC-7721細(xì)胞作為模型組，不加入藥物的LO-2細(xì)胞作為正常組，每組平行6個(gè)樣本。刮取細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS離心清洗2遍，超聲破碎細(xì)胞[20]，乙腈沉淀蛋白，低溫13 000 r/min離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移到干凈EP管，于真空冷凍離心干燥機(jī)干燥。以200 μL初始流動(dòng)相（0.1%甲酸水溶液-乙腈＝9∶1）復(fù)溶，低溫13 000 r/min離心15 min，上清液進(jìn)UPLC-MS分析。另各取上述LO-2組、SMMC-7721組、柴胡注射液組細(xì)胞樣本液20 μL混合，作為質(zhì)控樣本。

2.7.2 液相條件 Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～4 min，2% B；4～5 min，2%～3% B；5～8 min，3%～15% B；8～13 min，15%～35% B；13～17 min，35%～55% B；17～23 min，55%～70% B；23～26 min，70%～80% B；26～28 min，80%～85% B；28～36 min，85%～95% B；36～38 min，95% B；38～40 min，95%～2% B；40～41 min，2% B。體積流量0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫40 ℃。

2.7.3 質(zhì)譜條件 采用ESI離子化方式，噴霧電壓正極3.5 kV，負(fù)極?2.5 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；加熱器溫度300 ℃；鞘氣體積流量35 arb；輔助氣體積流量10 arb；掃描模式為Full Scan/dd-MS2，采集范圍/100～1500，正負(fù)離子切換采集模式。分辨率采用MS Full Scan 35 000 FWHM，MS/MS 17 500 FWHM，碰撞能量為12.5、25、37.5 eV[21]。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 柴胡注射液對(duì)SMMC-7721和LO-2細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，柴胡注射液質(zhì)量濃度為100～450 mg/mL時(shí)，顯著抑制SMMC-7721和LO-2細(xì)胞存活率（＜0.01、0.001），呈劑量相關(guān)性，且對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用較強(qiáng)。柴胡注射液質(zhì)量濃度為250 mg/mL時(shí)達(dá)到半數(shù)抑制率（49.54%），因此選擇250 mg/mL進(jìn)行后續(xù)研究。

3.2 柴胡注射液對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期和凋亡的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，柴胡注射液（200、250、350 mg/mL）組G1期細(xì)胞比例顯著減少（＜0.05、0.01），柴胡注射液（200、350 mg/mL）組S期細(xì)胞比例顯著升高（＜0.05），柴胡注射液（250、350 mg/mL）組G2期細(xì)胞比例顯著升高（＜0.05），表明柴胡注射液阻滯肝癌細(xì)胞于S期和G2期。如圖3所示，柴胡注射液（250 mg/mL）作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h后，肝癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；與對(duì)照組比較，柴胡注射液組細(xì)胞凋亡率明顯升高（＜0.001）。

與SMMC-7721細(xì)胞對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與LO-2細(xì)胞對(duì)照組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001，圖2～5同

圖2 柴胡注射液對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期的影響(, n = 3)

3.3 柴胡注射液對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，柴胡注射液顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞遷移（＜0.05、0.001），表明柴胡注射液具有抑制肝癌細(xì)胞遷移的作用。

3.4 柴胡注射液對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期、凋亡和遷移相關(guān)蛋白及基因表達(dá)的影響

3.4.1 細(xì)胞周期相關(guān)基因與蛋白表達(dá) 如圖5-A、B所示，與對(duì)照組比較，柴胡注射液組、、、、、、mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01、0.001），NPAS2和CDC25A蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.001）。

3.4.2 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 如圖5-C所示，與對(duì)照組比較，柴胡注射液組Bax、Bax/Bcl-2、Cyt-C、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01、0.001），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.001）。

圖3 柴胡注射液對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響(, n = 3)

圖4 柴胡注射液對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移的影響(, n = 3)

3.4.3 遷移相關(guān)蛋白表達(dá) 如圖5-D所示，與對(duì)照組比較，柴胡注射液組MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001），MMP-9/TIMP-1值顯著降低（＜0.01）。

3.5 代謝組學(xué)分析

3.5.1 代謝輪廓數(shù)據(jù)采集 采用UHPLC-MS對(duì)正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、柴胡注射液組樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，得到正、負(fù)離子模式下的代謝輪廓（圖6）。

3.5.2 方法學(xué)考察 為了監(jiān)測(cè)UHPLC-MS穩(wěn)定性，每6針樣品之后進(jìn)一針質(zhì)控樣品。每針質(zhì)控樣品提取10個(gè)離子，計(jì)算6針質(zhì)控樣品中該10個(gè)提取離子的保留時(shí)間以及質(zhì)荷比的RSD值。如表2所示，保留時(shí)間的RSD為0.136%～0.436%，質(zhì)荷比的RSD為（3.28×10?5～6.15×10?5）%，提示所建立的UHPLC-MS方法符合批量肝細(xì)胞分析要求。

圖6 正(A)、負(fù)(B)離子模式下各組樣本總離子流圖

表2 UHPLC-MS穩(wěn)定性結(jié)果

Table2 UHPLC-MS stability results

編號(hào)tR/minRSD/%m/zRSD/%離子模式 11.550.236 7147.052 96.15×10?5[M＋H]+ 22.100.315 8111.043 54.72×10?5[M＋H]+ 33.100.436 8152.033 24.82×10?5[M－H]? 45.740.426 1151.049 53.37×10?5[M＋H]+ 56.910.264 8148.052 55.17×10?5[M－H]? 613.030.375 8132.077 93.48×10?5[M－H]? 718.540.421 6465.309 03.28×10?5[M＋H]+ 820.230.136 8449.314 44.75×10?5[M＋H]+ 920.970.236 3299.282 44.17×10?5[M＋H]+ 1021.460.169 2467.301 33.86×10?5[M＋H]+

3.5.3 差異代謝物分析與鑒定 PLS-DA得分圖可看出，正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞明顯分離，表明肝癌細(xì)胞內(nèi)源性代謝與正常肝細(xì)胞內(nèi)源性代謝產(chǎn)生差異；藥物干預(yù)組與肝癌細(xì)胞組明顯分離（圖7-A）。為了驗(yàn)證模型可靠性，對(duì)上述模型數(shù)據(jù)進(jìn)行排列實(shí)驗(yàn)（＝200），評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參考課題組已發(fā)表文獻(xiàn)報(bào)道[21]，相關(guān)驗(yàn)證結(jié)果表明模型可靠（圖7-B）。

OPLS-DA得分圖顯示正常肝細(xì)胞組和肝癌組明顯分離（圖7-C），表明肝癌細(xì)胞代謝輪廓發(fā)生改變。借助HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)正常肝細(xì)胞組、肝癌細(xì)胞組和藥物干預(yù)組的顯著性差異物進(jìn)行鑒定指認(rèn)，共鑒定指認(rèn)出20個(gè)與肝癌相關(guān)的差異代謝物（表3）。

3.5.4 柴胡注射液對(duì)差異代謝物的影響 如圖8所示，與模型組比較，柴胡注射液能夠回調(diào)的差異代謝物有10種，如涉及脂質(zhì)代謝的神經(jīng)酰胺（d18∶1/16∶0），涉及糖酵解途徑的3-磷酸甘油酸，涉及脂肪酸代謝的肉桂酸、2-羥基己酸，涉及氨基酸代謝的-正亮氨酸、谷氨酰胺，涉及核苷酸代謝的胞嘧啶核苷、尿苷、鳥(niǎo)嘌呤均顯著下降（＜0.05、0.01、0.001），涉及核苷酸代謝的次黃嘌呤顯著上升（＜0.01）。

圖7 各組樣品PLS-DA得分圖(A) 及其模型驗(yàn)證圖(B)、正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞樣本的OPLS-DA得分圖(C) 及S-Plot圖(D)

表3 各組樣本差異代謝物

Table3 Differential metabolites of samples in each group

編號(hào)tR/minm/z離子模式代謝物SMCC-7721細(xì)胞vs LO-2細(xì)胞柴胡注射液vs SMMC-7721細(xì)胞通路 11.50149.105 2[M＋H]+三乙醇胺↓↓脂質(zhì)代謝 220.97299.282 4[M＋H]+鞘氨醇↓↓脂質(zhì)代謝 330.61538.519 7[M＋H]+神經(jīng)酰胺（d18∶1/16∶0）↑↓脂質(zhì)代謝 421.46467.301 3[M＋H]+溶血卵磷脂（14∶0/0∶0）↓—脂質(zhì)代謝 51.92185.992 4[M－H]?3-磷酸甘油酸↑↓糖酵解途徑 66.91148.052 5[M－H]?肉桂酸↑↓脂肪酸代謝 713.03132.077 9[M－H]?2-羥基己酸↑↓脂肪酸代謝 81.91203.115 9[M＋H]+乙酰肉堿↓—脂肪酸代謝 918.54465.309 0[M＋H]+甘氨膽酸↓↓膽汁酸代謝 1020.23449.314 4[M－H]?甘氨熊脫氧膽酸↓↓膽汁酸代謝 113.43131.094 8[M－H]?L-正亮氨酸↑↓氨基酸代謝 121.55147.052 9[M＋H]+谷氨酸↓↓氨基酸代謝 131.40146.069 2[M－H]?谷氨酰胺↑↓氨基酸代謝 142.10111.043 5[M＋H]+胞嘧啶↑↑核苷酸代謝 151.93243.085 6[M＋H]+胞嘧啶核苷↑—核苷酸代謝 163.16244.069 4[M＋H]+尿苷↑↓核苷酸代謝 172.73136.038 6[M＋H]+次黃嘌呤↓↑核苷酸代謝 183.10152.033 2[M－H]?黃嘌呤↓↓核苷酸代謝 195.74151.049 5[M＋H]+鳥(niǎo)嘌呤↑↓核苷酸代謝 202.00347.063 1[M＋H]+5′-磷酸腺苷↓↓核苷酸代謝

“↑”表示升高；“↓”表示降低；“—”表示無(wú)變化

“↑” indicates increasing; “↓” indicates decreasing; “—” indicates no change

與正常組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

3.5.5 差異代謝物的代謝通路分析 為更好分析各差異代謝物在正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、藥物干預(yù)組間的內(nèi)在聯(lián)系，借助在線京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述差異代謝物做整合代謝通路分析（圖9）。10種柴胡注射液回調(diào)的差異代謝物主要涉及核苷酸代謝、脂肪酸代謝途徑、氨基酸代謝途徑等。

4 討論

肝癌即肝臟惡性腫瘤，外科通常以手術(shù)為主，由于其解剖部位特殊，治療效果不佳，存在一定風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)多以中西醫(yī)結(jié)合治療為主[6]。柴胡具有疏肝解郁、保肝柔肝的功效，臨床上運(yùn)用柴胡注射液配合TACE技術(shù)治療肝癌取得較好療效，但是柴胡注射液抑制肝癌細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)其凋亡的作用機(jī)制還需要探究。

代表肝癌細(xì)胞組與正常肝細(xì)胞組比較的變化；代表給藥組與肝癌細(xì)胞組比較的變化

研究發(fā)現(xiàn)，節(jié)律基因的紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且已在肝癌、乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中得到證實(shí)[22]?；蚴遣溉閯?dòng)物中最大的生物鐘基因，在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)化，從而提高肝癌細(xì)胞的生存率[23]。研究報(bào)道CDC25A蛋白通過(guò)調(diào)控下游CDK2-cyclin A復(fù)合物參與S-G2的進(jìn)程，CDC25A的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到基因的調(diào)控[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡注射液可以顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，使肝癌細(xì)胞阻滯于S期與G2期，為了探究其作用機(jī)制，借助qRT-PCR及Western blotting技術(shù)對(duì)相關(guān)基因與蛋白進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明細(xì)胞阻滯于S期可能是由于柴胡注射液下調(diào)NPAS2，進(jìn)而下調(diào)CDC25A，導(dǎo)致CDK2-cyclin A復(fù)合物表達(dá)水平下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞S期過(guò)渡到G2期受阻。CDC25B在多種腫瘤中高表達(dá)，能夠阻滯細(xì)胞周期[26]。研究發(fā)現(xiàn)CDC25B作為G2/M期過(guò)渡的關(guān)鍵基因，通過(guò)調(diào)控下游底物CDK1-cyclin B1復(fù)合物去磷酸化參與G2/M進(jìn)程[27]。qRT-PCR結(jié)果提示肝癌細(xì)胞在G2期受阻可能是因?yàn)椴窈⑸湟合抡{(diào)基因從而導(dǎo)致CDK1-cyclin B1復(fù)合物表達(dá)下降，G2/M肝癌周期進(jìn)程受阻。為了探究肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制，采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá)，結(jié)果提示柴胡注射液通過(guò)調(diào)控Bax/Bcl-2值，促使Cyt-C從線粒體釋放，進(jìn)而激活下游Caspase-3蛋白，從而引起肝癌細(xì)胞凋亡。但也有研究發(fā)現(xiàn)CDC25A蛋白可以調(diào)控Bcl-2蛋白去磷酸化參與肝癌細(xì)胞凋亡[24]，因此推測(cè)柴胡注射液可能會(huì)通過(guò)下調(diào)NPAS2，進(jìn)而下調(diào)CDC25A的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白去磷酸化，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞因其基因或者表觀遺傳的改變，導(dǎo)致許多代謝通路發(fā)生紊亂[28]。為了探究柴胡注射液是通過(guò)何種代謝通路導(dǎo)致肝癌細(xì)胞發(fā)生阻滯與凋亡，采用代謝組學(xué)方法鑒定了20個(gè)與肝癌相關(guān)的差異代謝物；其中柴胡注射液能夠回調(diào)的肝癌細(xì)胞差異代謝物有10種。研究報(bào)道神經(jīng)酰胺（d18∶1/16∶0）通過(guò)調(diào)控參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）/C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）復(fù)合物發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用[29]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡注射液可能通過(guò)調(diào)控神經(jīng)酰胺（d18∶1/16∶0）合成，進(jìn)而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而發(fā)揮促進(jìn)肝癌凋亡。病理情況下，細(xì)胞更傾向于糖酵解途徑供能[30]，3-磷酸甘油酸的生成是糖酵解途徑中的重要環(huán)節(jié)，柴胡注射液組3-磷酸甘油酸顯著下降，提示柴胡注射液可能通過(guò)阻滯糖酵解途徑，干預(yù)3-磷酸甘油酸的生成，進(jìn)而阻斷肝癌細(xì)胞的能量供應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)干擾脂肪酸的合成可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[31]；乙酰輔酶A是合成脂肪酸的原料，肉桂酸參與乙酰輔酶A的合成[32]，2-羥基己酸參與脂肪酸代謝途徑[33]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡注射液組肉桂酸及2-羥基己酸顯著下調(diào)，因此推測(cè)柴胡注射液通過(guò)調(diào)控脂肪酸代謝途徑，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。腫瘤的發(fā)生發(fā)展離不開(kāi)氨基酸代謝的參與[34]，臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝癌患者血漿中多種氨基酸水平發(fā)生明顯改變[35]，本研究結(jié)果表明柴胡注射液通過(guò)干預(yù)-正亮氨酸、谷氨酰胺的合成從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的凋亡。相關(guān)肝癌研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者體內(nèi)存在核苷酸代謝異常[36]，因此柴胡注射液組鳥(niǎo)嘌呤顯著降低，可能與次黃嘌呤的增加相關(guān)；可能是由于柴胡注射液阻斷了次黃嘌呤向鳥(niǎo)嘌呤的轉(zhuǎn)化；另外柴胡注射液組胞嘧啶顯著增加，而尿苷顯著降低，表明柴胡注射液可能阻滯胞嘧啶向尿苷的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而可能阻斷肝癌中DNA的合成從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡。

綜上，柴胡注射液不僅能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖而且能夠使其凋亡，肝癌細(xì)胞阻滯于S期主要與NPAS2-CDC25A-CDK2-cyclin A通路有關(guān)，阻滯于G2期主要與CDC25B、CDK1-cyclin B1復(fù)合物有關(guān)，凋亡主要與NPAS2-CDC25A、Bax/Bcl-2、Caspase-3有關(guān)，代謝組學(xué)結(jié)果提示還與核苷酸、脂質(zhì)與氨基酸代謝等通路密切相關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Bupleurum Injection against liver cancer based on molecular biology and metabolomics

CHEN Yi-xiao1, 2, 3, WANG Wei-yu1, 2, 3, FENG Jian-you1, 2, 3, QIN Xue-mei1, 2, 3, GAO Xiao-xia1, 2, 3

1. Modern Research Center of Traditional Chinese Medicine at Shanxi University, Taiyuan 030006, China 2. Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China 3. Shanxi Provincial Key Laboratory of Research and Utilization of Functional Substances in Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030006, China

To explore the effect and mechanism of Bupleurum Injection (柴胡注射液, BI) on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.Human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells and normal human hepatocytes (LO-2) were cultured, and different concentrations of BI were given for intervention. MTT assay and scratch test were used to detect cell proliferation and migration. Cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. qRT-PCR and Western blotting were used to detect the expressions of genes and proteins related to cycle arrest, apoptosis and migration. Metabolomics technology was used to detect the changes of endogenous differences in hepatocellular carcinoma cells before and after BI intervention, and the metabolic pathway regulated by BI was analyzed by Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG).BI (100—450 mg/mL) significantly inhibited the proliferation of hepatocellular carcinoma cells (< 0.01, 0.001), arrested the cells in S phase and G2phase (< 0.05), promoted the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells (< 0.001), and inhibited the migration of hepatocellular carcinoma cells (< 0.05, 0.001), which indicated that BI had significant anti-hepatoma effect. BI significantly decreased neuronal pas domain protein 2 (), cell division cycle 25A (), cyclin-dependent kinase 2 (),,,andmRNA expression (< 0.01, 0.001), down-regulated NPAS2, CDC25A and B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) protein expressions (< 0.001), up-regulated Bcl-2 associated X protein (Bax), cytochrome-C (Cyt-C), cystein-asparate protease-3 (Caspase-3), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) protein expressions (< 0.01, 0.001). The results of metabolomics showed that BI interfered with nucleotide metabolism, lipid metabolism, glycolytic pathway, amino acid metabolism and fatty acid metabolism.BI can block and promote apoptosis of SMMC-7721 cells. The possible mechanism is that down-regulation of NPAS2-CDC25A can block cells in S phase, down-regulation of CDC25B, CDK1 and cyclin B1 can block cells in G2phase, down-regulation of MMP-9/TIMP-1 can inhibit the migration of hepatocellular carcinoma cells, and regulate the metabolism of nucleotides, lipids and amino acids, thus inducing apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.

Bupleurum Injection; liver cancer; apoptosis; cell cycle; migration; metabolomics

R285.5

A

0253 - 2670(2023)17 - 5590 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.013

2023-04-04

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82174099）；山西省基礎(chǔ)應(yīng)用項(xiàng)目面上項(xiàng)目（20210302123432）；名優(yōu)晉藥再開(kāi)發(fā)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（202104010910001）；地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（201605D111004）

陳一笑（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹?dòng)學(xué)。Tel: 15383417482 E-mail: yixiaochen2021@163.com

高曉霞，女，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥藥動(dòng)學(xué)、中醫(yī)藥代謝組學(xué)等研究。Tel: (0351)7019297 E-mail: gaoxiaoxia@sxu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]