徐靖 朱紅林 林延慧 唐力瓊 唐清杰，2 王效寧，2

（1. 海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所 海南省農(nóng)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571100；2. 海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院，三亞 572000）

綠原酸是廣泛存在于植物中的酚類化合物，具有抗菌、抗病毒、活血降壓、抑制腫瘤和清除自由基等生物活性［1-3]。隨著對(duì)天然抗氧化劑需求量的增加，從植物中提取的綠原酸供不應(yīng)求。甘薯（Ipomoea batatas L.（Lam.））莖、葉和塊根中均含有綠原酸類物質(zhì)，能夠成為提取綠原酸類物質(zhì)的新資源［4-5]。甘薯中的綠原酸可以降低餐后血糖，同樣也顯示出較好的抗氧化能力，其含量已成為評(píng)價(jià)菜用甘薯品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)［6-9]。此外，綠原酸等酚類物質(zhì)的存在能夠提高甘薯的抗病和抗蟲害能力［10-12]。目前，甘薯綠原酸的研究主要集中在生物活性方面，但其生物合成途徑和分子調(diào)控機(jī)制還不清楚［13-14]。揭示甘薯綠原酸的生物合成和調(diào)控途徑，挖掘綠原酸積累相關(guān)基因，對(duì)開(kāi)展高綠原酸甘薯新品種的選育具有重要意義。

羥基桂皮酰輔酶A羥基桂皮酰轉(zhuǎn)移酶（hydroxycinnamoyl CoA quinate hydrocycinnamoyl transferase,HQT）是植物綠原酸生物合成的關(guān)鍵酶。在蒲公英、馬鈴薯、金銀花和煙草等植物中過(guò)表達(dá)或抑制HQT后綠原酸含量發(fā)生明顯提高和降低［15-21]。轉(zhuǎn)錄因子可激活類黃酮、單寧和木質(zhì)素等次生代謝物生物合成途徑中多個(gè)酶基因協(xié)同表達(dá)，在苯丙素類物質(zhì)生物合成中起著重要的調(diào)控作用［22-23]。目前，對(duì)類黃酮生物合成調(diào)控的研究比較深入，其合成途徑中的PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、DFR等關(guān)鍵酶基因的表達(dá)受到MYB、bHLH、WD40、WRKY、NAC和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)［24]。

前期研究表明，甘薯中存在2個(gè)HQT編碼基因，其中，HbHQT1可能是甘薯綠原酸生物合成的關(guān)鍵基因［25]，但對(duì)其表達(dá)調(diào)控仍不清楚。

本研究利用酵母單雜交技術(shù)在甘薯葉cDNA酵母文庫(kù)中篩選與HbHQT1啟動(dòng)子結(jié)合的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，為進(jìn)一步揭示HbHQT1在甘薯綠原酸生物合成中的作用和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘薯（QS80-12-11）是海南本地種植的菜用甘薯品種，種植于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院永發(fā)實(shí)驗(yàn)基地海南省甘薯種質(zhì)資源保存圃內(nèi)，生長(zhǎng)60 d后，取甘薯葉片洗凈表面后用液氮速凍后，-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA文庫(kù)構(gòu)建 采用Trizol法提取甘薯葉RNA，通過(guò)核酸蛋白檢測(cè)儀NanoDrop 2000C檢測(cè)RNA純度和完整性。按照DynabeadsTMmRNA純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行mRNA的分離純化，用酵母單雜交文庫(kù)構(gòu)建試劑盒進(jìn)行雙鏈cDNA的合成和純化，將雙鏈cDNA與pGADT7-Rec線性質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化酵母菌Y187中進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建，并對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行鑒定。

1.2.2 IbHQT1啟動(dòng)子的克隆及誘餌載體的構(gòu)建 根據(jù)甘薯基因組數(shù)據(jù)（https://sweetpotao.com/download_genome.html）中IbHQT1翻譯起始密碼子上游約1500 bp啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異引物P1（5'-CACACTGGTTTGAGAAGTG-3'）和P2（5'-TTAAACTTCTCACTTGCCAT-3'），以甘薯（QS80-12-11）基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后切膠回收，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送至中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用在線軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/PLACE）對(duì)啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)。將IbHQT1啟動(dòng)子序列通過(guò)同源重組的方法連接到pHIS2載體中，獲得pHIS2-IbHQT1pro誘餌載體。

1.2.3 酵母單雜交文庫(kù)的篩選 將pHIS2-IbHQT1pro誘餌載體轉(zhuǎn)入Y187菌株中制備誘餌菌株，陽(yáng)性克隆稀釋后涂板至添加不同濃度（0、50和75 mmol/L）3AT的SD/-Trp-His平板上，測(cè)定能夠抑制HIS3表達(dá)的最低3-AT濃度。將文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入誘餌菌株，涂在含有合適3-AT的SD/-Leu-Trp-His平板上，30℃ 3-5 d后，挑取能夠正常生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行復(fù)篩，仍能夠繼續(xù)正常生長(zhǎng)的視為互作蛋白。最后，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，將具有單一條帶且大于1000 bp的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI Blast進(jìn)行同源檢索，篩選潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

1.2.4 陽(yáng)性克隆的酵母單雜交驗(yàn)證 將候選互作轉(zhuǎn)錄因子基因連接到pGADT7載體并轉(zhuǎn)入pHIS2-IbHQT1pro誘餌菌株，在SD/-Trp-His平板上30℃倒置培養(yǎng)3-5 d，轉(zhuǎn)移單菌落在含有3-AT的SD/-Leu-Trp-His平板上進(jìn)行復(fù)篩，驗(yàn)證候選互作基因與IbHQT1啟動(dòng)子的結(jié)合的真實(shí)性。

1.2.5 基因表達(dá)及相關(guān)性分析 根據(jù)已發(fā)表的數(shù)據(jù)［25]，提取基因表達(dá)和綠原酸含量數(shù)值，利用EXCEL軟件中的CORREL函數(shù)來(lái)計(jì)算兩者之間的相關(guān)性系數(shù)，利用在線軟件Chiplot（https://www.chiplot.online/）繪制相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果

2.1 IbHQT1啟動(dòng)子的克隆與順式作用元件分析

根據(jù)IbHQT1上游序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增獲得目的片段，并連接pMD19-T載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，IbHQT1起始密碼子1500 bp啟動(dòng)子序列已成功克隆。序列分析顯示，IbHQT1啟動(dòng)子中除了包含典型的真核生物啟動(dòng)子順式元件CAATbox和TATA-box外，還存在水楊酸響應(yīng)元件TCAelement、赤霉素響應(yīng)元件TATC-box、乙烯響應(yīng)元件ERE、茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif、生長(zhǎng)素反應(yīng)元件AuxRR-core和脫落酸響應(yīng)元件ABRE，脅迫響應(yīng)元件STRE和TC-rich repeats及多個(gè)光響應(yīng)元件如AE-box、Box 4、GATA-motif和G-box。此外，IbHQT1啟動(dòng)子還含有AAAG/CTTT、RAA、W-Box、MBS、MYC和TGACG元件（圖1），這些元件可以被DOf、ERF、WRKY、MYB、MYC和TGA轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別。結(jié)果表明，IbHQT1的表達(dá)可能受到上述激素和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

圖1 IbHQT1啟動(dòng)子序列及主要順式元件Fig. 1 Promoter sequences of IbHQT1 and main cis-elements

2.2 pHIS2-IbHQT1pro誘餌質(zhì)粒3AT濃度篩選

將1500 bp的IbHQT1啟動(dòng)子與酵母單雜交載體pHIS2連接，構(gòu)建誘餌載體pHIS2-IbHQT1pro。將構(gòu)建成功的pHIS2-IbHQT1pro質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y187酵母菌，并涂平板培養(yǎng)3 d后，隨機(jī)挑取3個(gè)單菌落稀釋后涂板至不同濃度（0、50和75 mmol/L）3AT的SD/-Trp-His平板上，30℃培養(yǎng)3 d。結(jié)果顯示，隨著3AT濃度增加，轉(zhuǎn)化子數(shù)量明顯減少（圖2-A，B），而當(dāng)3AT添加到75 mmol/L時(shí)轉(zhuǎn)化子基本不生長(zhǎng)（圖2-C），表明75 mmol/L的3AT濃度可以有效抑制HIS3報(bào)告基因的表達(dá)，該濃度可用于后續(xù)文庫(kù)篩選。

圖2 pHIS2-IbHQT1pro誘餌載體自激活檢測(cè)Fig. 2 Self-activation of pHIS2-IbHQT1pro bait vector

2.3 酵母單雜交文庫(kù)構(gòu)建和質(zhì)量鑒定

核酸濃度檢測(cè)顯示OD260/280為1.94，OD260/230為2.27，28S/18S為2.27，說(shuō)明總RNA質(zhì)量和純度較好，可用于構(gòu)建酵母單雜交cDNA文庫(kù)。將純化后的雙鏈cDNA與線性化的pGADT7-Rec2載體共轉(zhuǎn)化酵母菌，經(jīng)篩選后，獲得230個(gè)單菌落，總庫(kù)容量為1.15×107CFU，大于107。挑取平板上的單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，結(jié)果表明，平均插入片段大于1200 bp，陽(yáng)性率為100%（圖3），說(shuō)明酵母單雜交文庫(kù)構(gòu)建成功，可以用于下一步試驗(yàn)。

圖3 文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度的PCR 檢測(cè)Fig. 3 Detection of inserted fragment lengths in the library by PCR

2.4 酵母單雜交文庫(kù)互作蛋白的初步篩選

利用共轉(zhuǎn)化方法將25 μg文庫(kù)質(zhì)粒和5μg pHIS2-IbHQT1pro誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含75 mmol/L的3AT的SD/-Trp-Leu-His平板上培養(yǎng)3-5 d，初步篩選獲得17個(gè)轉(zhuǎn)化子，將這些陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子分別用無(wú)菌水稀釋后進(jìn)行點(diǎn)板復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)17個(gè)轉(zhuǎn)化子均能在添加3-AT的篩選平板上旺盛生長(zhǎng)（圖4-A）。對(duì)17個(gè)陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物測(cè)序并進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示，有2個(gè)為推定的轉(zhuǎn)錄因子，分別與MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB11-like（NCBI登錄號(hào)：LOC125212678）和TGA轉(zhuǎn)錄因子TGA2.2-like（NCBI登錄號(hào)：LOC116027932）同源，其余大多為功能未知的蛋白，這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（IbMYB11和IbTGA2.2）可能與IbHQT1啟動(dòng)子存在潛在互作關(guān)系。

圖4 IbHQT1啟動(dòng)子互作蛋白的篩選和鑒定Fig. 4 Screening and identification of IbHQT1 promoter interacting proteins

2.5 IbMYB11和IbTGA2.2與IbHQT1啟動(dòng)子互作的鑒定

分別將IbMYB11-AD和IbTGA2.2-AD與pHIS2-IbHQT1pro誘餌載體進(jìn)行酵母單雜交互作驗(yàn)證，結(jié)果顯示，所有共轉(zhuǎn)誘餌質(zhì)粒和AD載體的酵母菌株在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)；挑取SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基上的菌落至含75 mmol/L 3AT的SD/-Trp-Leu-His平板上，IbMYB11-AD/pHIS2-IbHQT1pro、IbTGA2.2-AD/pHIS2-IbHQT1pro和陽(yáng)性對(duì)照克隆均可正常生長(zhǎng)，而陰性對(duì)照則不能生長(zhǎng)（圖4-B），表明IbMYB11和IbTGA2.2蛋白可以與IbHQT1啟動(dòng)子發(fā)生互作。

2.6 IbMYB11、IbTGA2.2和IbHQT1基因共表達(dá)分析

為了解IbMYB11和IbTGA2.2與IbHQT1之間調(diào)控關(guān)系，根據(jù)已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［25]，分析其共表達(dá)特征發(fā)現(xiàn)，它們?cè)谒鶛z測(cè)的甘薯嫩葉和嫩莖中高表達(dá)，在塊根中表達(dá)量相對(duì)較低（圖5-A）。利用CORREL函數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IbMYB11和IbTGA2.2與IbHQT1表達(dá)之間存在正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.79和0.98（圖5-B）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)IbMYB11和IbTGA2.2的表達(dá)與甘薯中6種綠原酸及總綠原酸含量明顯正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均在0.75以上（圖5-B）。結(jié)果表明，IbMYB11和IbTGA2.2可能通過(guò)調(diào)控IbHQT1參與甘薯綠原酸的積累。

圖5 IbMYB11、IbTGA2.2和IbHQT1共表達(dá)（A）及其與甘薯綠原酸積累相關(guān)性（B）Fig. 5 Co-expression of IbMYB11, IbTGA2.2 and IbHQT1（A）and their correlations with chlorogenic acid accumulation in sweet potato（B）

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與下游靶基因啟動(dòng)子結(jié)合進(jìn)而激活或抑制靶基因的表達(dá)，在植物次生代謝生物合成過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用［26-27]。IbHQT1是甘薯綠原酸生物合成的關(guān)鍵酶基因，挖掘鑒定IbHQT1上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對(duì)揭示甘薯綠原酸生物合成調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。本研究分離獲得1500 bp的IbHQT1上游DNA序列，通過(guò)PlantCARE對(duì)IbHQT1啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，IbHQT1啟動(dòng)子區(qū)存在DOf、ERF、WRKY、MYB、MYC和TGA等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，暗示IbHQT1的表達(dá)可能受到這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控；進(jìn)一步利用酵母單雜交技術(shù)，以IbHQT1啟動(dòng)子序列為誘餌，篩選出2個(gè)與IbHQT1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子IbMYB11和IbTGA2.2。

MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物次生代謝物生物合成途徑中具有重要的調(diào)控作用，尤其是對(duì)苯丙素類代謝物的調(diào)控研究比較深入［28-29]。MYB基因家族中第S4、S5、S6和S7亞家族成員廣泛參與包括類黃酮、花青素和木質(zhì)素在內(nèi)的多種苯丙素類代謝物的生物合成［29-32]。本研究篩選到IbMYB11能夠與IbHQT1啟動(dòng)子發(fā)生互作，IbMYB11屬于S7亞家族成員，擬南芥中S7亞家族成員AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111具有調(diào)控苯丙烷次生代謝產(chǎn)物黃酮醇生物合成的功能［33]。在番茄（Solanum lycopersicum）與煙草（Nicotiana tabacum）過(guò)表達(dá)擬南芥AtMYB11和AtMYB12均能促進(jìn)綠原酸及黃酮醇的合成［34-35]。TGA轉(zhuǎn)錄因子是bZIP轉(zhuǎn)錄因子一個(gè)亞家族，能夠特異結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)的TGACG-motif，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)及次生代謝調(diào)控方面具有重要的功能［35]。目前，已證實(shí)TGA轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控天然橡膠、青蒿素、雷公藤甲素和生物堿等次生代謝物生物合成［36-39]，但其是否調(diào)控苯丙素類代謝物生物合成還未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)IbTGA2.2能夠與IbHQT1啟動(dòng)子發(fā)生互作，說(shuō)明其可能參與甘薯綠原酸的生物合成調(diào)控。此外，IbMYB11、IbTGA2.2和IbHQT1在甘薯不同組織和發(fā)育階段具有類似的表達(dá)特征，且與甘薯綠原酸含量存在明顯的正相關(guān)。這些結(jié)果說(shuō)明，IbMYB11和IbTGA2.2可能通過(guò)調(diào)控IbHQT1的表達(dá)參與甘薯綠原酸的生物合成的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物次生代謝時(shí)通常和其他轉(zhuǎn)錄共激活子或轉(zhuǎn)錄共抑制子形成復(fù)合體，例如，MYB通常與bHLH、WD40、ERF、NAC和WRKY等轉(zhuǎn)錄因子互作形成復(fù)合體協(xié)同調(diào)控代謝途徑中的多個(gè)基因的表達(dá)，在植物苯丙烷類代謝物積累中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［40-43]。接下來(lái)將深入研究IbMYB11和IbTGA2.2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)IbHQT1轉(zhuǎn)錄的調(diào)控效應(yīng)，并鑒定還有哪些轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同參與，為揭示甘薯綠原酸積累機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

獲得2個(gè)與IbHQT1啟動(dòng)子相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子IbMYB11和IbTGA2.2，二者與IbHQT1具有類似的表達(dá)特征且與綠原酸積累正相關(guān)，可能通過(guò)調(diào)控IbHQT1的表達(dá)進(jìn)而參與甘薯綠原酸的生物合成。