王佳蕊 孫培媛 柯瑾 冉彬 李洪有

（1. 貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴陽 550001；2. 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025）

類黃酮化合物是一類廣泛存在于植物中的次生代謝物，在植物生長發(fā)育、生物與非生物脅迫抵抗中起著至關(guān)重要的作用［1-2]。此外，類黃酮化合物還具有降“三高”、消炎、抗氧化、抗病毒、抗動(dòng)脈硬化、抗糖尿病、抗癌防癌等多種保健功能［3-4]。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)差異，將類黃酮化合物分為黃酮、異黃酮、黃酮醇、黃烷酮、黃烷醇和花青素六大類［5]。在植物中，大多數(shù)類黃酮化合物以糖苷類化合物形式存在。通常，植物中類黃酮化合物的糖基化由糖基轉(zhuǎn)移酶催化完成，糖基化的位置主要發(fā)生在3-O位或7-O位，少部分也發(fā)生在5-O位和4'-O位。此外，還有少部分類黃酮化合物直接在苯環(huán)上的6-C位或8-C位發(fā)生糖基化，這類化合物稱為類黃酮C-糖苷［5]。

目前，植物中已報(bào)道的類黃酮C-糖苷主要有牡荊素（芹菜素-8-C-葡萄糖苷）、異牡荊素（芹菜素-6-C-葡萄糖苷）、葒草素（木犀草素-8-C-葡萄糖苷）、異葒草素（木犀草素-6-C-葡萄糖苷）等［6]。它們在植物中具有較強(qiáng)的生物活性，不易水解，對植物生長和發(fā)育、非生物和生物脅迫的響應(yīng)以及環(huán)境防御等發(fā)揮的作用［7]。在植物中，類黃酮C-糖苷的生物合成主要是在C-糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，直接將糖基供體轉(zhuǎn)移到底物黃酮的苯環(huán)骨架的C上。目前，在植物中已有多個(gè)C-糖基轉(zhuǎn)移酶被鑒定［6]。He等［8]在金蓮花（Trollius chinensis Bunge）中鑒定到的C-糖基轉(zhuǎn)移酶TcCGT1，可以特異性地催化黃酮類、黃酮醇等黃酮類化合物的8-C糖基化黃酮類化合物。Wang等［9]在大豆（Glycine max（Linn）Merr.）毛狀根中過表達(dá)葛根（Pueraria montana var.lobata）的PIUGT43，發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白酶具有將大豆苷元催化為葛根素的活性，且對異黃酮具有底物專一性。Mashima等［10]將山葵（Wasabia japonica（Miq.）Matsum.）的WjGT1在大腸桿菌中重組表達(dá)發(fā)現(xiàn)，該酶可將芹菜素或木犀草素催化合成異牡荊苷或異葒草苷。Brazier-Hicks等［11]發(fā)現(xiàn)水稻（Oryza sativa L.）OsCGT可通過與脫水酶協(xié)同作用催化2-羥基黃酮合成黃酮C-糖苷。在甜蕎（Fagopyrum esculentum moench）的研究中發(fā)現(xiàn)，糖基轉(zhuǎn)移酶FeCGTa和FeCGTb均以2-OH黃烷酮為底物催化生成黃酮C-糖苷［12]。

苦蕎（Fagopyrum tataricum Gaertn）屬于蓼科蕎麥屬，是起源于我國西南地區(qū)的一年生小雜糧作物，含有豐富的高活性類黃酮化合物（1.0%-3.0%），具有較高的保健作用［3-4]。目前，在苦蕎種子中已鑒定到90余種類黃酮化合物，其中一半以上為黃酮糖苷類化合物，包括類黃酮C-糖苷中的牡荊素、異牡荊素、葒草素和異葒草素等［3]。在苦蕎中，目前已有多個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶被功能鑒定催化了黃酮糖苷的合成［13-17]，但未見參與類黃酮C-糖苷生物合成的C-糖苷糖基轉(zhuǎn)移酶基因的相關(guān)報(bào)道。課題組前期對苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，通過系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)候選基因與已鑒定功能的C-糖基轉(zhuǎn)移酶聚在一支（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。本研究利用RT-PCR技術(shù)，從苦蕎品種‘品苦1號’中克隆一個(gè)可能參與苦蕎類黃酮C-糖苷生物合成的C-糖基轉(zhuǎn)移酶基因FtUGT143，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、分子對接、基因表達(dá)、基因表達(dá)量與類黃酮C-糖苷含量關(guān)系分析，以期為苦蕎類黃酮C-糖苷生物合成中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 苦蕎品種‘品苦1號’，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.1.2 載體 pMD19-T，購自大連寶日醫(yī)生物公司。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取‘品苦1號’芽苗期的根、莖、葉，6葉期植株的根、莖、葉，成年期植株的花、種子的總RNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 cDNA（complementary DNA）獲取 以葉片的總RNA為模板，PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用于基因全長CDS序列克隆的第一鏈cDNA。根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書，分別以‘品苦1號’芽苗期的根、莖、葉，6葉期植株的根、莖、葉，成年植株的花、種子的總RNA為模板，合成用于熒光定量的第一鏈cDNA。

1.2.3 FtUGT143全長CDS的克隆 根據(jù)已知苦蕎基因組數(shù)據(jù)中注釋的FtUGT143的核酸序列，BioXM 2.7和DNMAN軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因片段全長的CDS序列的特異性引物FtUGT143-F和FtUGT143-R（表1），以1.2.2中葉cDNA為模板，高保真KOD酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物加A尾反應(yīng)后，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后膠回收、連接目的產(chǎn)物、連接pMD19-T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α。PCR檢測陽性菌株后，送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 List of primers'sequences in this study

1.2.4 FtUGT143的生物信息學(xué)分析 CodonW 1.4.2對FtUGT143基因密碼子偏好性參數(shù)分析；BioXM 2.7查詢其最大開放閱讀框（open reading frame, ORF），預(yù)測其編碼的蛋白序列及編碼蛋白的等電點(diǎn)和分子量大小；NCBI中的BLAST比對查找FtUGT143蛋白的同源蛋白，DNAMAN進(jìn)行蛋白序列多序列比對；MEGA 7.0軟件采用NJ法構(gòu)建FtUGT143與其他已知的植物黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；AutoDock Vina 1.1.2對FtUGT143與4種類黃酮代謝小分子進(jìn)行分子對接模擬實(shí)驗(yàn)，Pymol 2.4.0可視化分析對接結(jié)果。

1.2.5 FtUGT143在苦蕎不同組織部位中的表達(dá)分析 BioXM 2.7軟件和DNAMAN軟件分析設(shè)計(jì)FtUGT143的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime PCR）引物qFtUGT143-F和qFtUGT143-R，設(shè)計(jì)內(nèi)參基因FtUPL7的熒光定量引物qFtUPL7-F和qFtUPL7-R（表1），以1.2.1中‘品苦1號’芽苗期的根、莖、葉，6葉期植株的根、莖、葉，成年植株的花、種子的總RNA為模板，苦蕎的FtUPL7作為內(nèi)參基因，SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行熒光定量分析，伯樂bio-rad實(shí)時(shí)定量PCR儀CFX96擴(kuò)增，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)情況。具體操作參照Li等［18]的方法進(jìn)行。參照王璐瑗等［19]方法提取和測定各組織部位中總黃酮含量。GraphPad Prism 9.0分析FtUGT143在苦蕎不同組織部位中的表達(dá)量與總黃酮含量間相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 FtUGT143全長CDS的克隆及其編碼蛋白特征分析

以‘品苦1號’葉片cDNA為模板，基因特異性引物FtUGT143-F和FtUGT143-R擴(kuò)增出一條約700 bp的目的條帶（圖1）。目的條帶經(jīng)測序比對，發(fā)現(xiàn)其與參照序列完全一致，CDS全長為678 bp，編碼226個(gè)氨基酸。Protparam在線軟件對FtUGT143進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，相對分子質(zhì)量為25.16 kD，理論等電點(diǎn)為4.76，是穩(wěn)定的疏水蛋白。

圖1 苦蕎FtUGT143基因全長CDS克隆Fig. 1 Full-length CDS clone of the FtUGT143 gene of buckwheat（Fagopyrum tataricum）

2.2 FtUGT143的生物信息學(xué)分析

2.2.1 FtUGT143的密碼子偏好分析 Codon W分析FtUGT143基因序列的密碼子偏好性，其序列的有效密碼子數(shù)（ENC值：范圍20-61）為51.17，表明FtUGT143的密碼子偏好性較弱；密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI值：范圍0-1）為0.1574，進(jìn)一步表明該基因的密碼子偏好性較弱。FtUGT143的GC與GC3s含量均小于50%，該ORF序列中GC含量小于AT含量，說明苦蕎的糖基轉(zhuǎn)移酶基因在編碼時(shí)偏好使用A或T結(jié)尾的密碼子。對FtUGT143密碼子RSCU值分析（圖2），其中有26個(gè)密碼子的RSCU值大于1，是FtUGT143的偏好密碼子；有13個(gè)密碼子的RSCU值大于1.5，為高頻率密碼子；而AGA和CCG的RSCU值最大（2.67），表明FtUGT143基因?qū)GA和CCG具有極強(qiáng)的偏好性。

圖2 FtUGT143密碼子RSCU值分析Fig. 2 Analysis of FtUGT143 codon's RSCU values

2.2.2 FtUGT143同源蛋白的多序列比對系統(tǒng)進(jìn)化分析 FtUGT143蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTp比對搜尋發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tUGT143與多種植物的糖基轉(zhuǎn)移酶序列有較高的同源性。蛋白多序列比對發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tUGT143的蛋白序列在C-末端結(jié)構(gòu)域附近存在一個(gè)由44個(gè)氨基酸組成的PSPG box（圖3-A）。該P(yáng)SPG box中包含高度保守的氨基酸序列HCGWNS（圖3-B），與前期研究的結(jié)論一致。PSPG box區(qū)域第44個(gè)氨基酸是谷氨酰胺（Gln,Q），推測FtUGT143可能偏好以UDP-葡萄糖作為糖供體，具體情況還需要進(jìn)一步研究。根據(jù)文獻(xiàn)和NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得多種植物已鑒定功能的糖基轉(zhuǎn)移酶，用MEGA7.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖4）顯示，F(xiàn)tUGT143和催化黃酮化合物C位糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶聚在同一分支上且與金蓮花TcCGT1親緣關(guān)系最近。

圖3 植物UGT蛋白氨基酸的序列多重比對與PSPG box比對分析Fig. 3 Sequence multi-alignment of plant UGT protein amino acids and comparative analysis of PSPG box

圖4 FtUGT143系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 4 FtUGT143 phylogenetic tree analysis

2.2.3 FtUGT143蛋白與底物分子對接 SWISSMODEL對FtUGT143進(jìn)行同源建模并使用AutoDock Vina 1.1.2對FtUGT143與山奈酚、表兒茶素、木犀草素、芹菜素（其中芹菜素和木犀草素是苦蕎中主要黃酮C-糖苷的合成底物）進(jìn)行分子對接分析，結(jié)果（表2）表明，F(xiàn)tUGT143的最適底物受體為木犀草素，其次是芹菜素。將FtUGT143的對接結(jié)果導(dǎo)入Pymol中進(jìn)行可視化分析（圖5）。FtUGT143與底物木犀草素通過傳統(tǒng)氫鍵與氨基酸殘基（Thr21、Gln22、Arg84、His98、Trp101、Asn102、Glu106、Gln123）相互作用；FtUGT143與底物芹菜素通過傳統(tǒng)氫鍵與氨基酸殘基（Thr21、Gln22、Arg84、His98、Trp101、Asn102、Glu106、Gln122、Gln123）相互作用，推測以上殘基是FtUGT143與小分子相互作用的關(guān)鍵殘基，主要作用力為氫鍵。這說明了FtUGT143可以與木犀草素和芹菜素發(fā)生相互作用，推測其可能具有催化木犀草素和芹菜素合成黃酮C-糖苷的功能。

圖5 FtUGT143和木犀草素、芹菜素對接示意圖Fig. 5 Schematic diagram of FtUGT143 docking with luteolin and apigenin

表2 FtUGT143與4種類黃酮代謝小分子的對接結(jié)果Table 2 Docking results of FtUGT143 with four flavonoids metabolizing small molecules

2.2.4 FtUGT143在苦蕎不同組織部位中的表達(dá)量與總黃酮含量間的相關(guān)性分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，該基因在苦蕎芽苗期的葉中表達(dá)量最高，其次是芽苗期的莖和根，而在6葉期植株的根、莖、葉和成年期植株的花、種子中表達(dá)量相對較低（圖6-A）。各組織部位中的4種C-黃酮-牡荊素、異牡荊素、葒草素和異葒草素相對含量分析結(jié)果顯示芽苗期植株的葉、莖和根含量相對最高，在其他時(shí)期的不同組織部位中含量較低（圖6-B）。FtUGT143在不同組織部位中的表達(dá)量與4種C-黃酮相對含量間的相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)tUGT143的表達(dá)量與牡荊素（R2=0.9614）、異牡荊素（R2=0.9649）、葒草素（R2=0.9714）和異葒草素（R2=0.9630）4種C-黃酮含量間顯著正相關(guān)（圖6-C），表明FtUGT143可能參與這4種C-黃酮的合成。

圖6 FtUGT143在苦蕎不同組織部位中的表達(dá)量與4種C-黃酮含量間的相關(guān)性Fig. 6 Correlation between the expressions of FtUGT143 in the different tissue sites of buckwheat and the content of four C-flavonoids

3 討論

苦蕎藥食同源，富含高生物活性的黃酮類化合物。黃酮糖苷化合物的生物合成主要由糖基轉(zhuǎn)移酶完成［20]。黃酮C-糖苷是苦蕎類黃酮生物合成途徑中的次級代謝產(chǎn)物，因此，研究苦蕎中C-糖基轉(zhuǎn)移酶基因，對于深入了解苦蕎中黃酮C-糖苷的生物合成機(jī)制具有重要意義。

3.1 FtUGT143是C-糖基轉(zhuǎn)移酶

本研究通過RT-PCR技術(shù)成功克隆到一個(gè)可能參與苦蕎中黃酮C-糖苷生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶基因FtUGT143，其編碼蛋白序列由224個(gè)氨基酸殘基組成，是一個(gè)穩(wěn)定的疏水蛋白。對FtUGT143的密碼子偏好模式進(jìn)行分析，ENC值為51.17，CAI值為0.1574。FtUGT143的GC與GC3s含量均小于50%。為后續(xù)FtUGT143蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測與定向突變功能鑒定提供了理論基礎(chǔ)。黃酮苷元主要包括芹菜素及其羥基或甲基化產(chǎn)物木犀草素、黃芩素等［5]，其被UGT作為底物催化其糖基化形成黃酮糖苷。例如，水稻［21]的OsUGT706D1和 OsUGT707A2 分別以芹菜素作為底物，在7-O和5-O位置催化形成黃酮糖苷。長春花［22]（Catharanthus roseus（L.）G.Don）的aUGT3以黃芩素作為底物在7-O位置催化形成龍膽糖苷。黃酮C-糖苷主要為牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷和異葒草苷，分別是芹菜素和木犀草素在C-6位或者C-8位在C-糖基轉(zhuǎn)移酶作用下連接一分子的葡萄糖形成的黃酮C-糖苷［23]。目前，C-糖基轉(zhuǎn)移酶在金蓮花［8]、葛根［9]、山葵［10]、甜蕎［12]等多種植物中被功能鑒定。研究表明糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族在C端有44個(gè)氨基酸所組成的高度保守PSPG box序列［24]。本研究通過對蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tUGT143具有相同的保守序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，F(xiàn)tUGT143與玉米、大豆、水稻、甜蕎的C-糖基轉(zhuǎn)移酶聚在一支，表明FtUGT143是糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族的C-糖基轉(zhuǎn)移酶成員，這暗示該基因可能具有直接催化黃酮化合物骨架的C位形成黃酮糖苷的功能。

3.2 FtUGT143可能參與苦蕎中黃酮C-糖苷生物合成

研究認(rèn)為當(dāng)?shù)鞍着c底物分子的自由結(jié)合能（ΔG）小于-29.288 kJ/mol有強(qiáng)烈的結(jié)合能力［6,25]。為了解苦蕎FtUGT143在C-黃酮生物合成中可能催化的底物及功能，本研究對FtUGT143蛋白進(jìn)行同源建模與分子對接模擬，結(jié)果顯示FtUGT143能與合成C-黃酮糖苷牡荊素、異牡荊素、葒草素和異葒草素的底物木犀草素（ΔG= -33.8904 kJ/mol）和芹菜素（ΔG=-32.2168 kJ/mol）相互作用，這與課題組前期在苦蕎與甜蕎的代謝組比對分析中的結(jié)論相同［3]，進(jìn)一步表明FtUGT143可能具有催化苦蕎中這4種C-黃酮生物合成的功能。通過Pymol分析后推測FtUGT143受體蛋白與芹菜素相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基為Thr21、Gln22、Arg84、His98、Trp101、Asn102、Glu106、Gln123，這些關(guān)鍵殘基位于配體與大分子結(jié)合的活性口袋中，為后續(xù)對FtUGT143的活性位點(diǎn)研究提供了參考價(jià)值。

熒光定量表達(dá)分析顯示，F(xiàn)tUGT143主要在苦蕎芽苗期的葉、莖和根中表達(dá)，與甜蕎中C-黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶同源基因FeCGTa和FeCGTb表達(dá)模式相似［12]。研究發(fā)現(xiàn)在甜蕎的體外酶活實(shí)驗(yàn)中以2-OH黃烷酮為底物催化生成黃酮C-糖苷［12]。進(jìn)一步分析顯示，F(xiàn)tUGT143在苦蕎不同組織部位中的表達(dá)量與4種C-黃酮牡荊素、異牡荊素、葒草素和異葒草素的含量顯著正相關(guān)。有關(guān)FtUGT143在苦蕎C-黃酮生物合成中的詳細(xì)功能還需進(jìn)一步地研究。

4 結(jié)論

苦蕎FtUGT143是糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族的一員，具有C-糖基轉(zhuǎn)移酶的特征，可能催化苦蕎中C-黃酮牡荊素、異牡荊素、葒草素和異葒草素的生物合成。