馮 冰 梁明明 鐘祖斌

白內(nèi)障是世界上最常見的致盲性眼病,主要是由于晶狀體混濁所致,其發(fā)病率與年齡密切相關(guān)[1]。盡管白內(nèi)障的病因和發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚,但目前發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)異常凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激損傷會誘發(fā)晶狀體功能障礙,使晶狀體混濁度升高,進(jìn)而誘發(fā)白內(nèi)障形成[2]。目前,白內(nèi)障的主要治療方法是手術(shù)摘出白內(nèi)障并植入人工晶狀體[3],手術(shù)治療可能產(chǎn)生一些后遺癥而影響患者生活質(zhì)量,因此,尋找能夠預(yù)防或延緩白內(nèi)障發(fā)生的藥物是降低白內(nèi)障發(fā)病率和防止失明的關(guān)鍵?；⒄溶帐且环N天然的白藜蘆醇苷,是從虎杖中提取的主要生物活性化合物,已證實(shí)其具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷滴眼液可抑制高滲應(yīng)激誘導(dǎo)的干眼癥大鼠結(jié)膜組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[5]。另外,有研究顯示轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smads(TGF-β/Smads)信號通路參與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展[6]。本研究使用亞硒酸鈉誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠模型,探討虎杖苷在白內(nèi)障大鼠LEC損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

50只6日齡SD新生大鼠,雌雄各半,與其母鼠由東南大學(xué)提供[動物許可證號:SYXK(蘇)2021-0022]。幼鼠體重(18±2)g,所有新生大鼠與其母鼠一起飼養(yǎng)在(23±2)℃,12h/12h明暗循環(huán)的動物房中,所有大鼠自由飲水喂食。本研究已獲得本院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

虎杖苷和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司;丙二醛(MDA)檢測試劑盒和總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;SRI-011381鹽酸鹽(hydrochloride)購自美國MCE公司;抗體轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、Smad2、Smad3、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)及其相關(guān)蛋白Bax、GAPDH和HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司;抗體α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.3 大鼠造模與分組

50只新生大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,隨機(jī)分為對照組、激活劑組、模型組、虎杖苷高劑量組、虎杖苷低劑量組,每組10只。除對照組外,其余各組大鼠通過皮下一次性注射25 μmol·kg-1亞硒酸鈉建立白內(nèi)障大鼠模型[7],第2天所有大鼠開始進(jìn)行雙眼生理鹽水滴眼或給藥。對照組和模型組大鼠使用生理鹽水滴眼,虎杖苷低、高劑量組大鼠分別采用1.3 g·L-1和5.0 g·L-1虎杖苷滴眼液滴眼[8],激活劑組大鼠除使用5.0 g·L-1虎杖苷滴眼液滴眼外還需灌胃10 mg·kg-1TGF-β/Smads信號通路的激活劑SRI-011381鹽酸鹽,其余各組大鼠灌胃生理鹽水。虎杖苷滴眼液滴眼每天3次,每次10 μL,SRI-011381鹽酸鹽給藥每天1次,連續(xù)14 d。大鼠最后一次給藥后禁食12 h,用5.0 g·L-1托吡卡胺和25.0 g·L-1鹽酸去氧腎上腺素散瞳,通過裂隙燈生物顯微鏡評判大鼠白內(nèi)障晶狀體混濁度,然后使用過量戊巴比妥鈉麻醉脫頸處死,摘除眼球分離晶狀體,從各組隨機(jī)取5只大鼠左眼晶狀體固定在40 g·L-1多聚甲醛中進(jìn)行HE染色觀察,其余晶狀體在顯微鏡下小心分離晶狀體囊膜組織并獲得LEC用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 晶狀體混濁度檢測

裂隙燈生物顯微鏡檢查各組大鼠晶狀體,晶狀體混濁度分為5級[9],其中,0級:透明正常晶狀體;1級:晶狀體輕微囊下混濁;2級:晶狀體囊下混濁并伴隨輕微核混濁;3級:晶狀體高度混濁且核區(qū)混濁加重;4級:晶狀體致密性混濁,白內(nèi)障形成。

1.5 HE染色觀察大鼠晶狀體病理變化

將固定在40 g·L-1多聚甲醛的5只大鼠左眼晶狀體使用石蠟包埋切片后行HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠晶狀體病理損傷情況。

1.6 各組大鼠LEC中SOD和MDA水平檢測

取各組5只大鼠左眼LEC快速研磨成勻漿,離心后,檢測上清液中SOD和MDA水平,使用硫代巴比妥酸(TBA)檢測試劑盒檢測MDA水平,使用水溶性四唑鹽(WST-1)法檢測SOD水平,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

各組取5只大鼠右眼LEC,過200目濾網(wǎng)得到單細(xì)胞懸液,隨后根據(jù)Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書檢測LEC凋亡情況。細(xì)胞經(jīng)100 μL Binding Buffer緩沖液重懸,然后加入5 μL Annexin V-FITC染液和PI染色室溫避光下孵育15 min,快速使用流式細(xì)胞儀檢測LEC凋亡情況。

1.8 Western blot檢測細(xì)胞TGF-β/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取各組剩余5只大鼠右眼LEC,加入裂解緩沖液充分裂解細(xì)胞提取總蛋白,使用二辛可酸(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白樣品加載到100 g·L-1SDS-PAGE凝膠電泳上分離蛋白,將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,使用50 g·L-1脫脂牛奶封閉2 h,依次加入抗體TGF-β、Smad2、Smad3、α-SMA、Bcl-2、Bax、GAPDH,4 ℃孵育過夜,然后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔二抗,室溫下孵育2 h,加入ECL顯影,GAPDH作為內(nèi)參蛋白,使用ImageJ軟件量化所得蛋白條帶。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白內(nèi)障大鼠晶狀體病理變化

HE染色結(jié)果顯示,對照組大鼠晶狀體前囊區(qū)域結(jié)構(gòu)清晰,LEC與晶狀體纖維細(xì)胞排列緊密。與對照組相比,模型組大鼠晶狀體前囊區(qū)域結(jié)構(gòu)紊亂,晶狀體纖維細(xì)胞變性、腫脹,LEC排列稀疏,晶狀體后囊附近發(fā)生空泡化。與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組明顯改善白內(nèi)障大鼠晶狀體結(jié)構(gòu)。與虎杖苷高劑量組相比,激活劑組加重了白內(nèi)障大鼠晶狀體結(jié)構(gòu)損傷(圖1)。大鼠晶狀體混濁度檢測結(jié)果顯示,對照組、模型組、虎杖苷低劑量組、虎杖苷高劑量組、激活劑組大鼠晶狀體混濁度分級分別為0級、(3.64±0.21)級、(2.43±0.18)級、(1.86±0.16)級、(2.75±0.22)級。5組間整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比,模型組大鼠晶狀體混濁度分級明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組大鼠晶狀體混濁度分級均明顯降低(均為P<0.05)。與虎杖苷高劑量組相比,激活劑組大鼠晶狀體混濁度分級明顯升高(P<0.05)。

2.2 虎杖苷對白內(nèi)障大鼠LEC中SOD和MDA水平的影響

對照組、模型組、虎杖苷低劑量組、虎杖苷高劑量組、激活劑組大鼠LEC中SOD水平分別為(73.26±3.29)U·mL-1、(40.29±2.65)U·mL-1、(48.62±2.73)U·mL-1、(61.93±3.11)U·mL-1、(52.45±2.86)U·mL-1,MDA水平分別為(1.68±0.21)μmol·L-1、(4.53±0.37)μmol·L-1、(3.75±0.32)μmol·L-1、(3.02±0.26)μmol·L-1、(3.64±0.35)μmol·L-1。5組大鼠LEC中SOD、MDA水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與對照組相比,模型組大鼠LEC中SOD水平明顯降低,MDA水平明顯升高(均為P<0.05)。與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組大鼠LEC中SOD水平均明顯升高,MDA水平均明顯降低(均為P<0.05)。與虎杖苷高劑量組相比,激活劑組大鼠LEC中SOD水平明顯降低,MDA水平明顯升高(均為P<0.05)。

2.3 虎杖苷對白內(nèi)障大鼠LEC凋亡的影響

對照組、模型組、虎杖苷低劑量組、虎杖苷高劑量組、激活劑組大鼠LEC凋亡率分別為(4.63±0.41)%、(27.95±1.26)%、(18.35±1.03)%、(11.76±0.74)%、(17.42±0.95)%。5組大鼠LEC凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比,模型組大鼠LEC凋亡率明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組大鼠LEC凋亡率均明顯降低(均為P<0.05)。與虎杖苷高劑量組相比,激活劑組大鼠LEC凋亡率明顯升高(P<0.05)(圖2)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組大鼠LEC凋亡情況

2.4 虎杖苷對白內(nèi)障大鼠LEC中TGF-β/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

5組大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與對照組相比,模型組大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)均明顯升高(均為P<0.05)。與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)均明顯降低(均為P<0.05)。與虎杖苷高劑量組相比,激活劑組大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)均明顯升高(均為P<0.05)(表1、圖3)。

表1 各組大鼠LEC中TGF-β/Smads信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量

表1 各組大鼠LEC中TGF-β/Smads信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量

組別蛋白相對表達(dá)量TGF-βSmad2Smad3對照組0.35±0.040.42±0.050.39±0.03模型組1.13±0.120.97±0.100.82±0.09虎杖苷低劑量組0.86±0.090.73±0.080.64±0.07虎杖苷高劑量組0.52±0.050.55±0.050.47±0.04激活劑組0.75±0.060.69±0.070.59±0.06F75.63740.60835.825P0.0000.0000.000

2.5 虎杖苷對白內(nèi)障大鼠LEC中α-SMA、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

5組大鼠LEC中α-SMA、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與對照組相比,模型組大鼠LEC中α-SMA、Bax蛋白表達(dá)均明顯升高,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(均為P<0.05)。與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組大鼠LEC中α-SMA、Bax蛋白表達(dá)均明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯升高(均為P<0.05)。與虎杖苷高劑量組相比,激活劑組大鼠LEC中α-SMA、Bax蛋白表達(dá)均明顯升高,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(均為P<0.05)(表2、圖4)。

圖3 各組大鼠LEC中TGF-β/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表2 各組大鼠LEC中α-SMA、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量

表2 各組大鼠LEC中α-SMA、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量

組別蛋白相對表達(dá)量α-SMABcl-2Bax對照組0.63±0.080.93±0.090.56±0.06模型組1.37±0.130.45±0.041.03±0.11虎杖苷低劑量組1.11±0.120.59±0.060.87±0.07虎杖苷高劑量組0.79±0.070.81±0.070.62±0.05激活劑組0.98±0.080.63±0.050.79±0.08F41.77643.14030.619P0.0000.0000.000

圖4 各組大鼠LEC中α-SMA、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

3 討論

LEC是圍繞著晶狀體的前囊和赤道部分的單層細(xì)胞,在維持整個(gè)晶狀體的透明度和內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用,并保護(hù)晶狀體處于透明狀態(tài)[10]。研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激發(fā)生在白內(nèi)障早期階段,LEC氧化應(yīng)激和異常凋亡在白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[11]。亞硒酸鹽誘導(dǎo)的動物白內(nèi)障反應(yīng)與人類白內(nèi)障反應(yīng)相似,已廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)模型中,以篩選和評估抗白內(nèi)障藥物的治療潛力[12]。本研究通過向大鼠皮下注射亞硒酸鈉誘導(dǎo)建立白內(nèi)障大鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠晶狀體前囊區(qū)域結(jié)構(gòu)紊亂,晶狀體纖維細(xì)胞變性、腫脹,LEC排列稀疏,晶狀體后囊區(qū)域附近發(fā)生空泡化,大鼠晶狀體混濁度分級增加,提示白內(nèi)障大鼠造模成功。與對照組相比,模型組大鼠LEC中MDA水平、細(xì)胞凋亡率以及促凋亡蛋白Bax表達(dá)的升高和SOD水平以及Bcl-2蛋白表達(dá)的降低,這一結(jié)果與汪雪梅[11]的研究結(jié)果基本一致,表明白內(nèi)障大鼠LEC發(fā)生氧化應(yīng)激及異常凋亡?；⒄溶盏闹委熀捅Ｗo(hù)作用主要來源于其抗炎、抗氧化和抗凋亡活性,其可通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥緩解淚腺切除誘導(dǎo)的干眼癥大鼠角膜和結(jié)膜組織損傷[5,13]。本研究通過向白內(nèi)障大鼠眼內(nèi)給藥虎杖苷發(fā)現(xiàn),虎杖苷可明顯減輕白內(nèi)障大鼠晶狀體結(jié)構(gòu)損傷,并減輕大鼠晶狀體混濁度,降低LEC中MDA水平、細(xì)胞凋亡率以及Bax蛋白表達(dá),升高LEC中SOD水平以及Bcl-2蛋白表達(dá),這一結(jié)果與Park等[5]研究結(jié)果基本一致,表明虎杖苷可通過抑制白內(nèi)障大鼠LEC氧化應(yīng)激和凋亡,緩解白內(nèi)障大鼠LEC損傷,對白內(nèi)障大鼠起到治療作用。

已有研究表明,TGF-β可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、分化和遷移來控制細(xì)胞的發(fā)育過程[14],且TGF-β可與Smad介質(zhì)相互作用,TGF-β/Smads信號通路由激活的TGF-β釋放啟動與TGF-β受體結(jié)合,之后激活其底物Smad2和Smad3蛋白,然后與共同介質(zhì)Smad4形成復(fù)合物后直接進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)一步參與多個(gè)基因靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄,這些基因靶標(biāo)負(fù)責(zé)產(chǎn)生α-SMA,而α-SMA是成熟肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志[15-16]。另外,TGF-β可通過調(diào)節(jié)Smads介導(dǎo)LEC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,并促進(jìn)晶狀體纖維化[17]。已有研究表明,TGF-β信號通路在先天性白內(nèi)障前囊中被激活,TGF-β/Smads信號通路的活化可誘導(dǎo)下游α-SMA激活,引起囊下白內(nèi)障[18]。Zhang等[6]研究表明,過表達(dá)MiR-34可通過激活TGF-β/Smads信號通路促進(jìn)白內(nèi)障大鼠LEC凋亡,加入TGF-β抑制劑后,觀察到LEC中Bax表達(dá)下降,Bcl-2蛋白表達(dá)升高,并且細(xì)胞凋亡率下降,提示TGF-β/Smads信號通路在白內(nèi)障發(fā)生過程中起重要作用。本研究結(jié)果表明,與對照組相比,模型組大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3、α-SMA蛋白表達(dá)明顯升高,虎杖苷明顯抑制了白內(nèi)障大鼠LEC中TGF-β、Smad2、Smad3、α-SMA蛋白表達(dá),與Hu等[8]研究結(jié)果基本一致,提示虎杖苷可緩解白內(nèi)障大鼠晶狀體損傷及LEC凋亡。本研究結(jié)果表明,TGF-β/Smads通路激活劑可逆轉(zhuǎn)虎杖苷對白內(nèi)障大鼠晶狀體混濁度及晶狀體損傷的保護(hù)作用,增加白內(nèi)障大鼠LEC凋亡及氧化損傷,證實(shí)了虎杖苷可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smads信號通路緩解白內(nèi)障大鼠LEC損傷。

4 結(jié)論

虎杖苷可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smads信號通路抑制白內(nèi)障大鼠LEC凋亡和氧化應(yīng)激,對白內(nèi)障大鼠LEC起保護(hù)作用,為虎杖苷作為白內(nèi)障治療藥物提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。