沈思思 蘭世捷 李丹 張蕾 張國華 王歡 楊昊天

摘 要：自2010年中國首次在規(guī)模養(yǎng)鴨場發(fā)生鴨坦布蘇病毒病以來，該病對養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。本研究對坦布蘇病毒的免疫反應、免疫逃避機制以及疫苗開發(fā)等內(nèi)容進行綜述，以期為后續(xù)研究坦布蘇病毒的發(fā)病機制和促進新型候選疫苗開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：坦布蘇病毒；免疫反應；疫苗

中圖分類號：S855.3 ? ? ? 文獻標識碼：A 文章編號：1673-1085（2023）08-0082-04

坦布蘇病毒（Tambusu virus，TMUV）是一種新興的傳染病病原，屬于黃病毒科黃病毒屬[1]，具有傳播迅速、宿主范圍廣泛、跨種間傳播等特點。TMUV主要感染禽類，自2010年我國首次發(fā)生坦布蘇病毒以來，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大損失。TMUV是目前已知唯一對鴨致病的黃病毒，可引起腦炎和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率高達90%，對雌性動物生殖系統(tǒng)造成損害，產(chǎn)蛋量下降，造成家禽業(yè)巨大經(jīng)濟損失。研究發(fā)現(xiàn)，TMUV能夠通過多種方式逃避宿主的免疫反應，針對這些免疫逃避機制，目前已有多種疫苗被開發(fā)出來，但需要進一步實驗和臨床應用驗證效果。綜上所述，TMUV的疫苗研究和應用是預防其傳播和保障家禽生產(chǎn)的最有效手段之一，應給予重視和加強。為此，本文對TMUV先天免疫反應、免疫逃避機制及疫苗進行了綜述，為后續(xù)研究坦布蘇病毒的發(fā)病機制和促進新型候選疫苗開發(fā)提供參考。

1 ?先天免疫反應

宿主對禽坦布蘇病毒感染的先天免疫防御機制已被廣泛研究。鴨免疫相關(guān)基因和坦布蘇病毒感染在鴨體內(nèi)的分布已通過熒光定量PCR系統(tǒng)檢測，結(jié)果表明坦布蘇病毒能在許多組織中快速復制，并在感染早期激活宿主免疫反應。坦布蘇病毒刺激外周單核細胞（PBMCs）后，干擾素（IFNs）和白介素（ILs）的相對轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。在感染鵝的模型中，免疫組化分析表明，坦布蘇病毒的抗原分布和CD8+T細胞的位置一致，與病毒中IFNγ和促炎細胞因子的大量產(chǎn)生有關(guān)，宿主對入侵的坦布蘇病毒病原體有強烈的免疫反應[2]。然而，對上調(diào)的細胞因子與坦布蘇病毒之間的相互作用仍未完全了解。坦布蘇病毒主要依賴Toll樣受體3（TLR3）的通路表達，誘導雞胚成纖維細胞和人293T細胞中IFN和干擾素刺激基因（ISGs）的mRNA水平[3]。然而，這些結(jié)果的驗證是在人的293T細胞中進行的，而不是在家禽細胞中進行的。雖然禽坦布蘇病毒可在哺乳動物細胞中增殖并可能對人類構(gòu)成潛在健康風險，但禽坦布蘇病毒僅對家禽具有高致病性，尤其是鴨和鵝。

采用流動高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法分析發(fā)現(xiàn)，在坦布蘇病毒感染和模擬感染的鴨卵泡中發(fā)現(xiàn)131種表達蛋白差異，其中53種上調(diào)、78種下調(diào)。大量蛋白質(zhì)參與免疫反應、抗原加工和遞呈；通過Western blot分析驗證，這些蛋白質(zhì)中經(jīng)坦布蘇病毒感染的IFN能誘導四肽重復序列（IFIT5）和2’-5’寡腺苷酸合酶樣蛋白（OASL）水平上調(diào)[4]。IFIT5部分定位于線粒體，并與視黃酸誘導基因蛋白I（RIG-I）和線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）相互作用，是天然抗病毒免疫應答的重要增強劑。OAS家族屬于核苷酸基轉(zhuǎn)移酶家族，是干擾素誘導的細胞蛋白家族。OAS家族蛋白通過核糖核酸酶L（RNase L）依賴和RIG依賴（RNase L非依賴）信號通路對各種病毒表現(xiàn)出抗病毒作用。坦布蘇病毒刺激外周單核細胞可顯著提高體外鵝OASL基因的轉(zhuǎn)錄水平。小鼠OAS1b和雞OASA在小鼠細胞中顯示出對抗西尼羅病毒（WNV）的抗病毒活性。HCV NS5A（aa 1～148）的N-末端部分與人OAS1和小鼠OAS1發(fā)生物理作用，并不依賴于IFN敏感性決定區(qū)（ISDR）的方式抑制干擾素（IFN）的抗病毒活性。然而，目前尚不清楚家禽泛素樣2’-5’寡聚腺苷酸合成酶（OASL）是否能抑制TMUV的復制，OASL和TMUV NS蛋白之間的相互作用有待進一步驗證[5]。綜上所述，IFN誘導蛋白（如IFIT5和OASL）在家禽抗TMUV反應中發(fā)揮了重要作用。然而，科學家們?nèi)匀粚λ拗骺固共继K病毒免疫反應缺乏清楚的了解，其抗病毒機制還需要進一步研究。

2 ?免疫逃避

Wang等研究表明，已經(jīng)證實了IFN-a a/D對哺乳動物細胞（BHK-21細胞）中病毒復制的抗病毒作用，但DF-1細胞中的干擾素不影響TMUV的產(chǎn)生。西尼羅病毒的E蛋白阻礙受體相互作用蛋白1（RIP-1）的泛素化，從而抑制RIG-I介導和TLR3依賴的抗病毒途徑。登革熱病毒的NS2A、NS4A和NS4B蛋白減少信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子的磷酸化和核易位，最終抑制IFN信號[6]。然而，關(guān)于NS1在干擾先天性免疫應答中作用的報道目前還很少。雖然NS1被認為是病毒RNA復制的輔助因子，但西尼羅病毒的感染也增強了TLR3的表達；并且西尼羅病毒NS1抑制TLR3信號傳導，而幾種蚊媒傳播的黃病毒NS1蛋白卻不能?；蛟囼灪Y選鴨TMUV編碼的結(jié)構(gòu)（即C和E）和非結(jié)構(gòu)（即NS1、NS2A、NS2B、NS3和NS5）蛋白質(zhì)和免疫逃避有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)TMUV NS1通過抑制RIG-i樣受體信號，可以抑制IFN-b的表達[7]。

3 ?疫苗

該病毒自2010年在我國主要蛋鴨養(yǎng)殖區(qū)陸續(xù)發(fā)生之后，對家禽業(yè)影響巨大，因此迫切需要研發(fā)安全有效的疫苗來預防和控制該病的發(fā)生和流行。自此，不同的研究團隊開始進行相關(guān)疫苗研發(fā)。

3.1 ?滅活疫苗

段會娟[8]利用鴨坦布蘇病毒HB株滅活苗對北京鴨進行3次免疫，發(fā)現(xiàn)在二次免疫后7 d內(nèi)均可檢測到血清抗體，并持續(xù)至60 d血清抗體還可達到80%。其中皮下注射可持續(xù)60 d，而肌肉注射可延長免疫期達100 d，對群體的保護效果更好。段平有[9]為了進一步了解HB株在生產(chǎn)中的作用，對該疫苗進行了臨床安全和效力評價，所有雛鴨和種鴨2倍劑量免疫后21 d內(nèi)未見異常，精神狀況良好，無不良反應；通過ELISA抗體檢測發(fā)現(xiàn)，免疫后14 d開始轉(zhuǎn)陽，至135 d陽性率高于90%，攻毒保護率高于80%。

3.2 ?弱毒活疫苗

Li等[10]將鴨坦布蘇病毒分離株FX2010在雞胚成纖維細胞中連續(xù)傳代，開發(fā)了一種針對鴨坦布蘇病毒的弱毒活疫苗（FX2010-180P）。FX2010-180P在5.5lgTCID50的感染劑量下不會引起鴨的臨床癥狀和病理變化，并且在3.5lgTCID50感染劑量下即可引起良好的免疫應答。He等[11]從麻雀中分離的坦布蘇強毒株在無特定病原體（SPF）鴨胚中連續(xù)傳代至70代后接種雛鴨，得到弱毒活疫苗SDS-70，對強毒株的感染起到良好的保護力，但需要二次免疫接種來維持抗體水平。由于弱毒活疫苗有潛在的免疫應激和毒力返祖可能，保存條件也較為苛刻，故坦布蘇病毒的弱毒活疫苗還未廣泛普及和應用。

3.3 ?DNA疫苗

鴨坦布蘇病毒DNA疫苗制備是將坦布蘇病毒包膜蛋白E引入宿主中，從而誘導免疫反應。Tang等[12]將優(yōu)化表達的包膜蛋白E的開放閱讀框克隆至賽姆利基森林病毒復制子的載體pSCA1中，研制出了pSCA1-E自殺性DNA疫苗。初免后所有接種pSCA1-E雛鴨中檢測到了包膜蛋白E特異性抗體，二免后抗體水平迅速上升，并在4周后達到峰值。pSCA1-E可以引起較強的細胞免疫應答并且IFN-γ和IL-4細胞因子水平明顯上升。

4 ?討論與小結(jié)

TMUV是一種新型禽致病性黃病毒，對全球養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。雖然TMUV尚未被確認為人類或其他哺乳動物的病原體，但TMUV在哺乳動物細胞中復制良好，小鼠腦內(nèi)接種TMUV，表現(xiàn)出許多TMUV的典型臨床病變。因此，這種病毒有可能成為人畜共患病的病原體。盡管科研人員研究了鴨坦布蘇病毒的組織分布特征，以及日齡和接種途徑對鴨感染的影響，但是TMUV病原體和禽類宿主之間的發(fā)病機制、分子病原學和相互作用仍不十分清楚?；诜聪蜻z傳學系統(tǒng)已經(jīng)構(gòu)建了鴨TMUV的感染性全長cDNA，這將會成為進一步研究鴨TMUV發(fā)病機制和促進新型候選疫苗開發(fā)的有效平臺。

參考文獻：

[1] Platt， G， S， et al. Arbovirus infections in Sarawak， October 1968—February 1970 Tembusu and Sindbis virus isolations from mosquitoes[J]. Annals of Tropical Medicine & Parasitology， 1975， 69（1）：65-71.

[2] Ning L ， Chuanwei L ， Ruichao Y ， et al. Effect of age on the pathogenesis of duck tembusu virus in Cherry Valley ducks[J]. Frontiers in Microbiology， 2015， 6：425.

[3] Kaikai H ， Dongmin Z ， Yuzhuo L ， et al. Quantitative Proteomic Analysis of Duck Ovarian Follicles Infected with Duck Tembusu Virus by Label-Free LC-MS[J]. Frontiers in Microbiology， 2016， 7：425.

[4] Bianhong， Zhang， Xinyi， et al. IFIT5 potentiates anti-viral response through enhancing innate immune signaling pathways.[J]. Acta biochimica et biophysica Sinica， 2013，45：867-874.

[5] Arjona A ， Ledizet M ， Anthony K ， et al. West Nile virus envelope protein inhibits dsRNA-induced innate immune responses.[J]. Journal of Immunology， 2007， 179（12）：8403-8409.

[6] Jianying， Liu， Yang， et al. Flavivirus NS1 protein in infected host sera enhances viral acquisition by mosquitoes.[J]. Nature microbiology， 2016， 1（9）：16087-16087.

[7] Crook K R ， Miller-Kittrell M ， Morrison C R ， et al. Modulation of innate immune signaling by the secreted form of the West Nile virus NS1 glycoprotein[J]. Virology， 2014， 458-459：172-182.

[8] ?段會娟，林健，楊志遠，等.鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）免疫產(chǎn)生期和持續(xù)期的試驗[J].中國獸醫(yī)雜志， 2017， 53（06）：106-108.

[9] ?何平有，郁宏偉，吳雅清，等.鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）安全和效力的臨床評價[J].中國動物保健， 2018， 20（01）：48-51.

[10]Li G，Gao X，Xiao Y， et al.Development of a live attenuated vaccine candidate against duck Tpmbusu viral disease[J].Virology， 2014， 450-451：233-242.

[11]He D L，Zhang X，Chen L， et al.Development of an attenuated live vaccine candidate of Duck Tembusu virus strain[J].Veterinary Microbiology，2019，231：218-225.

[12]Tang J Y，Bi Z L，Ding M Y， et al.Immunization with a suicidal DNA vaccine expressing the E glycoprotein protects ducklings against duck Tembusu virus[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，2019，218：109953.

Progress of research immune response of Tembusu virus

SHEN Sisi， LAN Shijie，LI Dan，ZHANG Lei，ZHANG Guohua，WANG Huan，YANG Haotian

（Branch of Animal Husbandry and Veterinary，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，

Qiqihaer ?161000，Heilongjiang ，China）

Abstract： Since the first outbreak of duck Tambusu virus disease in large-scale duck farms in China in 2010， the disease has caused huge economic losses to the aquaculture industry. In this study， the immune response， immune escape mechanism and vaccine development of Tambusu virus were reviewed， with a view to providing reference for subsequent research on the pathogenesis of Tambusu virus and promoting the development of novel candidate vaccines.

Keywords： Tambusu virus; Immune response; Vaccine