閆拯 劉皓秋 劉曉燕 徐海泓 劉彥暉 李常青 王伯劉學(xué)鋒 崔勝楠 賈婷 楊嫡 張成林* 劉定震*

（1 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875）（2 北京動(dòng)物園管理處，北京 100044）（3 圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044）

大多數(shù)脊椎動(dòng)物糞便中包含類固醇激素的主要代謝形式，如皮質(zhì)醇 (Cortisol)、睪酮 (Testoster‐one, T)、雌二醇 (Estradiol, E2) 和孕酮 (Progester‐one, P) 等 (M?hleet al., 2002; Highamet al., 2012)。糞便樣本作為動(dòng)物的排遺物，易于采集且采集過(guò)程中無(wú)須接觸動(dòng)物，不會(huì)使動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)(Liuet al., 2006; Zhouet al., 2020)。通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物糞便中的類固醇代謝物，可以監(jiān)測(cè)生活在野生和圈養(yǎng)環(huán)境下動(dòng)物的繁殖和應(yīng)激生理狀態(tài) (Nieet al., 2012; Gholibet al., 2018)。目前，該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中華小熊貓 (Ailurus fulgens styani)(Weiet al., 2005；李春等，2005a，2005b)、大熊貓 (Ailuropoda melanoleuca) (Liuet al., 2006; Pow‐ellet al., 2006; Aitken-Palmeret al., 2012；王子葉等，2021)、黑冠獼猴 (Macaca nigra) (Gholibet al., 2018) 和亞洲象 (Elephas maximus) (Tanget al.,2020) 等的發(fā)情、福利和健康狀態(tài)監(jiān)測(cè)，對(duì)其種群復(fù)壯和圈養(yǎng)珍稀瀕危動(dòng)物繁育和飼養(yǎng)管理發(fā)揮了不可或缺的作用。

利用不同糞便處理方法和激素萃取方法，會(huì)使糞便激素檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生差異。針對(duì)大熊貓糞便的準(zhǔn)備和處理方法，主要分為冷凍干燥-粉碎法和冷凍干燥-研篩法。兩種方法的區(qū)別在于研篩法將凍干后糞便放入網(wǎng)篩中，研磨糞便收集過(guò)篩糞樣，處理糞便耗時(shí)較長(zhǎng)；粉碎法是將干糞利用小型粉碎機(jī)粉碎后收集粉末樣本，處理糞便快速便捷 (崔媛媛等，2009; Kerseyet al., 2010a; Denget al.,2014a, 2014b；畢溫磊等，2014; Zhouet al., 2020)。糞便激素的萃取常用3種萃取劑，分別為80%甲醇溶液 (Palmeet al., 2013; Gholibet al., 2018)、90%乙醇溶液 (崔媛媛等，2009; Kerseyet al., 2010b;Denget al., 2014a, 2014b) 和95%乙醇溶液 (Tanget al., 2020)。以竹子為主要食物的大熊貓，其糞便樣本中富含纖維成分，尤其是采食竹莖期間糞便中充滿未消化的竹子 (Yanet al., 2021)，糞便處理耗時(shí)較長(zhǎng)且激素萃取效率較低。糞便激素檢測(cè)常用方法為放射免疫分析法 (Radio immunoassay,RIA) 和酶聯(lián)免疫檢測(cè)法 (Enzyme-Linked Immuno‐sorbent Assay, ELISA) (畢溫磊等，2014; Zhouet al., 2020)。兩種方法雖然都很靈敏，但如何利用大熊貓的新鮮糞便樣本萃取激素最大檢出量，達(dá)到試劑盒靈敏度要求是激素檢測(cè)準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵(畢溫磊等，2016)。

本研究針對(duì)北京動(dòng)物園10 只圈養(yǎng)大熊貓 (雌∶雄 = 1∶1) 的糞便樣本，分別采用冷凍干燥-研篩法和冷凍干燥-粉碎法進(jìn)行篩選和粉碎，然后分別使用80%甲醇、90%乙醇和95%乙醇溶液萃取，根據(jù)不同糞便處理和激素萃取方法所獲得的糞便樣本中皮質(zhì)醇、雌二醇、孕酮和睪酮的濃度高低，對(duì)2種大熊貓糞便前處理方法及激素萃取方法進(jìn)行了比較分析。研究結(jié)果為用于激素檢測(cè)的糞便樣本前處理提供參考，同時(shí)也將為進(jìn)一步研究大熊貓生殖繁育規(guī)律和圈養(yǎng)管理提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 研究方法

1.1 研究對(duì)象及樣本采集

研究對(duì)象為北京動(dòng)物園飼養(yǎng)的10 只圈養(yǎng)大熊貓 (雌∶雄 = 1∶1，表1)。2022 年4 月4 日，在每只大熊貓排泄糞便后30 min 內(nèi)，收集新鮮糞便樣本，不添加任何試劑，直接放入一次性封口袋，標(biāo)記采樣時(shí)間和個(gè)體信息后存放于冰盒，然后送往北京師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。采樣期間大熊貓主食苦竹 (Pleioblastus amarus) 竹莖，糞便成標(biāo)準(zhǔn)團(tuán)狀。為增強(qiáng)凍干效果，減少糞便凍干所需時(shí)間，將糞團(tuán)在封口袋內(nèi)捏碎，然后放入-20 ℃冰箱保存。研究期間10 只大熊貓健康狀態(tài)良好，采樣前3 個(gè)月內(nèi)無(wú)任何藥品攝入。

表1 大熊貓基本信息表Table 1 Basic information of giant panda

1.2 糞便樣本處理

在對(duì)糞便樣本進(jìn)行凍干處理前，先將其從-20 ℃冰箱轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中過(guò)夜，使樣本內(nèi)水分充分凝固。然后使用真空冷凍干燥機(jī) (LGJ-10N，亞星儀科，中國(guó)西安) 在-60 ℃下凍干72 h。將每個(gè)凍干后的樣本平均分為2 份，分別進(jìn)行60 目(0.25 mm) 過(guò)篩研磨處理和粉碎機(jī) (FSJ-A03E1，思瑤電器科技，中國(guó)佛山) 粉碎處理，粉碎機(jī)轉(zhuǎn)速為23 000 r/min。從每一個(gè)處理后的糞便樣本中稱取4 g 粉末，等分為0.20 g 的20 份小樣本 (精確到0.01 g) 用于后續(xù)的激素萃取和濃度檢測(cè)。

1.3 糞便激素萃取

針對(duì)以上2種粉碎方法處理后的糞便樣本，采用相同的激素萃取實(shí)驗(yàn)流程。即將來(lái)自5只雄性大熊貓的糞便樣本混合后用于睪酮檢測(cè)，以消除樣本間的個(gè)體差異，每份樣本稱取0.12 g，共0.6 g，混勻后平均分為3 份；將來(lái)自5 只雌性大熊貓的糞便樣本混合后用于雌二醇、孕酮檢測(cè)，每份樣本稱取0.12 g，共0.6 g，混勻后平均分為3 份；將來(lái)自10 只大熊貓的糞便樣本用于皮質(zhì)醇測(cè)定，每份樣本稱取0.06 g，共0.6 g，混勻后平均分為3 份。然后，對(duì)每組測(cè)定同種激素的3 份樣本，分別加入80%甲醇、90%乙醇和95%乙醇溶液各10 mL，渦旋振蕩20 min，之后使用冷凍高速離心機(jī) (5810R，Eppendorf，德國(guó)漢堡) 在-4 ℃下1 500 r/min離心20 min，取上清液，最后放入冷凍離心濃縮儀 (CV600，吉艾姆科技有限公司，中國(guó)北京) 中6 h吹干。

1.4 糞便激素檢測(cè)

將吹干后的18 份樣本分別加入500 μL 的氯化鈉溶液 (0.9%) 復(fù)溶，用于后續(xù)的放射免疫分析法(RIA) 激素測(cè)定。其中，雌二醇檢測(cè)使用100 μL復(fù)溶后樣本，睪酮、皮質(zhì)醇和孕酮檢測(cè)各使用50 μL樣本。使用碘 [125I] 皮質(zhì)醇放射免疫分析藥盒 (靈敏度 ≈ 2 pg/mL)、125I 睪酮放射免疫分析藥盒 (靈敏度 = 0.02 ng/mL)、125I 雌二醇放射免疫分析藥盒(靈敏度 ≤ 2 pg/mL) 和125I 孕酮放射免疫分析藥盒(靈敏度 ＜ 2 pg/mL) (4 種試劑盒精密度均為：批內(nèi)變異系數(shù) (Coefficient of Variation, CV) ＜ 10%，批間CV ＜ 15%) (北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，中國(guó)北京) 和XH6080放免儀 (西安核儀器廠，中國(guó)西安) 測(cè)定樣本中皮質(zhì)醇、睪酮、雌二醇和孕酮的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

針對(duì)不同前期處理方式所測(cè)得的糞便激素水平數(shù)據(jù)，首先使用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)其是否滿足正態(tài)分布。檢驗(yàn)結(jié)果顯示，雌二醇和孕酮數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，使用配對(duì)樣本t檢驗(yàn) (Pairedt-test) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。皮質(zhì)醇和睪酮數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，使用Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn) (Wilcoxon signed rank ex‐act test) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。針對(duì)不同萃取方法處理的糞便樣本的激素水平數(shù)據(jù)，也使用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)其是否滿足正態(tài)分布。當(dāng)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布時(shí)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，否則使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。

使用R 4.2.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并借助gg‐pubr、cowplot 和ggplot2 程序包繪制箱圖與折線圖。顯著性水平α = 0.05，極顯著性水平α = 0.01。

2 結(jié)果

2.1 不同糞便處理方式的比較

使用冷凍干燥-研篩法和冷凍干燥-粉碎法分別處理糞便樣本后，萃取得到的大熊貓糞便激素濃度產(chǎn)生差異。其中，雌二醇激素含量分別為(13.03 ± 7.91) pg/mL 和 (10.72 ± 5.55) pg/mL，孕酮分別為 (0.054 ± 0.046) ng/mL 和 (0.015 ±0.007) ng/mL，皮質(zhì)醇分別為 (46.36 ± 23.12) ng/mL和 (46.18 ± 16.01) ng/mL，睪酮分別為 (3.57 ±0.94) ng/mL 和 (3.84 ± 2.21) ng/mL。冷凍干燥-研篩法處理后的樣本中檢測(cè)到的雌二醇 (t=2.760,df= 8,P= 0.025) 和孕酮 (t=3.010,df= 8,P=0.017) 含量顯著較冷凍干燥-粉碎法處理的高，但皮質(zhì)醇 (V= 24,P= 0.910) 和睪酮 (V= 21,P= 0.910)的含量在2種處理方法間無(wú)顯著性差異 (圖1)。

圖1 不同糞便處理方式激素含量比較. ns表示無(wú)顯著性差異，* P ＜ 0.05Fig. 1 Comparison of hormone contents among different fecal treatment methods. ns means no significant, *P ＜ 0.05

2.2 不同激素萃取方式的比較

對(duì)3種萃取方法所獲得的樣本中激素的測(cè)定結(jié)果顯示，使用80%甲醇萃取的樣本，4種激素的總體含量較高、效果較好。其中，雌二醇的檢測(cè)值均極顯著高于使用90%乙醇和95%乙醇萃取的樣本中的含量 (t= 3.960,df= 7.58,P= 0.005 和Z=-2.887,P= 0.005)，而且，用90%乙醇萃取的樣本檢測(cè)值也極顯著高于用95%乙醇萃取的樣本檢測(cè)值 (Z= -2.887,P= 0.005)。使用80%甲醇與90%乙醇萃取的樣本間孕酮檢測(cè)值無(wú)顯著性差異，但均顯著高于用95%乙醇萃取的樣本檢測(cè)值 (t=3.110,df= 5.03,P= 0.026、t= 2.898,df= 5.14,P= 0.030)。使用80%甲醇與90%乙醇萃取的樣本皮質(zhì)醇檢測(cè)值間無(wú)顯著性差異，但均顯著高于用95% 乙醇萃取的樣本檢測(cè)值 (Z= -2.882,P=0.002、Z= -2.882,P= 0.002)。使用80%甲醇與90%乙醇萃取的樣本間睪酮檢測(cè)值無(wú)顯著性差異，但均顯著高于用95%乙醇萃取的樣本檢測(cè)值 (Z=-2.882,P= 0.002、Z= -2.882,P= 0.002) (圖2)。因此，在萃取大熊貓糞便中的雌二醇時(shí)，宜選用80%甲醇進(jìn)行萃取。對(duì)糞便中的孕酮、皮質(zhì)醇和睪酮，宜選用80%甲醇或90%乙醇萃取。

圖2 不同糞便處理方式激素含量比較. ns表示無(wú)顯著性差異. * P ＜ 0.05，** P ＜ 0.01Fig. 2 Comparison of hormone contents among different fecal treatment methods. ns means no significant, *P ＜ 0.05, ** P ＜ 0.01

2.3 處理方法與萃取方式同步比較

糞便處理的2 種方法以及3 種萃取方式獲得的樣本中激素含量不一致，而且在4種激素間的變化趨勢(shì)也不同 (圖1，2)。因此，綜合考慮2種處理方法和3種萃取方式，得到每一種糞便激素的最優(yōu)處理方法及萃取方式。每種激素的最優(yōu)處理和萃取方法為：使用冷凍干燥-研篩法處理糞便后，使用80%甲醇萃取，得到雌二醇和孕酮含量分別為(21.29 ± 1.32) pg/mL 和 (0.11 ± 0.01) ng/mL；使用冷凍干燥-粉碎法處理糞便后，使用80%甲醇萃取，得到睪酮含量為 (6.49 ± 0.83) ng/mL。對(duì)于皮質(zhì)醇，使用冷凍干燥-研篩法結(jié)合80%甲醇萃取、冷凍干燥-粉碎法結(jié)合90%乙醇萃取得到的檢測(cè)值更高，分別為 (66.24 ± 0.81) ng/mL 和 (65.74 ±3.16) ng/mL， 且差異不顯著 (t= 0.268,P=0.802) (圖3)。

圖3 糞便處理和激素萃取方法結(jié)果比較. 數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤Fig. 3 Comparison of results of fecal treatment method and hormone extraction method. Data are mean ± SE

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，大熊貓糞便中激素的檢測(cè)值隨糞便樣本的前處理和萃取方法不同而有差異。雌二醇和孕酮檢測(cè)量在使用冷凍干燥-研篩法、冷凍干燥-粉碎法2 種糞便處理方法間產(chǎn)生了顯著性差異。該結(jié)果與李靜宇等 (2021) 對(duì)以高纖維食物為主的野生藏酋猴 (Macaca thibetana) 糞便中上述2種激素的研究結(jié)果一致，均為使用冷凍干燥-研篩法處理的樣品中激素含量較高。這可能與雌二醇和孕酮在大熊貓和藏酋猴糞便中的含量較低有關(guān)。研篩法能夠去除糞便中低激素含量的竹子或植物纖維的影響，從而提高檢測(cè)值。有研究顯示，大熊貓糞團(tuán)表層激素含量顯著高于內(nèi)部 (于小杰等，2010)，可能與糞團(tuán)各部位的纖維含量不同相關(guān)。此外，在工作效率上，使用冷凍干燥-研篩法處理每個(gè)糞便約可獲得1.5 g 樣本，需處理10 ～30 min；而冷凍干燥-粉碎法可獲得2.7 g樣本，需處理2 ～ 5 min。顯然，粉碎法處理樣本具有簡(jiǎn)便快捷的優(yōu)勢(shì)。因此，應(yīng)根據(jù)擬檢測(cè)的激素種類和樣本數(shù)量選擇合適的糞便處理方法，從而達(dá)到準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)結(jié)果。

使用不同溶劑萃取相同的大熊貓糞便樣品，得到的激素檢測(cè)值存在顯著性差異。當(dāng)使用80%甲醇溶液萃取時(shí)，得到的雌二醇和孕酮的檢測(cè)值均最高，皮質(zhì)醇和睪酮的檢測(cè)值則隨糞便處理方法不同具有一定差異。甲醇和乙醇均是激素萃取實(shí)驗(yàn)中常用有機(jī)溶劑 (Kanseet al., 2014)，在其他物種的應(yīng)用效果也具有差異。如針對(duì)同為植食性的非洲草原象 (Loxodonta africana)，對(duì)其糞便中孕激素的檢測(cè)結(jié)果顯示，80%甲醇作為萃取溶劑得到的激素含量顯著高于用乙醇萃取的結(jié)果 (Free‐manet al., 2010)；對(duì)牛 (Bovini)、羊 (Caprinae) 和馬 (Equus caballus) 等草食性動(dòng)物的糞便激素使用不同溶劑萃取，結(jié)果也表明80%甲醇作為溶劑是激素萃取的最佳方法 (Palmeet al., 2013)。

綜上所述，針對(duì)大熊貓糞便中雌二醇和孕酮的檢測(cè)，建議前處理選用冷凍干燥-研篩法結(jié)合80%甲醇萃取。針對(duì)糞便中皮質(zhì)醇的檢測(cè)，使用冷凍干燥-粉碎法結(jié)合90%乙醇萃取。對(duì)糞便中睪酮的檢測(cè)，建議使用冷凍干燥-粉碎法結(jié)合80%甲醇萃取。本研究的結(jié)果及其應(yīng)用，不僅有助于收集糞便激素的有效數(shù)據(jù)，還可以加強(qiáng)對(duì)野生動(dòng)物生理狀況的監(jiān)測(cè)，推動(dòng)生物多樣的保護(hù)工作。