趙碩,張慶雪,李靖若

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外科,河南 鄭州 450000)

乳腺癌是常見的癌癥,約占女性癌癥的30%[1]。乳腺癌具有異質(zhì)性,根據(jù)激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)和Ki-67的狀態(tài)可以分為4種亞型,不同分型乳腺癌的治療方案不同,遵循個(gè)體化治療原則[2]。隨著乳腺癌綜合治療的完善,乳腺癌患者的生存率已經(jīng)逐年提高。但是仍有部分患者對(duì)化療、免疫治療存在耐藥且部分年輕患者出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移[3]。因此,挖掘新型生物標(biāo)志物對(duì)乳腺癌早期診斷、靶向治療及預(yù)后評(píng)估有著重要的臨床意義。

層粘連蛋白亞基γ2(laminin subunit γ2,LAMC2)基因編碼層粘連蛋白(laminin,LM)γ2鏈,位于人類染色體1q25-q31上,是LM-332蛋白的重要組成成分。LM-332參與組成基底膜,對(duì)細(xì)胞分化和運(yùn)動(dòng)、維持組織表型和促進(jìn)組織存活起重要作用[4]。已有研究表明LAMC2在肺腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌和肝癌等腫瘤中表達(dá)異常[5-8]。Henning等[9]發(fā)現(xiàn)LAMC2在良性乳腺上皮基底膜中連續(xù)性表達(dá),在浸潤(rùn)性乳腺癌中表達(dá)缺失。本文將通過生物信息學(xué)分析進(jìn)一步挖掘LAMC2在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義,為研究LAMC2基因在乳腺癌發(fā)生中的作用機(jī)制及潛在價(jià)值提供線索。

1 資料與方法

1.1 GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)

GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia2.cancer-pku.cn/)是對(duì)來(lái)源于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中的腫瘤和正常樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行在線分析及可視化的工具。本研究利用GEPIA2工具中 “Expression DIY”的“Box Plot”功能,探索目標(biāo)基因LAMC2在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達(dá)差異,設(shè)置條件:|Log2FC|cut off選擇“1”,P-value cut off為“0.01”,Log Scale為“Yes”,正常樣本選擇TCGA以及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)。利用GEPIA2工具中“Expression DIY”的“Correlation Analysis”功能,探索LAMC2和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD133之間的關(guān)系,設(shè)置條件:Correlation Coefficient為“Pearson”,TCGA Tumor為“BRCA Tumor”。

1.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu)用來(lái)補(bǔ)充驗(yàn)證LAMC2在乳腺癌中不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、不同分期、不同分子分型中的表達(dá)差異,并探究LAMC2表達(dá)與基因甲基化水平的關(guān)系。設(shè)置篩選條件:(1)Enter gene symbol為“LAMC2”;(2)TCGA dataset為“Breast invasive carcinoma”;(3)Links for analysis為“Expression/Methylation”;(4)based on為“Sample types/Individual cancer stages/Major subclasses/Nodal Metastasis status”。

1.3 HPA數(shù)據(jù)庫(kù)

HPA數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址為https://www.proteinatlas.org。通過深度測(cè)序轉(zhuǎn)錄和免疫組織化學(xué),提供了包含32個(gè)組織和47個(gè)細(xì)胞系的RNA和蛋白質(zhì)水平的基因表達(dá)數(shù)據(jù),提供了蛋白質(zhì)在每個(gè)組織和器官的亞細(xì)胞中的定位。本研究在HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入目的蛋白LAMC2,在“Tissue”“Pathology”和“Subcell”3個(gè)模塊處分別獲取LAMC2蛋白在正常乳腺組織、乳腺癌組織中的免疫組織化學(xué)圖片及亞細(xì)胞定位。

1.4 TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)

TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://timer.cistrome.org)提供對(duì)腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的全面分析和可視化功能。本研究用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中的“Gene”和“Mutation”模塊,探索LAMC2基因的表達(dá)及突變狀態(tài)和乳腺癌腫瘤微環(huán)境中的6種免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)浸潤(rùn)的關(guān)系。

1.5 KM Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)

KM Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(https://kmplot.com/analysis/)是一種可以分析基因與癌癥患者預(yù)后關(guān)系的在線分析工具,其數(shù)據(jù)來(lái)源于GEO、EGA和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)。本研究首先選擇mRNA gene chip中的“Start KM Plotter for breast cancer”,設(shè)置條件:Affymetrix ID為“LAMC2(202267_at)”,Survival為“OS”,選擇“Auto select best cut off”為最佳截?cái)嘀?根據(jù)目標(biāo)表達(dá)量將乳腺癌患者分為高低表達(dá)兩組,分別選擇不同的臨床病理參數(shù)(分子分型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)狀態(tài)),對(duì)其進(jìn)行總生存期分析。其次選擇“mRNA RNA-seq”中的“Start KM Plotter for pan-cancer”,設(shè)置條件:Gene symbol為“LAMC2”,選擇“Breast cancer”,選擇不同的免疫細(xì)胞狀態(tài)對(duì)其進(jìn)行總生存期分析。獲得生存曲線風(fēng)險(xiǎn)比(hazards ratio,HR)、95%可信區(qū)間(95% confidence interval,95% CI)和P值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

兩組數(shù)據(jù)間的比較,若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,使用獨(dú)立樣本比t檢驗(yàn),若不服從正態(tài)分布,則使用U檢驗(yàn)。TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中,使用Spearman秩相關(guān)分析探索LAMC2基因表達(dá)量及突變狀態(tài)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的關(guān)系; KM Plotter工具中LAMC2基因的表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系的生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制,并使用 log-rank檢驗(yàn)對(duì)兩組生存曲線進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAMC2基因相對(duì)表達(dá)量

與正常組織相比,LAMC2在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A、1B)。進(jìn)一步分析乳腺癌中LAMC2的表達(dá)和臨床病理的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌與Luminal型和HER-2過表達(dá)型乳腺癌相比LAMC2的表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1C)。LAMC2的表達(dá)水平和淋巴結(jié)狀態(tài)相關(guān)(圖1D),N3分別與N0及N1相比,LAMC2表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在不同乳腺癌分期中,LAMC2的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1E)。

A為GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中LAMC2的差異表達(dá);B為UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中LAMC2的差異表達(dá);C為L(zhǎng)AMC2在不同分子分型中的表達(dá);D為L(zhǎng)AMC2在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)下的表達(dá);E為L(zhǎng)AMC2在不同分期中的表達(dá)。

HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中,LAMC2屬于人類疾病相關(guān)基因。免疫組織化學(xué)染色示LAMC2蛋白在乳腺癌組織中相對(duì)于正常乳腺組織中低表達(dá),亞細(xì)胞定位示LAMC2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的表達(dá)并且被認(rèn)為是分泌蛋白(圖2)。

A為正常乳腺組織;B為乳腺癌組織;C為亞細(xì)胞定位。

2.2 LAMC2基因與甲基化之間的關(guān)系

LAMC2是1個(gè)超甲基化基因,且在乳腺癌和正常乳腺中甲基化水平不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 乳腺癌和正常乳腺組織中LAMC2基因甲基化水平

2.3 LAMC2與乳腺癌干細(xì)胞及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系

利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析,LAMC2基因的表達(dá)和乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD133的表達(dá)水平均呈正相關(guān)(圖4)。

圖4 乳腺癌中LAMC2的表達(dá)和CD44、CD133的關(guān)系

通過TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)探索LAMC2基因表達(dá)與乳腺癌腫瘤微環(huán)境中6種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的關(guān)系,見圖5。LAMC2基因的表達(dá)水平與B細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān),與CD8+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步探索免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和LAMC2基因突變狀態(tài)之間的關(guān)系,僅B細(xì)胞浸潤(rùn)水平和LAMC2基因突變有關(guān),在LAMC2突變組B細(xì)胞浸潤(rùn)水平相對(duì)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其他5種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平和LAMC2突變狀態(tài)相關(guān)性不強(qiáng),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 LAMC2基因表達(dá)與乳腺癌患者總生存期的關(guān)系

與LAMC2低表達(dá)患者相比,LAMC2高表達(dá)患者有更長(zhǎng)的總生存期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

A為基于mRNA的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析;B為基于mRNA的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析。

2.4.1不同臨床病理下乳腺癌患者LAMC2基因表達(dá)與總生存期的關(guān)系

在Luminal A型乳腺癌、乳腺癌組織學(xué)Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者中,LAMC2的表達(dá)和患者總生存期呈正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。

表1 不同臨床病理特征下LAMC2基因表達(dá)與乳腺癌患者總生存期的關(guān)系

2.4.2不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)下乳腺癌LAMC2基因表達(dá)與總生存期的關(guān)系

在腫瘤微環(huán)境B細(xì)胞浸潤(rùn)減少型、CD8+T細(xì)胞減少型、富含巨噬細(xì)胞型或巨噬細(xì)胞減少型中,LAMC2高表達(dá)者預(yù)后較好,見表2。

表2 不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平下LAMC2表達(dá)和乳腺癌患者總生存期的關(guān)系

3 討論

癌細(xì)胞突破基底膜向間質(zhì)浸潤(rùn)是轉(zhuǎn)移的第一步,LM是基底膜的主要組成成分?；啄ぶ械腖M γ2亞基參與半橋粒復(fù)合體的組成,半橋粒復(fù)合體是上皮細(xì)胞穩(wěn)定黏附到基底膜上的結(jié)構(gòu)支持[10]。正常乳腺組織含有半橋粒復(fù)合體,浸潤(rùn)性乳腺癌缺少半橋粒復(fù)合體,在腫瘤中,它們的缺失可能與正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)的喪失有關(guān),從而使癌細(xì)胞易穿透基底膜發(fā)生遷移[11]。LAMC2在多種腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)異常[8]。通過生物信息學(xué)分析LAMC2在乳腺癌中的表達(dá)和臨床意義,挖掘其作為乳腺癌潛在生物標(biāo)志物的價(jià)值。

本研究通過數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)LAMC2基因在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào),且LAMC2基因的表達(dá)與乳腺癌分子分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)密切相關(guān),三陰性乳腺癌中LAMC2的表達(dá)和Luminal型和HER-2過表達(dá)型乳腺癌相比上調(diào),這和Carpenter等[12]的研究結(jié)果一致,LMγ2亞基參與組成的LM-332在三陰性乳腺癌中表達(dá),在雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌中不表達(dá)。LAMC2低表達(dá)乳腺癌患者的總生存期更短,且LAMC2和患者預(yù)后的關(guān)系受臨床病理的影響。這些結(jié)果提示LAMC2基因的異常表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。分析原因,LAMC2基因低表達(dá)影響LM-332亞型的合成,進(jìn)行破壞了基底膜的正常結(jié)構(gòu)和正常導(dǎo)管結(jié)構(gòu)喪失[13],半橋粒復(fù)合體合成障礙,使癌細(xì)胞在向周圍組織浸潤(rùn)過程中失去了基底膜保護(hù)屏障。LMγ2亞基可以在基質(zhì)金屬蛋白酶的作用下水解產(chǎn)生至少兩個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣序列的DⅢ片段,水解釋放的DⅢ片段通過結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體并介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào),促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移[14]。乳腺癌組織中可能存在LMγ2亞基和DⅢ片段比例的失調(diào),即低LM γ2亞基/高DⅢ片段狀態(tài)。LAMC2在乳腺癌中低表達(dá)可能和乳腺癌中基質(zhì)金屬蛋白酶上調(diào)有關(guān)[15]。

通過數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中LAMC2是一個(gè)超甲基化基因,甲基化可能是LAMC2基因低表達(dá)的機(jī)制之一。但數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌LAMC2基因甲基化水平相對(duì)正常乳腺組織低,可能是因?yàn)榛蛑g存在互作關(guān)系,上游基因甲基化水平高、存在MicroRNA的調(diào)節(jié)或者其他通路的影響,導(dǎo)致乳腺癌中LAMC2表達(dá)下調(diào),具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。此外,腦轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移是晚期乳腺癌患者生活質(zhì)量下降和預(yù)后不良的主要原因[3]。在小鼠乳腺癌腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型中,異型腫瘤-星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用發(fā)生局部黏著斑激酶磷酸化,誘導(dǎo)腦轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的LAMC2表達(dá)和LM-332的沉積,從而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞在大腦中的定植[16]。在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移微環(huán)境中由LMγ2亞基參與構(gòu)成的LM-332蛋白在高濃度下可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移[17]?？傊?LAMC2基因正常表達(dá)是維持正常乳腺上皮細(xì)胞的表型的前提,在乳腺癌組織中的低表達(dá)和乳腺癌的發(fā)生有關(guān),在腦或肺轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的高表達(dá)和乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移定植有關(guān)。

利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌中LAMC2的表達(dá)和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD133呈正相關(guān)。CD44是重要的乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物,乳腺腫瘤中高占比的乳腺癌干細(xì)胞已被證明與不良后果相關(guān)[18]。Sato等[19]研究發(fā)現(xiàn)LMγ2的氨基酸末端片段通過與CD44的相互作用刺激侵襲性乳腺癌細(xì)胞的遷移。Brugnoli等[20]發(fā)現(xiàn)CD133可以作為非侵襲性和侵襲性乳腺腫瘤細(xì)胞惡性程度增加的指標(biāo),直接調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)移和耐藥相關(guān)的蛋白的表達(dá)。本研究通過數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)LAMC2在三陰性乳腺癌中的表達(dá)相對(duì)Luminal型和HER-2過表達(dá)型上調(diào),可能和三陰性乳腺癌中富含腫瘤干細(xì)胞有關(guān)[21];此外,LAMC2還可以通過LncRNA T376626促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[22]。乳腺癌干細(xì)胞的主要免疫抑制特征之一是程序性死亡受體-配體1的表達(dá),與效應(yīng)T細(xì)胞的細(xì)胞表面程序性死亡受體1結(jié)合,導(dǎo)致其衰竭[23]。

通過數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌中LAMC2的表達(dá)水平和與患者總生存期的關(guān)系受腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的影響。研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中LMγ2亞基被癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1通過JNK/AP1信號(hào)轉(zhuǎn)錄激活,該信號(hào)通過改變T細(xì)胞受體的表達(dá)阻止了T細(xì)胞向腫瘤巢穴的浸潤(rùn),減弱對(duì)抗程序性死亡受體1療法的反應(yīng)[24]。免疫抑制劑可用于治療程序性死亡受體-配體1陽(yáng)性的晚期三陰性乳腺癌[25]。三陰性乳腺癌中LAMC2的表達(dá)相對(duì)其他乳腺癌分型上調(diào),可能通過介導(dǎo)免疫細(xì)胞參與免疫逃逸,部分患者產(chǎn)生耐藥。在胰腺癌中LAMC2的表達(dá)可以預(yù)測(cè)患者對(duì)吉西他濱耐藥的治療反應(yīng)[26]。在三陰性乳腺癌中LAMC2的表達(dá)是否可以預(yù)測(cè)抗程序性死亡受體1療法的反應(yīng)有待進(jìn)一步研究。本研究有一定的局限性,利用生物信息學(xué)分析獲得的結(jié)果還需要進(jìn)一步臨床和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

LAMC2基因在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)且其表達(dá)與乳腺癌總生存期的關(guān)系受不同臨床病理因素的影響,LAMC2基因的表達(dá)和腫瘤微環(huán)境中的腫瘤干細(xì)胞和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平有關(guān)。這些結(jié)果可以為L(zhǎng)AMC2基因與乳腺癌關(guān)系的研究提供線索,監(jiān)測(cè)LAMC2表達(dá)可以為乳腺癌的治療及預(yù)后評(píng)估提供重要的參考價(jià)值。