趙曉燕，張勇剛，高瑞娜，趙一彧

1.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護(hù)系，山西朔州 036002；2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院皮膚科，內(nèi)蒙古包頭 014030

士的寧是中藥馬錢子中含量最多的生物堿，化學(xué)分子式為C21H22N2O2[1]，興奮神經(jīng)中樞，是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要有效成分[2-4]。已經(jīng)有電生理實(shí)驗(yàn)顯示士的寧對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)元鉀通道、鈉通道和鈣通道有調(diào)節(jié)作用[5]。鉀通道是最豐富的離子通道，在動(dòng)作電位、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、神經(jīng)傳導(dǎo)、血壓調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程和功能中起著重要作用[6-7]。Kv4鉀通道是電壓依賴性鉀通道（Kv）家族的一個(gè)重要成員，該類通道能夠快速激活和快速失活，產(chǎn)生瞬時(shí)外向鉀電流，參與神經(jīng)元的動(dòng)作電位的產(chǎn)生、放電模式和放電頻率[8]。Kv4鉀通道家族是治療一些神經(jīng)元受損引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如精神分裂癥、阿爾茨海默病、帕金森病與癲癇的潛在治療靶點(diǎn)[9]。Kv4.3鉀通道是Kv4家族的一個(gè)主要通道[10]，廣泛存在于中樞神經(jīng)元、外周神經(jīng)元和心肌細(xì)胞上。本論文利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，以HEK293T細(xì)胞為載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Kv4.3鉀通道，研究士的寧對(duì)Kv4.3鉀電流峰值和Kv4.3通道動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，探究士的寧作為中樞興奮藥，在治療一些神經(jīng)元退行性疾病時(shí)的離子通道學(xué)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中，已經(jīng)證實(shí)1 μmol/L士的寧能顯著地抑制皮層神經(jīng)元瞬時(shí)外向鉀通道[5]，所以本次研究于2019年6—10月在大連理工大學(xué)選取24個(gè)Kv4.3-HEK293T細(xì)胞，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究劑量為1 μmol/L士的寧對(duì)Kv4.3電流和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與藥物

人胚胎腎293T（HEK 293T）細(xì)胞：大連理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；士的寧：中檢所（110705-200306）。

1.2 方法

1.2.1 Kv4.3通道的體外轉(zhuǎn)錄 hKv4.3/pXOOMEGFP質(zhì)粒由丹麥哥本哈根大學(xué)Nicole Schmitt贈(zèng)送。先將質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，再利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。再利用LipotectamineTM 2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒于HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。

1.2.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄 全細(xì)胞膜片鉗記錄實(shí)驗(yàn)是在室溫條件下進(jìn)行。先用電極拉制儀拉制電極，灌注電極內(nèi)液。再將轉(zhuǎn)染了Kv4.3通道的HEK293細(xì)胞放在盛有電極外液的培養(yǎng)皿內(nèi)。利用IX71倒置顯微鏡，選形態(tài)和光澤度好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。利用MP225型三維式液壓微操縱儀將帶了正壓的玻璃微電極靠近目標(biāo)細(xì)胞，撤去正壓，繼續(xù)移動(dòng)電極，使其與目標(biāo)細(xì)胞膜正好接觸，再分兩步施加負(fù)壓，第一步使電極與目標(biāo)細(xì)胞形成高阻封接；第二步使細(xì)胞膜破裂，形成全細(xì)胞膜片鉗記錄模式。

1.2.3 分組與處理 隨機(jī)選取6個(gè)轉(zhuǎn)染了Kv4.3的HEK293T細(xì)胞（n=6），針對(duì)每一個(gè)細(xì)胞，士的寧處理前用膜片鉗記錄的數(shù)據(jù)是對(duì)照組，1 μmol/L士的寧處理后記錄的數(shù)據(jù)為觀察組。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 檢測(cè)Kv4.3的表達(dá)量 以HEK293T細(xì)胞為載體，把被熒光標(biāo)記的Kv4.3（hKv4.3/pXooM-EGFP）質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞48 h，首先采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的準(zhǔn)確性，再通過熒光顯微鏡觀察表達(dá)量。

1.3.2 Kv4.3通道鉀電流 采用電壓鉗技術(shù)，參數(shù)設(shè)置（protocol）：首先將膜電位設(shè)置在-80 mV，接著給予一個(gè)80 ms的時(shí)程，從-80 mV階躍到+70 mV，每10 mv階躍一次，記錄加藥前后KV4.3鉀電流。

1.3.3 Kv4.3通道激活動(dòng)力學(xué)參數(shù) 采用電壓鉗技術(shù)，鉗制電位是-70 mV，具體protocal：從-50 mv階躍到+60 mV，每10 mV階躍一次，時(shí)程為80 ms的脈沖刺激。根據(jù)公式：（其中：G為電導(dǎo)值、I為電流值、Vm是膜電位，Vrec為反轉(zhuǎn)電位）求出Kv4.3電導(dǎo)值，根據(jù)波爾茲曼方程程擬合，求出加藥前后Kv4.3通道參數(shù)：半數(shù)激活電壓Vb1/2和斜率因子κb。

1.3.4 Kv4.3通道穩(wěn)態(tài)失活動(dòng)力學(xué)參數(shù) 具體protocal：鉗制電位是-70 mV，先給予一個(gè)時(shí)程為100 ms，從-120 mv開始直接階躍到0 mV，每10 mV階躍一次的條件脈沖刺激后，固定去極化至+40 mV，時(shí)程為100 ms的測(cè)試脈沖。根據(jù)波爾茲曼方程擬合，求加藥前后半數(shù)失活電壓Vc1/2和斜率因子κc參數(shù)。

1.3.5 Kv4.3通道失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)參數(shù) 具體protocal：鉗制電位是-70 mV，先給予一個(gè)時(shí)程為80 ms，從-70 mV開始直接階躍到+50 mV的條件脈沖刺激后，接著從+50 mV恢復(fù)至-80 mV，時(shí)程為10～260 ms，最后給予一個(gè)固定去極化至+50 mV，時(shí)程為80 ms的測(cè)試脈沖刺激。失活后恢復(fù)電流I等于各條件電壓所對(duì)應(yīng)的電流值與測(cè)試電壓所對(duì)應(yīng)的電流值之比。通過單指數(shù)方程（其中t是條件電壓與測(cè)試電壓的時(shí)間間隔，τ是失活后恢復(fù)時(shí)間常數(shù)）擬合求出加藥前后Kv4.3通道τ值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

參數(shù)設(shè)置、數(shù)據(jù)的記錄和整理涉及軟件Pulse和Clamfit。繪圖軟件是Origin。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)Kv4.3的表達(dá)量

轉(zhuǎn)染48 h后質(zhì)粒確實(shí)表達(dá)，見圖1A；表達(dá)量比較高，見圖1B。

圖1 A:hKV4.3瓊脂糖凝膠電泳圖(M:marker；1 2：hKv4.3/pXooMEGFP質(zhì)粒)；B：hKV4.3-EGFP質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染48 h熒光圖片

2.2 士的寧對(duì)Kv4.3通道鉀電流的影響

選用橫坐標(biāo)為2 ms，縱坐標(biāo)為1 nA的標(biāo)尺，明顯觀察組電流低于對(duì)照組。見圖2。

圖2 士的寧對(duì)Kv4.3鉀電流原始曲線的影響

2.3 士的寧對(duì)Kv4.3通道激活曲線的影響

觀察組能使kv4.3通道激活曲線向左移動(dòng)，半數(shù)激活電壓由（15.41±2.87）mV顯著降為（-2.10±2.08）mV，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.101，P＜0.05）。見圖3和表1。

表1 士的寧對(duì)Kv4.3通道參數(shù)的影響(±s)

表1 士的寧對(duì)Kv4.3通道參數(shù)的影響(±s)

組別對(duì)照組（n=6）觀察組（n=6）t值P值Vb1/2（mV）15.41±2.87-2.10±2.08 12.101＜0.001 κb 23.70±3.38 20.41±2.50 1.917 0.044 Vc1/2（mV）61.30±0.52-65.65±0.53 1.155 0.144 κc 11.58±0.49 11.94±0.50 1.260 0.123 τ（ms）38.64±2.10 48.52±2.79 6.930＜0.001

圖3 士的寧對(duì)Kv4.3通道激活曲線的影響

2.4 士的寧對(duì)Kv4.3通道失活與失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的影響

觀察組能使kv4.3通道向左移動(dòng)，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；觀察組失活后恢復(fù)時(shí)間τ大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.930，P＜0.05）。見圖4和表1。

圖4 士的寧對(duì)Kv4.3失活與失活后恢復(fù)曲線的影響

3 討論

士的寧是屬于中樞興奮類的藥物，對(duì)延髓有興奮性，能夠提高血管運(yùn)動(dòng)中樞與中樞呼吸中樞；對(duì)脊髓有興奮性，能夠提高脊髓的反射功能；對(duì)大腦皮層有興奮性，能夠提高感覺中樞的功能，使昏迷的患者蘇醒過來[11]。這些均說明安全劑量的士的寧對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。而許多神經(jīng)系統(tǒng)類疾病是因?yàn)殡x子通道的表達(dá)和功能異常，導(dǎo)致神經(jīng)元興奮和抑制的平衡被打破[9]。一些中樞類藥物的作用機(jī)制就是通過影響離子通道來影響神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放頻率和時(shí)程，或者神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[12]。Kv4.3鉀通道是主要的瞬時(shí)外向鉀通道，廣泛存在于心肌細(xì)胞和神經(jīng)元上[13-15]，Kv4.3電流是心肌鉀電流和小型背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元A型鉀電流的主要成分，在超射后立即產(chǎn)生，是動(dòng)作電位復(fù)極化早期的主要外向電流，與單個(gè)動(dòng)作電位的時(shí)程和重復(fù)發(fā)放頻率[8]有關(guān)，其異常表現(xiàn)將主要導(dǎo)致神經(jīng)和心血管疾病[16]。因此，研究開發(fā)Kv4.3的相關(guān)靶藥物，對(duì)于治療由其引起的各種離子通道病具有積極意義。所以本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，以HEK293T細(xì)胞作為載體，選取瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h的Kv4.3鉀通道細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先研究士的寧對(duì)Kv4.3鉀電流的影響，發(fā)現(xiàn)士的寧能抑制Kv4.3鉀電流。在生理?xiàng)l件下，人體細(xì)胞內(nèi)的鉀離子濃度比細(xì)胞外的鉀離子濃度高好幾倍[17]，因?yàn)槭康膶帉?duì)Kv4.3鉀電流有抑制作用，所以抑制了細(xì)胞內(nèi)的鉀離子向細(xì)胞外流動(dòng)，這也就說明士的寧維持了細(xì)胞內(nèi)鉀離子數(shù)，同時(shí)也減少了動(dòng)作電位后期Na-K泵消耗相關(guān)的酶和ATP能量，從某種意義上是保護(hù)了患者的神經(jīng)元，有利于受破壞神經(jīng)元的修復(fù)。由于Kv4.3這種瞬時(shí)外向鉀電流參與動(dòng)作電位的重復(fù)發(fā)放頻率，士的寧對(duì)其有抑制作用，也說明了可以降低動(dòng)作電位的發(fā)放頻率，也就減少消耗機(jī)體的更多能量，對(duì)昏迷的患者是一種保護(hù)機(jī)制，從另一方面也解釋了士的寧能夠興奮大腦皮層，使昏迷的患者蘇醒。其次為了進(jìn)一步研究士的寧是如何抑制Kv4.3鉀電流，又研究了士的寧對(duì)Kv4.3鉀通道激活過程、失活過程和失活后恢復(fù)過程的影響，結(jié)果顯示士的寧使半數(shù)激活電壓由加藥前（15.41±2.87）mV變成加藥后（-2.10±2.08）mV（P＜0.05），這就說明士的寧在更小的電壓下就能激活Kv4.3通道；士的寧對(duì)穩(wěn)態(tài)失活曲線沒有影響，但是卻能使失活后恢復(fù)時(shí)間由加藥前的（38.64±2.10）ms變?yōu)椋?8.52±2.79）ms（P＜0.05），明顯地延遲了通道的失活后恢復(fù)過程。類似研究，甘文云等[18]以大鼠心室肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)馬錢子堿能降低電流，與本研究一致；接著他們也研究了通道參數(shù)，比如馬錢子堿能使大鼠瞬時(shí)外向鉀通道失活后恢復(fù)時(shí)間由（10.9±6.1）ms變?yōu)椋?10.5±27.9）ms（P＜0.05），延遲了通道的失活后恢復(fù)過程，可能因?yàn)檠芯康募?xì)胞不一樣，使用的藥物濃度不同和protocal不同，具體數(shù)值不一樣，但是加藥后變化趨勢(shì)卻一樣。

這些結(jié)果證明士的寧對(duì)Kv4.3鉀電流抑制作用是通過影響Kv4.3鉀通道激活和失活后恢復(fù)過程來實(shí)現(xiàn)的。已有研究表明，一些門控類的藥物可以通過作用電壓依賴性通道的電壓敏感區(qū)蛋白來實(shí)現(xiàn)改變通道的電壓依賴性[19]。換句話說，士的寧對(duì)Kv4.3鉀通道的作用靶點(diǎn)可能是該通道的激活門控電壓敏感區(qū)蛋白和失活后恢復(fù)門控電壓敏感區(qū)蛋白，這也為下一步的研究提供了方向。

綜上所述，士的寧作為中樞興奮藥，其通道藥理學(xué)機(jī)制是通過影響Kv4.3通道的激活和失活后恢復(fù)過程來實(shí)現(xiàn)對(duì)Kv4.3鉀電流的抑制作用，這也為士的寧的藥理學(xué)研究提供理論研究。