郭冰雪,林鵬程,吳 疆,周黨衛(wèi)

1.青海民族大學藥學院,西寧 810007;2.青海省青藏高原植物化學重點實驗室,西寧 810007;3.青海省藥物分析重點實驗室,西寧 810007

川貝母入藥部位為百合科植物卷葉貝母(FritillariacirrhosaD.Don)、暗紫貝母(FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia)、甘肅貝母(FritillariaprzewalskiiMaxim)、梭砂貝母(FritillariadelavayiFranch)、太白貝母(FritillariataipaiensisP.Y.Li)或瓦布貝母[FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsiavar.wabuensis (S.Y.Tang et S.C.Yue).Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen]的干燥鱗莖[1-3]。2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)一部中對川貝母記載:川貝母味苦、甘,性微寒;歸肺、心經(jīng),可清熱潤肺、化痰止咳,浙貝母可清熱化痰、解毒散結(jié)?！侗静菥V目拾遺》將川貝與浙貝分開,謂川貝味甘而補肺,不若用象貝治風火痰嗽為佳。若虛寒咳嗽以川貝為宜[4]。中醫(yī)學認為川貝母有清熱潤肺、化痰止咳、散結(jié)消癰等功效。川貝母臨床用量大多數(shù)為3～30 g,醫(yī)治不同疾病時的用量范圍也存在差異[5]。川貝母是國家三級保護植物,且價格高昂,因此市場上出現(xiàn)了大批偽品,這些偽品有光慈菇、草貝母、東貝母、浙貝母等,這些偽品與川貝母形態(tài)相似,單從形態(tài)學難以區(qū)分,而且藥效與川貝母不同,濫用不僅不能治病,還會延誤病情[6-8]。目前2020年版《中國藥典》一部中收錄的對川貝母的鑒別方法有微觀粉末特征鑒別、薄層色譜法鑒別、聚合酶鏈式反應(yīng)——限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法,為進一步規(guī)范川貝母的市場,保障用藥安全,近年來對川貝母真?zhèn)蔚难芯吭絹碓蕉?本文對近10年川貝母的真?zhèn)舞b別方法進行了總結(jié)并分析了各種方法的特點,為以后川貝母的真?zhèn)舞b別提供參考[1]。

1 性狀鑒定

利用人的感官從藥材的質(zhì)地、色澤、外觀形態(tài)等辨別川貝母真?zhèn)?其結(jié)果是否正確主要取決于鑒定者的經(jīng)驗,有一定的主觀性。對于川貝母這種近緣物種較多的藥材,用此種鑒別方法有一定的難度。根據(jù)性狀不同,川貝母可分為松貝母、青貝母和爐貝母。爐貝母一般比松貝母和青貝母大。李娜[9]研究發(fā)現(xiàn),川貝母和平貝母的兩鱗片存在區(qū)別,川貝母的兩鱗片抱合較平貝母緊密;川貝母底部較平,平貝母底部較凸。湖北貝母呈扁圓球形,外層鱗葉略呈腎形, 大瓣緊抱小瓣,內(nèi)有鱗葉幾片和干縮的殘莖,基部內(nèi)凹;伊貝母外層鱗葉呈月牙形,基部圓鈍, 內(nèi)有較大的鱗片和殘莖、心芽;伊犁貝母較大, 表面稍粗糙,外層鱗葉呈心臟形,基部稍微凹陷;浙貝母質(zhì)硬而脆[10];東貝母呈卵圓形或長圓形,基部較尖,味極苦[11]。

2 顯微鑒別

利用顯微鏡觀察川貝母內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)(例如淀粉粒、表皮細胞、氣孔、導(dǎo)管等)的特征辨別真?zhèn)?但該方法的缺陷是一般需要破壞川貝母,而且難以顯示近源物種之間的關(guān)系[12]。松貝、青貝粉末呈白色,淀粉粒多, 有的邊緣呈分枝狀,臍點呈點狀、短縫狀, 少數(shù)呈人字狀或馬蹄形;表皮細胞呈類長方形,偶見不定式氣孔, 類圓形, 副衛(wèi)細胞,螺紋導(dǎo)管。爐貝粉末呈白色,臍點呈人字狀、星狀或點狀, 層紋明顯, 氣孔呈長圓形;螺紋及網(wǎng)紋導(dǎo)管較松貝、青貝長。平貝粉末呈類白色,淀粉粒單粒,臍點呈裂縫狀、點狀或人字狀,氣孔呈類圓形,副衛(wèi)細胞4～6個,螺紋導(dǎo)管直徑40～48 mm。伊貝母粉末呈類白色或淡黃白色,淀粉粒單粒,呈廣卵形、卵形或貝殼形,直徑5～60 mm;臍點點狀、人字狀,氣孔呈不定式。湖北貝母粉末呈淡棕黃色,淀粉粒特別多,呈廣卵形或長橢圓形,直徑7～54 mm,偶見復(fù)粒;臍點明顯,呈點狀、人字形或裂縫狀;層紋明顯而細密;氣孔呈扁圓形,副衛(wèi)細胞4～5個;表皮細胞垂周壁呈連珠狀增厚,草酸鈣結(jié)晶棱方形、顆粒狀或簇狀,直徑達50 mm。浙貝母粉末呈類白色至淡黃白色,淀粉粒多為單粒,多呈廣卵圓形或橢圓形,直徑6～56 mm,臍點多數(shù)呈點狀或裂縫狀,有較大的淀粉粒;層紋明顯,呈偏心形,導(dǎo)管多為螺紋狀細小導(dǎo)管[13]。

3 理化鑒別

除《中國藥典》(2020年版)規(guī)定的鑒別方法外,對川貝母的理化鑒別方法有以下幾種。

3.1 木尖電噴霧電離質(zhì)譜分析和多元統(tǒng)計分析結(jié)合

木尖電噴霧電離質(zhì)譜分析法無需復(fù)雜樣品預(yù)處理步驟,可直接分析樣品中的生物堿成分[14-15]。XIN G Z等[16]采用木尖電噴霧電離質(zhì)譜分析和多元統(tǒng)計分析相結(jié)合的方法鑒定出貝母的初級代謝物(氨基酸、檸檬酸、糖類等)和次生代謝物(生物堿、黃酮、皂苷等),實現(xiàn)了對川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母、太白貝母和瓦布貝母的快速鑒別。

3.2 色譜鑒別

薄層色譜法(thin layer chromatography, TLC)是評價川貝母真?zhèn)蔚暮啽阌行Х椒ㄖ?。?020年版《中國藥典》中川貝母的薄層鑒別法中用貝母素乙作為對照品。于國強等[17]采用TLC鑒別法,以西貝母堿斑點作為鑒別依據(jù),在浙貝母、湖北貝母及平貝母薄層色譜圖中未見西貝母堿斑點,而川貝母TLC圖中可見西貝母堿斑點,此法可用來區(qū)分出川貝母與浙貝母、湖北貝母及平貝母。翟映紅等[18]優(yōu)化了藥典上的TLC法,按照優(yōu)化后的TLC實驗發(fā)現(xiàn),平貝母比川貝母薄層色譜圖多2個斑點,這個特點可用來判斷川貝母中是否摻雜平貝母。

生物堿是川貝母的特征性成分,甾體生物堿是川貝母的主要活性成分,通過含量測定方法也可實現(xiàn)對川貝母真?zhèn)纹返蔫b別[19]。周琪等[20]按照2015年版《中國藥典》方法對川貝母基源藥材進行了含量測定,結(jié)果表明,松貝的總生物堿含量平均值為0.046%,青貝的總生物堿含量平均值為0.072%,所以松貝和青貝不僅存在性狀上的區(qū)別,總生物堿含量也存在差異。LUO D等[21]將超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法結(jié)合化學計量學方法包括相似度分析(similarity analysis,SA)、系統(tǒng)聚類分析(hierarchical clustering analysis,HCA)和主成分分析(principal component analysis,PCA)建立了一種特異、實用、有效的指紋圖譜分析方法,用于川貝母藥材及其混偽品的品種鑒別和質(zhì)量評價。閔會等[22]采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器建立了指紋圖譜,此法可用于鑒別并區(qū)分浙貝母、平貝母、川貝母藥材。

3.3 光譜鑒別

紅外光譜是對復(fù)雜基質(zhì)進行定性和定量分析的一種基本方法,產(chǎn)生的信息歸因于特征基團的存在,如醇類、酮類、烯類等,獲得的光譜代表了每個測試樣品的化學指紋。劉晶晶等[23]采用傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR) 結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜和二維相關(guān)紅外光譜分析方法,通過比較峰數(shù)、峰形和峰的強度能夠辨別出松貝、青貝、爐貝和太白貝母。王月[24]采用FTIR和反射光纖探針,對不同種類的貝母進行檢測,并通過主成分分析和聚類分析,利用軟獨立建模分類法(soft independent modeling of class analogies,SIMCA算法)的監(jiān)督模式識別出摻假的川貝母粉末。范林宏等[25]利用便攜式近紅外光譜儀采集川貝母真?zhèn)纹方t外光譜數(shù)據(jù),利用線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)及偏最小二乘法(partial least squares,PLS)分別建立川貝母-摻偽品、不同類別摻偽品定性校正模型及不同類別摻偽品摻偽量定量校正模型,其中運用的2種模型預(yù)測的準確率分別為83.33%、90.91%。便攜式近紅外光譜儀雖然模型參數(shù)不夠完善,可能沒有臺式設(shè)備精確,但有較強的實時檢測功能,可用于大批量川貝母的無損鑒別,為川貝母采收和交易環(huán)節(jié)的質(zhì)量評價提供一定的參考[25]。此外,王文娜等[26]采用激光拉曼光譜技術(shù)測定了川貝母及其偽品表面的拉曼光譜,利用拉曼光譜可快速、無損地鑒別川貝母真?zhèn)纹贰?/p>

4 分子生物學方法鑒別

4.1 堿裂法

堿裂法是利用染色體脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)與質(zhì)粒DNA變性復(fù)性的差異來分離染色體DNA與質(zhì)粒DNA[27]。堿裂法是使質(zhì)粒DNA和染色體DNA在高pH下變性,同時沉淀蛋白質(zhì),再將pH值調(diào)至中性,由于質(zhì)粒DNA相比染色體DNA較小,容易復(fù)性成雙鏈,而染色體DNA較大,易纏結(jié)成網(wǎng)狀不溶物質(zhì),可通過離心除去[27]。陳玉秀等[27]研究表明,含有200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)溶液,5 mmol·L-1氯化鎂(MgCl2)溶液,體積分數(shù)1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),體積分數(shù)1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP),2 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA),10 g·L-1十二烷基硫酸鈉(SDS),0.1 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)的堿裂解液有最佳的DNA提取效果,這種方法成本較低,可用于快速鑒別川貝母的真?zhèn)巍?/p>

4.2 聚合酶鏈式反應(yīng)法(polymerase chain reaction,PCR法)

PCR法是一種DNA體外快速擴增技術(shù),微量和常量樣品都可以使用這種技術(shù)。熒光定量PCR法可分為探針法和染料法,其中探針法的特異性、靈敏度和重復(fù)性都明顯優(yōu)于染料法,同時有定性和定量的作用,可用于鑒別川貝母摻偽情況[28]。楊健等[29-30]采用了實時熒光定量PCR法,利用川貝母內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internal transcribed spacer1,ITS1)序列的特點,設(shè)計了真、偽川貝母鑒別引物,真川貝母鑒別引物以川貝母ITS1區(qū)第75位堿基“C”為3′末端,偽川貝母鑒別引物以“T”為3′末端,該方法可以檢測川貝母粉末的摻偽程度。劉艷艷等[31]建立了多重熒光實時定量法鑒別川貝母真?zhèn)纹贰⑾阆愕萚32]也分析了川貝母ITS1序列特點,設(shè)計了1對川貝母特異性擴增引物(CBM-SP引物),建立了PCR法用來快速鑒別川貝母真?zhèn)纹?鑒別結(jié)果與藥典收錄的限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites,PCR-RFLP)一致。陳慕媛等[33]設(shè)計了川貝母DNA特異性引物,結(jié)果表明,川貝母溶解曲線是尖銳的峰形,退火溫度是80.98 ℃,利用這種特異的熔解曲線峰形和退火溫度可區(qū)別出川貝母真?zhèn)纹?。潘杰等[34]根據(jù)川貝母和伊貝母ITS1片段的一個特異性位點設(shè)計了雙雜交探針,因為該探針與PCR擴增片段雜交程度不同,所以儀器在不同退火溫度下檢測的熒光峰值存在差異,由此來區(qū)別出川貝母和伊貝母,這種方法可用于鑒別川貝母中是否摻雜伊貝母。

4.3 PCR-RFLP法

川貝母內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)含有CCCGGG序列,它的第75位堿基為C,是限制性內(nèi)切酶(SmaI)酶切位點,而其他貝母ITS區(qū)是CTCGGG序列,第75位堿基為T,不是SmaI酶切位點[35-38]。PCR-RFLP法基于此特點可以實現(xiàn)從分子水平上鑒別川貝母[39]。趙仲麟等[36]對《中國藥典》已經(jīng)有的PCR-RFLP方法進行了改進,設(shè)計了7個底物濃度梯度,進行比較后選擇了最合適的酶切反應(yīng)底物濃度,優(yōu)化了《中國藥典》中的酶切體系。這種方法可以檢測出川貝母藥材的真?zhèn)?還可以相對定量檢測出川貝母中摻假的量。鮑方名等[40]也優(yōu)化了《中國藥典》上已經(jīng)有的PCR-RFLP方法,調(diào)整了聚合酶鏈式反應(yīng)模板和引物的比率,提高退火溫度至61 ℃,采用乙醇沉淀法純化PCR反應(yīng)液,優(yōu)化后的方法酶切結(jié)果與藥典上的原方法酶切結(jié)果比較更加清晰,此法也可用于川貝母的真?zhèn)纹疯b別。孫麗媛等[35]研制了川貝母DNA檢測試劑盒,利用該試劑盒提取出川貝母DNA,然后進行PCR反應(yīng)和RFLP鑒定,使用該試劑盒按照藥典的PCR-RFLP法鑒別川貝母真?zhèn)尾僮鞅容^簡單,結(jié)果差別不大。

4.4 DNA條形碼

DNA條形碼是利用DNA區(qū)域片段進行物種鑒定的技術(shù)。對于貝母來說,它的通用條形碼鑒別貝母物種真?zhèn)蔚哪芰^差。HUANG J等[41-42]研究利用葉綠體全基因組序列作為超級條形碼,對貝母及其偽品的植物源進行了鑒定,比較了DNA條形碼、超級DNA條形碼、特異DNA條形碼鑒別貝母真?zhèn)纹返哪芰?發(fā)現(xiàn)超級DNA條形碼有較強的鑒別貝母真?zhèn)纹返哪芰?。雖然超級條形碼有很多優(yōu)點,但在DNA提取困難的情況下,不適合用于植物種類鑒定。對于干燥、煮熟或煎煮的藥材,DNA降解嚴重的情況下,可能提取不到足夠的DNA片段[43]。而且與單位點條形碼相比,超級條形碼的成本更高,并且使用Windows軟件進行數(shù)據(jù)分析也很復(fù)雜。當傳統(tǒng)的DNA條形碼局限于某些親緣關(guān)系較近的物種的植物鑒定時,超級條形碼就能顯示出它的優(yōu)勢。

4.5 DNA條形碼和高效液相指紋圖譜相結(jié)合的方法

羅焜等[44-45]研究發(fā)現(xiàn),川貝母及其混偽品的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(internal transcribed spacer 2, ITS2)二級結(jié)構(gòu)都存在4個螺旋區(qū)域,各螺旋上的莖環(huán)以及彼此間的夾角存在明顯的不同,說明ITS2二級結(jié)構(gòu)有助于更直觀地鑒定物種。WU L等[46-48]利用DNA條形碼數(shù)據(jù)的ITS和ITS2成功地鑒定了5種貝母鱗莖,并區(qū)分出了這些貝母鱗莖的物種起源。此外,還利用高效液相指紋圖譜和分級聚類分析的方法對貝母進行了分類。朱海蘭等[49-50]根據(jù)川貝母及其偽品的ITS1序列設(shè)計了多重連接探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)探針對,經(jīng)MLPA-高分辨率熔解曲線法(high resolution melting analysis,HRM) (MLPA-HRM)實驗變性、雜交、連接、實時熒光擴增及熔解過程,利用HRM圖鑒別川貝母真?zhèn)纹?該探針特異性良好,靈敏度高,重復(fù)性好,混合樣品分析表明,在一次MLPA-HRM反應(yīng)中,可以檢測到摻10%偽品的川貝母。

4.6 熒光-環(huán)狀等溫擴增技術(shù)

環(huán)狀等溫擴增技術(shù)是一種核酸序列擴增技術(shù),它通過識別靶DNA上特定區(qū)域的引物和聚合酶,在恒溫條件下高效擴增靶標序列。蘭青闊等[51]利用熒光-環(huán)狀等溫擴增技術(shù)設(shè)計了5套川貝母引物,篩選出川貝母環(huán)狀等溫擴增鑒別引物,用這種引物建立了川貝母環(huán)狀等溫擴增技術(shù)鑒別真?zhèn)蔚姆椒?經(jīng)驗證此方法特異性和靈敏度均較好,可用于川貝母真?zhèn)纹返目焖俸Y查。

4.7 單核苷酸多態(tài)性位點鑒別技術(shù)

基因組DNA序列中由單個核苷酸(A, T, C和G)的突變而引起的多態(tài)性即為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)[52]。蘭青闊等[53]搜集了川貝母的葉綠體基因組序列,并將這些序列中的單核苷酸多態(tài)性位點與其他貝母屬植物的葉綠體基因組序列中的單核苷酸多態(tài)性位點進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),可用于鑒別川貝母真?zhèn)蔚膯魏塑账岫鄳B(tài)性位點71個,篩選出雙等位基因型單核苷酸多態(tài)性位點50個,可用于川貝母摻偽的定量分析。

5 計算機輔助鑒別

WANG Z等[54-55]結(jié)合了質(zhì)譜技術(shù)和最小乘回歸分析的方法來鑒別川貝母真?zhèn)纹?。胡科[12]建立了松貝母、青貝母、平貝母的圖像標準數(shù)據(jù)集,這些圖像數(shù)據(jù)集由4個不同視角拍攝的圖片組成,并利用傳統(tǒng)的機器學習算法支持向量機作為貝母圖像分類器對貝母圖像進行鑒別和分類。吳沖等[56]通過建立川貝母的圖像數(shù)據(jù)庫,獲取川貝母的外在視覺特征,利用計算機視覺技術(shù)和深度學習算法實現(xiàn)了對川貝母的鑒別。這種深度學習算法技術(shù)存在的問題是對于視覺特征差異比較小的川貝母真?zhèn)纹?可能出現(xiàn)鑒別錯誤,如果重點關(guān)注真?zhèn)纹诽卣餍缘牟顒e,將有利于提高鑒別的準確度。郭鳳柳等[57]利用氣相色譜離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS)技術(shù)得到川貝母、平貝母、伊貝母的指紋圖譜,計算出揮發(fā)性物質(zhì)含量,采用主成分分析(principal component analysis, PCA)對不同貝母所含揮發(fā)性物質(zhì)的量進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),松貝、爐貝和青貝這3個品種樣品中都含有較多相似的揮發(fā)性物質(zhì),但這些揮發(fā)性成分在平貝母和伊貝母樣品中含量很低或者沒有,此法可用于區(qū)分出川貝母和平貝母、伊貝母。

此外,張慧杰等[58]采用電子舌技術(shù)提取川貝母味覺信息值,結(jié)合化學計量學建立辨識模式,鑒別川貝母飲片真?zhèn)?此方法鑒別速度比藥典快,但鑒別準確率較傳統(tǒng)經(jīng)驗低。楊詩龍[59]采用了電子舌和電子鼻技術(shù)對川貝母真?zhèn)纹贩勰┻M行了鑒別,發(fā)現(xiàn)效果較好。劉瑞新等[60]采用了電子眼技術(shù)對川貝母飲片真?zhèn)纹愤M行了鑒別,該方法鑒別結(jié)果比藥典更快速、準確。

6 小結(jié)與展望

川貝母源自多種貝母,這些物種由于形態(tài)存在相似性及復(fù)雜的變異很容易混淆,單從形態(tài)上區(qū)分并不容易,因此,采用快速、準確的方法鑒別很重要。目前市場對川貝母的需求越來越大,市場上仍然存在一些川貝母的摻假現(xiàn)象。如今已有許多研究集中在不同貝母物種的鑒別上,但鑒定含川貝母產(chǎn)品原料藥的方法很少。未來應(yīng)改進已有的一些鑒別分析技術(shù),提高鑒別川貝母的準確性和有效性。此外,還要考慮新的鑒別方法,如紅外和拉曼光譜等,這些方法耗時較少,對環(huán)境友好,鑒別結(jié)果準確性高。