黃麗金 陳貴元，2*

（1大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000）

苦膽草（Andrographis paniculata）又稱印度草、穿心蓮、苦草、春蓮、秋蓮。穿心蓮因其食入一小片葉子，就可以感受到那直擊心靈的苦，故稱為“穿心蓮”[1]。該植物廣泛分布于我國福建、廣東等南方地區(qū)，有著“大南藥”之稱[2]。在民間這種植物可直接作為藥材使用，治療感染性疾病和解蛇毒。苦膽草中含有多種活性成分：多酚、蛋白質(zhì)、內(nèi)脂、多糖、黃酮等[3]，其中苦膽草內(nèi)脂有著多種藥理作用，如抗血栓、鎮(zhèn)痛、清熱解毒、抗高血糖、抗癌、保護(hù)肝臟等活性[4]。在研究內(nèi)脂抗癌機(jī)制中，屬結(jié)直腸癌和乳腺癌研究最多[5]。

多糖具有抗血糖[6]、降血脂[7]、抗癌[8]、抗氧化[9]多種活性，徐兵[10]研究發(fā)現(xiàn)苦膽草多糖可以抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞增殖活性、遷移侵襲活性，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。由于提取得到的多糖顏色較深，較難溶于水，且這些色素分子的存在會影響多糖發(fā)揮作用，這是因為未經(jīng)處理的多糖分子量較大，體積大，且溶解后黏度大，妨礙了多糖通過機(jī)體屏障進(jìn)入細(xì)胞，使其發(fā)揮不了生物學(xué)作用[11]，因此對多糖進(jìn)行脫色素非常有必要。研究發(fā)現(xiàn)，多糖脫色素的方法常用的有樹脂吸附法[12]、活性炭法[13]、雙氧水法[14]等?；钚蕴孔鳛橐环N吸附劑，是一種物理吸附法，其比表面積大、吸附性強(qiáng)、理化性質(zhì)穩(wěn)定、耐酸堿、內(nèi)部空間發(fā)達(dá)[15]等獨(dú)特的優(yōu)勢使其脫色素迅速又方便?？嗄懖莼钚蕴棵撋珪簾o相關(guān)研究，故本研究將用活性炭進(jìn)行多糖脫色，從單因素試驗方面，考察其脫色率和多糖保留率，選取最優(yōu)試驗條件進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken 設(shè)計試驗，并通過綜合評分，響應(yīng)面分析法設(shè)計出最優(yōu)脫色方案。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

苦膽草購于云南省大理市劍川縣農(nóng)貿(mào)市場；活性炭購于上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站經(jīng)銷；蒽酮、濃硫酸、無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器和設(shè)備

THZ-82恒溫振蕩器（常州智博瑞儀器制造有限公司），DL-8000C低俗冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司），722E型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1苦膽草多糖的提取參照李月等[16]的方法。

1.3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作采用蒽酮濃硫酸法[17]。準(zhǔn)確配制1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，即稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品粉末100 mg 加水定容至100 mL 的容量瓶中，取溶液配制成0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)液帶塞試管，蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，在冰水浴中分別加入4 mL 0.5%的蒽酮濃硫酸試劑，試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存于棕色瓶中。在水浴鍋90 ℃以上中沸騰10 min后，取出迅速冷卻，在常溫放置10 min。在620 nm處進(jìn)行多糖吸光度的測量。

1.3.3單因素試驗取質(zhì)量濃度為0.65 mg/mL的苦膽草多糖，離心取上清。在活性炭用量為0.3 g/30 mL、時間為40 min、溫度為50 ℃、震蕩頻率為120 r/min的基礎(chǔ)條件下，分別考察活性炭的脫色效果以及多糖保留的情況，每組試驗重復(fù)3次及以上。

1.3.4響應(yīng)面試驗設(shè)計根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在最優(yōu)試驗條件下作為中心點設(shè)計Box-Behnken三因素三水平表（見表1），進(jìn)一步研究活性炭用量（A）、脫色溫度（B）、脫色時間（C）之間的交互影響。使用Design-Expert 8.0 設(shè)計軟件優(yōu)化設(shè)計多糖脫色工藝，以綜合評分（Y）為響應(yīng)值評價多糖的脫色效果以及多糖保留率情況，并計算出最優(yōu)的試驗條件。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計

1.3.5驗證試驗根據(jù)響應(yīng)面得出的最優(yōu)脫色工藝組合進(jìn)行3 次平行試驗，以綜合評分為指標(biāo)驗證響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)是否可靠。

1.3.6脫色率、多糖保留率和綜合評分的測定和計算方法

（1）脫色率測定 將多糖溶液在200～1 200 nm紫外分光度計下掃描波長，結(jié)果未得到合適的最大吸收峰，根據(jù)顏色的互補(bǔ)定理[18]，該溶液為深褐色，選取560 nm 的波長進(jìn)行后續(xù)的多糖脫色效果測定。按式（1）的計算方法計算脫色率：

（2）多糖保留率的測定 采用蒽酮濃硫酸法，在620 nm 處測定脫色前后多糖的OD 值，帶入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程計算出質(zhì)量濃度，按式（2）的計算方法計算多糖保留率：

（3）綜合評分 綜合評分（Y）= 0.5 ×

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Origin 9.0、Excel 2007、Design-Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，以葡萄糖質(zhì)量濃度（ug/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y= 0.012 9x-0.021 9，R2=0.993 9，表明10～60 ug/mL 范圍內(nèi)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1活性炭用量在基礎(chǔ)條件下，分別考察活性炭用量為0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 g/30 mL 的多糖脫色率與多糖保留率。如圖2 所示，在0.3 g/30 mL 用量之前，隨著活性炭用量的增加，脫色率呈陡峭曲線上升，表明在此范圍內(nèi)，脫色率與活性炭使用量成正比關(guān)系；而在活性炭添加量0.3 g/30 mL 之后，脫色率曲線較之前曲線平緩，表明脫色效果在下降，這可能是隨著活性炭添加量的增加，活性炭逐漸與溶液中的色素分子的結(jié)合，呈飽和狀態(tài)；多糖分子隨著活性炭添加用量的增加不斷減少（圖3），這可能是由于活性炭的吸附為不定向，在吸附色素分子的同時也吸附了多糖分子。由此表明，活性炭取量在0.3 g/30 mL 時脫色效果和多糖保留率都處于良好狀態(tài)，故選擇用量0.3 g/30 mL為響應(yīng)面活性炭用量的中心點。

圖2 活性炭用量對多糖脫色率與多糖保留率的影響

圖3 活性炭用量對苦膽草多糖綜合評分的影響

2.2.2脫色時間在設(shè)置的基礎(chǔ)條件下，分別考察脫色時間20、30、40、50、70 min 的多糖脫色率與多糖保留率。由圖4、圖5 可知，隨著時間的增加，脫色率不斷增加，多糖保留率不斷下降。隨著時間的增加，脫色率上升的并不多，即在68%～76%，這表明活性炭脫色效果與時間的關(guān)系不是很大，隨著時間的增加，活性炭所吸附的分子越來越多，當(dāng)基本填滿作用孔徑時，每個活性炭表面都吸附色素分子，空間變得擁擠、堵塞，造成吸附色素分子的能力下降，稱為“堵車”現(xiàn)象。為節(jié)省時間以及減少多糖分子不必要的損失，故選擇40 min 作為響應(yīng)面脫色時間的中心點。

圖4 脫色時間對多糖脫色率與多糖保留率的影響

圖5 脫色時間對苦膽草多糖綜合評分的影響

2.2.3脫色溫度在基礎(chǔ)條件下，分別考察脫色溫度30～70 ℃條件下的多糖脫色率和多糖保留率。如圖6、圖7所示，隨著脫色溫度的上升，脫色率不斷上升，基本與脫色溫度成正比關(guān)系，在70 ℃時，曲線變得較平直，這說明一定的溫度可以促進(jìn)活性炭的吸附，但是活性炭會處于空間飽和狀態(tài)，所以過高的溫度對多糖脫色效果不明顯，只會更多地?fù)p耗多糖。從多糖保留率來看，隨著溫度的上升，多糖保留率不斷下降，由圖6 可知，為更多地保留多糖分子，因其多糖保留率40 ℃后出現(xiàn)驟減，故選擇40 ℃作為響應(yīng)面脫色溫度的中心點。

圖6 脫色溫度對多糖脫色率與多糖保留率的影響

圖7 脫色溫度對苦膽草多糖綜合評分的影響

2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果

響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果與方差分析表見表2、表3。由表2 數(shù)據(jù)得出二次回歸模型方程，Y=+69.25+3.52A+1.19B+0.44C+0.093AB+0.039AC+0.22BC-1.99A2+0.060B2+0.77C2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

其中Y（綜合評分），A（活性炭使用量），B（脫色時間），C（脫色溫度）。

2.4 驗證試驗結(jié)果

以綜合評分為指標(biāo)，并通過回歸二次方程得出的最佳脫色工藝組合為活性炭用量0.4 g/30 mL、溫度45.23 ℃、時間49.92 min，綜合評分預(yù)測值為72.828 5，保留2位小數(shù)約72.83。

考慮到試驗的條件，最終驗證試驗條件改為用量0.4 g/30 mL，溫度45.20 ℃，時間50 min。在其他條件不變的情況下，試驗重復(fù)3次取均值，在此條件下多糖脫色率為80.49%，多糖保留率65.34%，綜合評分為72.91，與預(yù)測值的綜合評分72.83相差很小，相對誤差為0.11%。這表明該模型下提供的最優(yōu)工藝參數(shù)具有可靠性，可應(yīng)用到實際中。

3 結(jié)論

本文以活性炭對多糖進(jìn)行脫色試驗，選取單因素試驗結(jié)果最佳試驗范圍，后通過響應(yīng)面試驗設(shè)計，以綜合評分為指標(biāo)篩選出了最優(yōu)脫色工藝條件：活性炭用量0.4 g/30 mL、溫度45.2 ℃、時間50 min，在此條件下，多糖平均脫色率為80.49%，多糖保留率65.34%，綜合評分為72.91，接近預(yù)測值72.83。表明該工藝設(shè)計的條件以及得出的結(jié)果具有可靠性、精確性，可應(yīng)用到實際工作中去，避免在實際工作中造成資源、成本的浪費(fèi)。

活性炭在日常生活中具有脫色、凈化污水、吸附有毒氣體、凈化空氣等諸多作用，在多糖脫色這一塊，相校其他方法如過氧化氫法、大孔樹脂吸附法，具有成本低廉、脫色效率高、所耗時間短以及不改變多糖的性質(zhì)、也不帶進(jìn)別的物質(zhì)的優(yōu)點，非常適合工藝化的生產(chǎn)需求。不過活性炭也有不足的地方，活性炭的吸附不具有特定性，它沒有選擇性地吸附所有可吸附的東西，所以在多糖脫色時也會造成多糖的損耗，并且它本身是黑色粉末狀，自帶黑色物質(zhì)，在脫色時，需要不斷離心、過濾才能清除黑色物質(zhì)，在此過程中造成時間成本增加，試驗也變得繁瑣，故今后對活性炭的研究可以關(guān)注如何快速地除去活性炭本身的顏色以及控制活性炭在吸附色素時不吸附多糖分子。