張寧璐,付正祎,楊靜茹,楊蕊,胡靜,周勝杰,于剛,馬振華,4*

(1.三亞熱帶水產(chǎn)研究院,海南三亞 572018;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,廣東廣州 510300;3.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,天津,300384; 4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外海漁業(yè)可持續(xù)利用重點實驗室,廣東廣州 510300)

魚類生活環(huán)境的特殊性導(dǎo)致其極易受到外界環(huán)境的影響,在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中,許多人為操作都會對魚種造成一定的應(yīng)激,如魚苗的增殖放流、拉網(wǎng)運輸、排污以及不恰當(dāng)?shù)耐段沟萚1-3]。這些不恰當(dāng)?shù)娜藶椴僮鲿绊戶~類正常的生長發(fā)育,因此通過研究人為操作產(chǎn)生的應(yīng)激對魚體的影響,對避免孵苗培育以及增殖產(chǎn)收工作時造成的應(yīng)激效應(yīng)具有重要意義。中國作為漁業(yè)大國,近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量一直處于世界領(lǐng)先水平。水產(chǎn)品?；钸\輸是魚體轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵過程,而溫度、pH、溶氧、氨氮等水質(zhì)指標(biāo)的變化以及運輸密度過大和運輸振動等人為因素會對魚類造成應(yīng)激反應(yīng),這些脅迫會不同程度的影響魚類生理狀態(tài)[4]。

魚類應(yīng)激反應(yīng)主要有3個階段:警覺、抵抗、補(bǔ)償或衰竭(死亡)[5],盡管外部環(huán)境會不停的變化,但需要魚類本身的內(nèi)部環(huán)境盡量保持相對恒定的狀態(tài),應(yīng)激會導(dǎo)致魚類本身出現(xiàn)超負(fù)荷的狀態(tài),若魚本身可以有一個過渡性的適應(yīng)過程,可以大大減少應(yīng)激產(chǎn)生的特殊反應(yīng)。提高魚類的免疫系統(tǒng),可以使魚類平穩(wěn)的度過傷害期。魚類的免疫系統(tǒng)主要功能有免疫防御、免疫監(jiān)視及免疫自穩(wěn)三方面[6]。藥物輔助操作,可以有效緩解活魚的應(yīng)激免疫反應(yīng),降低活魚的死亡率[7]。

高體鰤(Serioladumerili),又稱杜氏鰤、紅甘鰺,是鲹科鰤屬的魚類。在魚類分類學(xué)中隸屬鱸形目(Perciformes)、鱸亞目(Percoidei)、鲹科(Carangidae)、鰤屬(Seriola)。分布于印度洋北部沿岸、紅海至太平洋中部夏威夷群島以及中國沿海等,是暖性中上層魚類,棲息水深18～36 m,溫度要求為22～28 ℃[8]。本實驗在模擬活魚運輸條件下,以高體鰤為研究對象,探討了丁香酚對高體鰤幼魚在運輸途中造成的應(yīng)激反應(yīng)和免疫狀態(tài)的改變,為進(jìn)一步了解丁香酚對高體鰤應(yīng)激和免疫狀態(tài)的影響,減少高體鰤在運輸中造成的應(yīng)激,提高運輸成活率提供參考,為高體鰤幼魚的運輸技術(shù)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗所用高體鰤幼魚和暫養(yǎng)及試驗場地,均由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心提供。高體鰤幼魚體長為(10.34±1.33)cm,體質(zhì)量為(19.83±0.02)g。暫養(yǎng)和運輸過程中使用的過濾海水的水溫為28.9 ℃,pH值為7.87,溶氧含量約為7.70 mg/L,氨氮含量約為0.12 mg/L,亞硝含量約為0.009 mg/L。

1.2 試劑及設(shè)備

丁香酚,中國常熟尚齒齒科材料有限公司(純度98%);TRIzol,Invitrogen公司;ELISA試劑盒,南京建成生物工程研究所;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix, Code: AU311-02;異丙醇,西隴科學(xué)股份有限公司;Meilunred核酸電泳染料(10 000×水溶液),美侖生物(MeilunBio);瓊脂糖,BY-R0100,Biowest;HACH 探頭,哈希HQ40D,儀庫(上海)工業(yè)儀表有限公司;紫外分光光度機(jī),北京百泰克生物技術(shù)有限公司;離心機(jī),sigma 1-16 K臺式冷凍型離心機(jī);實時定量PCR儀,Q1000,杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;雙穩(wěn)定時電泳儀電源,DYY-6C型,北京六一生物科技有限公司。

1.3 實驗方法及取樣

在24.79 kg/m3運輸密度下將高體鰤幼魚隨機(jī)分配在15個塑料密封袋(48.0 cm×37.0 cm×22.5 cm)中,試驗設(shè)計5個處理組,即D0組、D25組、D50組、D75組、D100組。母液配方如下:2 mL純水,20 μL丁香酚。處理D0組、D25組、D50組、D75組、D100組分別將0、25、50、75及100 μL丁香酚母液分別加入運輸水體中,其丁香酚濃度分別為0、0.012 5、0.025 0、0.037 5和0.050 0 μL/mL,每個丁香酚濃度設(shè)置3個平行組。將 HACH 探頭伸入塑料袋中測定pH、溶氧、氨氮、亞硝、溫度。完成上述步驟后排出袋內(nèi)空氣,利用氧氣瓶對塑料袋進(jìn)行充氧,充氧完畢后快速使用橡皮筋系緊。并放置于事先準(zhǔn)備好的泡沫箱,泡沫箱放置兩個冰瓶降低溫度,運輸準(zhǔn)備過程完成后用膠帶密封泡沫箱。模擬運輸時長為8 h,放置完成后在試驗期間全程禁開泡沫箱,并且在此期間每間隔1 h晃動5下泡沫箱模擬運輸過程中的顛簸。運輸試驗結(jié)束后立即進(jìn)行取樣,每組隨機(jī)選取3條高體鰤幼魚進(jìn)行尾鰭采血和肝、鰓組織的的取樣,血液樣品靜置于4 ℃等待后續(xù)處理,組織樣品液氮冷激后放置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清制備及血清激素測定

血清的制備方法如下:將高體鰤幼魚血液于4 ℃靜置1 h后,3 000 r/min,4 ℃離心15 min后,取上清,-80 ℃下保存?zhèn)溆?。血清中激素的測定使用ELISA試劑盒,實驗步驟嚴(yán)格按照說明進(jìn)行操作。

1.5 RNA提取及基因表達(dá)

取約100 mg組織于冰上,剪碎后置于裝有1.0 mL的TRIzol溶液的2.0 mL離心管中,充分研磨至無可見的大塊組織,室溫靜置10 min。每支離心管中加入 200 μL 氯仿溶液,蓋緊管蓋,上下?lián)u晃10 s使其充分混合均勻,室溫靜置3 min。4 ℃,12 000g離心15 min,然后取上清400 μL放入新的2.0 mL離心管中,加入 0.8 倍的異丙醇,混勻后-20 ℃靜置20 min。12 000g,4 ℃離心10 min。上清液棄去,留下沉淀,加入現(xiàn)配的75%酒精1.0 mL,慢慢洗滌沉淀,7 500g,4 ℃離心5 min。棄去上清液使用超凈工作臺開風(fēng)吹干,根據(jù)沉淀大小再加入20～50 μL的滅菌純水。立即用于逆轉(zhuǎn)錄,剩下的置于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。結(jié)合使用瓊脂糖凝膠配合電泳和紫外分光光度計檢測RNA的純度以及濃度、樣品是否降解,使得總 RNA 的質(zhì)量可以滿足260/280吸光值比值在1.8～2.0,濃度在200～1 000 ng/μL以內(nèi)。再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄配置,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix, Code: AU311-02)的說明,提取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄處理,并合成 cDNA,于-20 ℃冷凍保存。運用Primerpremier 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計,引物設(shè)計的基因模板序列來源于NCBI DNA數(shù)據(jù)庫,由天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司合成引物。本實驗的引物序列見表1。熒光定量反應(yīng)采用熒光染料SYBR Green,根據(jù)所使用產(chǎn)品(北京天根生物科技股份有限公司)設(shè)計20 μL反應(yīng)體系,包括10 μL 2×Real Universal Pre Mix,0.6 μL正反引物,6.8 μL無RNA酶處理水和2.0 μL cDNA。反應(yīng)程序為:95 ℃,15 min;95 ℃,15 s;65 ℃,20 s;72 ℃,30 s;40個循環(huán)。β-Actin為內(nèi)參基因,通過實時定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

表1 本研究中所用到的基因引物相關(guān)信息Tab.1 The primers related to immune genes used in this study

1.6 數(shù)據(jù)計算和統(tǒng)計分析

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,2-ΔΔCt法對免疫基因的相對表達(dá)進(jìn)行分析,SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,P<0.05為差異顯著,作圖所用數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚在不同濃度下對高體鰤肝應(yīng)激的變化規(guī)律

在不同濃度丁香酚中模擬運輸高體鰤幼魚8 h后,如圖1所示:血紅素加氧酶(HO-1)、結(jié)合珠蛋白(HP)、糖皮質(zhì)激素(GR)的相對表達(dá)量隨著丁香酚濃度的增長在D75組達(dá)到頂峰值,隨后下降,D75組GR相對表達(dá)量顯著高于其余4組(P<0.05),HO-1相對表達(dá)量D25組與其他4組之間呈顯著性差異(P<0.05),D50和D75組與其余3組之間HP相對表達(dá)量呈顯著性差異(P<0.05);熱休克蛋白(HSP70)相對表達(dá)量隨著丁香酚濃度的增長在D50組達(dá)到HSP70表達(dá)量的頂峰值隨后下降,在HSP70相對表達(dá)量達(dá)到峰值后,D0、D75、D100組之間無顯著差異(P>0.05);熱休克蛋白(HSP90)相對表達(dá)量隨著丁香酚濃度的增長,在D50組達(dá)到HSP70表達(dá)量的頂峰值隨之下降,D50組和D75組之間呈顯著性差異(P<0.05)。

圖1 不同濃度丁香酚對高體鰤體內(nèi)肝應(yīng)激的變化規(guī)律Fig.1 Changes of liver stress of eugenol at different concentrations in Seriola dumerili

2.2 丁香酚在不同濃度下對高體鰤鰓應(yīng)激的變化規(guī)律

不同濃度丁香酚在模擬運輸高體鰤幼魚8 h后,如圖2所示:高體鰤鰓中的HO-1相對表達(dá)量呈現(xiàn)升高-降低-升高的不規(guī)則變化,HO-1相對表達(dá)量在每個相鄰的2組數(shù)據(jù)中呈顯著性差異(P<0.05);HP相對表達(dá)量在高體鰤幼魚鰓中呈現(xiàn)降低-升高-降低的不規(guī)則變化,HP相對表達(dá)量D0組與其他4組數(shù)據(jù)間呈顯著性差異(P<0.05);GR相對表達(dá)量D0組與其他4組之間呈顯著性差異(P<0.05);HSP70表達(dá)量D0組與其他4組之間,顯著高于D0組水平,隨著丁香酚濃度的增加,HSP70相對表達(dá)量逐漸增加,D75組時達(dá)到最高隨之下降;HSP90相對表達(dá)量呈現(xiàn)不穩(wěn)定的變化趨勢為升高-降低-升高,D100組時達(dá)到峰值,每相鄰2組之間都呈現(xiàn)顯著差異性(P<0.05)。

圖2 不同濃度丁香酚對高體鰤體內(nèi)鰓應(yīng)激的變化規(guī)律Fig.2 Changes of gill stress of eugenol at different concentrations in Seriola dumerili

2.3 丁香酚在不同濃度下對高體鰤血清應(yīng)激的變化規(guī)律

不同濃度丁香酚在模擬運輸高體鰤幼魚8 h后,如圖3所示:高體鰤血清中的魚促腎上腺皮質(zhì)激素(ATCH)濃度D0組和D75、D100組之間差異均不顯著(P>0.05),D25組和D50組CRH差異均不顯著,均顯著低于D0、D75、D100組(P<0.05);魚皮質(zhì)醇(COR)濃度D0組顯著高于D25、D50組(P<0.05),D25組和D50組無顯著差異(P>0.05),D0、D75、D100組之間無顯著差異(P>0.05);魚促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)血清激素濃度在D75組中最高,D0組和D25、D50、D75組之間差異均不顯著(P>0.05),D75組和D100組CRH血清激素濃度差異均不顯著,均顯著高于D0組(P<0.05)。

圖3 不同濃度丁香酚對高體鰤體內(nèi)血清應(yīng)激的變化規(guī)律Fig.3 Changes of serum stress at different concentrations of eugenol on liver and serum in Seriola dumerili

2.4 丁香酚在不同濃度下對高體鰤肝免疫的變化規(guī)律

不同濃度丁香酚在模擬運輸高體鰤幼魚8 h后,如圖4所示:高體鰤肝中Lyz相對表達(dá)量呈現(xiàn)降低-升高-降低的不穩(wěn)定變化,溶菌酶(Lyz)相對表達(dá)量在每相鄰2組數(shù)據(jù)中呈顯著性差異(P<0.05);肝素(Hep)表達(dá)量在D75和D100組顯著高于D0組水平,D0、D25、D50間無顯著差異(P>0.05);補(bǔ)體3(C3)相對表達(dá)量在相鄰2組的數(shù)據(jù)中呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05),D75組相對表達(dá)量達(dá)到峰值,隨之下降;組織相容性復(fù)合物1(MHC-1)相對表達(dá)量D100組顯著高于其余4組(P<0.05),D0和D50組、D25和D75組無顯著差異性(P>0.05);蛋白復(fù)合物(NF-Kb1)相對表達(dá)量5組之間全部呈顯著性差異(P<0.05);腫瘤壞死因子(TNF-α)相對表達(dá)量D100組與其余4組呈顯著性差異(P<0.05),D0、D25、D50和D75組之間無顯著差異(P>0.05);干擾素-γ(IFN-γ)相對表達(dá)量呈不規(guī)律的變化趨勢升高-降低-升高,D100組時達(dá)到峰值,D100組和其他每組之間都呈現(xiàn)顯著差異性(P<0.05);轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)表達(dá)量D100組和其余4組之間呈顯著性差異(P<0.05),D0和D25和D50組之間無顯著差異(P>0.05);白介素10(IL-10)相對表達(dá)量呈現(xiàn)降低-升高-降低-升高的不穩(wěn)定變化,D100與其余4組之間呈顯著性差異(P<0.05),其余4組之間無顯著性差異(P>0.05);白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)相對表達(dá)量在D25、D50、D100組之間無顯著差異(P>0.05),IL-1β相對表達(dá)量在D0組和其他4組之間呈顯著性差異(P<0.05),D0組與D75組呈顯著性差異(P<0.05)。

2.5 丁香酚在不同濃度下對高體鰤鰓免疫的變化規(guī)律

不同濃度丁香酚在模擬運輸高體鰤幼魚8 h后,如圖5所示:高體鰤鰓中Lyz相對表達(dá)量D0、D50組顯著高于其他組,D0組Lyz相對表達(dá)量最高,D25、D75、D100組組間Lyz差異均不顯著(P>0.05);Hep相對表達(dá)量D0和D25組、D50和D100組之間差異不顯著(P>0.05),D75組顯著高于其他組(P<0.05);C3相對表達(dá)量5組之間呈顯著性差異(P<0.05);MHC-1相對表達(dá)量在D50和D75組差異不顯著(P>0.05),D0和D100組顯著高于其他組(P<0.05),D25組與其余4組呈顯著性差異(P<0.05),D50和D75組之間差異不顯著(P>0.05);NF-Kb1相對表達(dá)量在D50組中最高,顯著高于其他4組(P<0.05),D25、D75和D100組之間差異不顯著(P>0.05);TNF-α相對表達(dá)量在D0、D25、D50、D100組之間差異不顯著(P>0.05),與D75組呈顯著差異性(P<0.05);IFN-γ相對表達(dá)量在各組組間差異均顯著,并隨著丁香酚濃度的增加先降低再逐漸顯著性升高,D0組顯著高于其余4組之間(P<0.05),D25和D100組、D50和D75組無顯著性差異(P>0.05);TGF-β1相對表達(dá)量隨著丁香酚濃度的增長呈上升性趨勢,D0和D25組,D50、D75和D100組均無顯著性差異(P>0.05),D0和D25組之間呈顯著性差異(P<0.05);IL-10相對表達(dá)量隨丁香酚濃度的增長呈先下降后上升的趨勢,在D100組時達(dá)到最高,且顯著高于其余4組(P<0.05),D0和D25組,D50和D75組無顯著性差異(P>0.05);IL-1β相對表達(dá)量隨丁香酚濃度增長先增加再降低,D75組達(dá)到最高且顯著高于其余4組(P<0.05),相鄰2組之間呈顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

3.1 不同濃度丁香酚濃度下模擬運輸對高體鰤幼魚的應(yīng)激變化影響

密閉充氧運輸是一種比較常用的運輸方式,通過將魚限定在密閉的水體中,然后經(jīng)過此運輸,在此條件下,魚所受到的應(yīng)激是導(dǎo)致其死亡的重要原因。魚類在運輸、捕撈、采卵、采血和各項實驗工作中,很容易受到應(yīng)激的影響,如:警惕性提高,運動增強(qiáng),活動增強(qiáng),呼吸增強(qiáng),耗氧增強(qiáng)。為減少魚兒在各項作業(yè)中的應(yīng)激反應(yīng),提高其免疫能力和存活率,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用丁香酚麻醉藥具有十分重要的意義[9]。魚類麻醉是為了減少和降低在運輸途中造成的刺激,防止魚體在運輸過程中造成的魚體損傷,以及降低新陳代謝提高魚體成活率。為了綠色健康的合理利用麻醉劑,需要對其制定嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)和使用規(guī)范[10]。其麻醉魚類機(jī)理:首先抑制魚類的腦皮質(zhì)層, 使魚喪失觸覺, 然后作用其基底神經(jīng)節(jié)及小腦, 使魚進(jìn)入興奮狀態(tài), 并最終作用于脊髓使其麻醉[11]。HO-1、HSP70、HSP90相對表達(dá)量先升高在達(dá)到一定峰值后降低,基本在其D50和D75組時且顯著高于其他組(P<0.05),其麻醉劑的濃度直接影響魚類的麻醉效果,濃度過低起不到抗應(yīng)激作用,濃度過高則容易導(dǎo)致魚體受到生理脅迫傷害,甚至休克死亡。所以,適當(dāng)?shù)穆樽韯舛葘ιa(chǎn)操作是有利的,同時也可以起到保持活性和運輸?shù)淖饔肹12]。GR、HP由相對表達(dá)量可以觀察到,如果使用過高濃度的麻醉劑,會導(dǎo)致機(jī)體無法承受其傷害。由此可以看出,在應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生過程中,魚類非特異性免疫細(xì)胞的功能會逐步衰退,從而對魚類的正常免疫功能造成了一定的影響,因此應(yīng)該從根源上著手,防止魚類的免疫系統(tǒng)受到損害[4]。

本實驗中不同丁香酚濃度下的高體鰤肝、鰓組織HO-1、GR、HP、HSP70、HSP90相對表達(dá)量顯著高于D25組,HO-1 是誘導(dǎo)性表達(dá),其耗氧后可以減少血紅素降解過程中氧自由基的形成,避免血紅素對細(xì)胞的損傷[13],GR是一種模型蛋白,其活性嚴(yán)格依賴于HSP90 和HSP70[14],由于加入的不同濃度丁香酚,對魚體本身產(chǎn)生刺激作用,濃度過高后,會對魚體本身帶來負(fù)面影響,HP觸珠蛋白相對表達(dá)量快速增長,容易造成魚體感染,與其指標(biāo)一起維持高體鰤幼魚體內(nèi)的動態(tài)平衡。CRH、ATCH、COR是相互作用的,ACTH作用于腎上腺皮質(zhì),刺激釋放皮質(zhì)醇,同時皮質(zhì)醇反饋抑制CRH和ACTH分泌,由實驗結(jié)果得知,D25和D50組表現(xiàn)出顯著差異性(P<0.05),相對表達(dá)量隨丁香酚濃度的增加,先降低后升高,表明皮質(zhì)醇對應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)出時滯,是因為皮質(zhì)醇的合成受控于促腎上腺皮質(zhì)激素[15]。血清指標(biāo)最能直接反應(yīng)機(jī)體的生理功能變化,來檢測模擬運輸途中魚類健康的有效辦法。與腎上腺素相比,皮質(zhì)醇作為應(yīng)激指標(biāo)更有意義,皮質(zhì)醇能迅速進(jìn)入血液引起機(jī)體生理代謝機(jī)能的改變,是魚類應(yīng)激反應(yīng)的主要特征之一,具有較好的穩(wěn)定性,應(yīng)激后其升高幅度在一定時間內(nèi)與應(yīng)激因子的強(qiáng)度及作用時間呈正相關(guān),因此可指示魚類應(yīng)激初級階段反應(yīng)強(qiáng)度[16]。隨著丁香酚濃度的增加,迫使機(jī)體通過非特異性免疫系統(tǒng)代謝調(diào)節(jié)來清除脅迫所產(chǎn)生的過多的有害物質(zhì),加強(qiáng)相關(guān)免疫細(xì)胞的作用來發(fā)揮免疫應(yīng)激效應(yīng)[9]。

3.2 不同濃度下丁香酚模擬運輸對高體鰤幼魚的免疫變化影響

當(dāng)魚類受到外界環(huán)境刺激時,其非特異性免疫系統(tǒng)便會發(fā)揮主導(dǎo)作用,這些抗應(yīng)激物質(zhì)不僅可以用來判斷魚類的生長、健康狀況以及賴以生存的環(huán)境狀況,還可以用來量化氧化應(yīng)激水平。據(jù)研究表明,在一定條件下,魚體血液中的溶菌酶是比皮質(zhì)醇更可靠的應(yīng)激信號,但溶菌酶水平升高所持續(xù)的時間依脅迫的方法強(qiáng)度而定[15,18]。因此,需要加強(qiáng)對魚類非特異性免疫系統(tǒng)的研究,以更好地了解魚類的生存狀態(tài)。據(jù)現(xiàn)有研究表明,在一定條件下,魚體血液中的溶菌酶是比皮質(zhì)醇更可靠的應(yīng)激信號,但溶菌酶水平升高所持續(xù)的時間依脅迫的方法強(qiáng)度而定[20]。運輸脅迫條件下使補(bǔ)體相對表達(dá)量下降,表明其對魚體免疫系統(tǒng)有一定抑制作用;另一方面,溶菌酶相對表達(dá)量升高是機(jī)體在經(jīng)歷了一段應(yīng)激之后而產(chǎn)生的一種保護(hù)機(jī)制,借此維持機(jī)體的自身平衡來克服脅迫。本實驗在不同丁香酚濃度下的免疫變化趨勢,高體鰤體內(nèi)Lyz、Hep、NF-Kb1、TNF-α、IL-1β相對表達(dá)量隨著丁香酚濃度的增加總體呈先升高后降低的變化趨勢,表明其受丁香酚濃度影響產(chǎn)生了大量機(jī)體免疫防御體系作出反應(yīng),導(dǎo)致機(jī)體Lyz、Hep、NF-Kb1、TNF-α、IL-1β相對表達(dá)量升高,是為了清除過量的有害物質(zhì)使機(jī)體免受損傷,當(dāng)釋放過量的有害物質(zhì)時,體內(nèi)各器官系統(tǒng)會啟動相應(yīng)的防御機(jī)制,從而使機(jī)體免遭損傷,因此后降低則是由于機(jī)體的自身調(diào)節(jié)能力,消除過量的丁香酚濃度刺激造成的影響。當(dāng)丁香酚濃度高于安全值時,就會使魚體各器官組織出現(xiàn)功能紊亂,體內(nèi)各調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮作用保持協(xié)調(diào)狀態(tài),從而引起一系列生理、生化及免疫反應(yīng)的變化[21];C3、TGF-β1、IL-10相對表達(dá)量平緩升高反映了丁香酚濃度的增加致機(jī)體為應(yīng)對機(jī)體免疫,減輕丁香酚濃度對其肝鰓的影響程度,機(jī)體做出的反應(yīng)也是比較溫和;MHC-1、IFN-γ表達(dá)量隨著丁香酚濃度的增加呈先降低后升高的變化趨勢,表明其受丁香酚濃度的影響,先是一定程度上緩解了肝、鰓組織內(nèi)的應(yīng)激免疫程度,但并不能完全消除過高的丁香酚濃度刺激,使其自身機(jī)體的內(nèi)環(huán)境發(fā)生快速變化破壞了機(jī)體的自身免疫穩(wěn)態(tài);研究結(jié)果的差異是由于丁香酚作用效果與水產(chǎn)品的種類、自身素質(zhì)及使用麻醉劑的種類、劑量、水溫及操作方法等有關(guān)。這些因素影響了個體對丁香酚麻醉劑的吸收、應(yīng)答及代謝過程,且同一實驗魚對不同劑量的反應(yīng)無明顯的規(guī)律性[22]。

綜上所述,為減少運輸損失和運輸脅迫對魚苗應(yīng)激與免疫的影響。建議加入0.025 0 μL/mL的丁香酚溶劑,用塑料袋密封充氧運輸即可。