王帆，王鵬皓

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽(yáng) 110001）

人體骨骼的正常代謝依靠成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡維持。這種動(dòng)態(tài)平衡受骨組織周圍微環(huán)境中存在的多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，其中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 作為骨組織局部微環(huán)境中至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子，在成骨活動(dòng)中發(fā)揮十分重要的作用［1］。細(xì)胞凋亡使細(xì)胞在基因控制下程序性死亡，進(jìn)而維持體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡，影響組織周圍內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。研究［2］證明，微RNA （micro RNA，miRNA） 對(duì)成骨細(xì)胞的再生、轉(zhuǎn)化、分化等代謝過(guò)程起至關(guān)重要的作用。目前對(duì)miR-361-3P在骨代謝相關(guān)疾病中的研究較少見(jiàn)，且其對(duì)成骨細(xì)胞自我程序性死亡的作用機(jī)制尚未清楚。因此，本研究擬通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)人成骨細(xì)胞內(nèi)miR-361-3P對(duì)TGF-β1和細(xì)胞凋亡標(biāo)志分子caspase 3蛋白活性表達(dá)的影響，以探討miR-361-3P/TGF-β1通路在人成骨細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用DMEM培養(yǎng)液 （含10 % 胎牛血清、300 mg/L G418） 于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人成骨細(xì)胞系hFob1.19 （北京307-青藤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心）。

1.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染

miR-361-3p mimic （mimic）、miR-361-3p inhibitor（inhibitor） 和 TGF-β1 siRNA （si-TGF-β1） 均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。將hFob1.19細(xì)胞隨機(jī)分為control組、mimic組及其陰性對(duì)照組 （mimic-NC組）、inhibitor 組及其陰性對(duì)照組 （inhibitor-NC組）、si-TGF-β1及其陰性對(duì)照組 （si-NC組）。采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng) （北京中杉金橋生物有限公司），于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下行細(xì)胞轉(zhuǎn)染8 h。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將hFob1.19細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板，培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8 （5 mg/mL，北京中杉金橋生物有限公司），孵育2 h，450 nm 處檢測(cè)吸光度。

1.4 實(shí)時(shí)PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR）

用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。采用Nanodrop 2000測(cè)定RNA樣品的濃度和純度。用primematipt混合RT 隨機(jī)引物對(duì)mRNA行逆轉(zhuǎn)錄。用TRIzol reagent行miRNA逆轉(zhuǎn)錄。采用PrimeScript RT Master Mix及ABI Prism7500序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。以GAPDH和U6作內(nèi)參照。采用2-ΔΔCt法分析miRNA和mRNA的相對(duì)表達(dá)量。采用不同引物檢測(cè)環(huán)狀RNA的后剪接，采用聚合引物檢測(cè)線性mRNA。miRNA和mRNA引物見(jiàn)表1。

表1 miRNA和mRNA引物設(shè)計(jì) （5’-3’）Tab.1 Primer design for the miRNA and mRNA expression assays （5’-3’）

1.5 Western blotting

采用放射免疫沉淀法提取細(xì)胞總蛋白，用8%或10% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入TGF-β1一抗（稀釋1 ∶250，美國(guó)賽默飛公司），37 ℃孵育過(guò)夜。用PBS洗膜后，加入過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗 （美國(guó)賽默飛公司），37 ℃孵育2 h。PBS洗膜，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。用GAPDH （稀釋1 ∶2 500） 作內(nèi)參照。

1.6 報(bào)告基因熒光素酶活性測(cè)定

將miR-361-3p和TGF-β1的3’-UTR插入pmirGLO質(zhì)粒，獲得熒光素酶報(bào)告載體 （pmirGLO-miR-361-3p-wt，pmirGLO，TGF-β1-wt）。構(gòu)建突變質(zhì)粒 （pmirGLOmiR-361-3p-mut和pmirGLO-TGF-β1-mut）。96孔板中培養(yǎng)hFob1.19細(xì)胞24 h，分別轉(zhuǎn)染上述pmirGLO質(zhì)粒48 h，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng) （美國(guó)Promega公司） 測(cè)定熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)分布，Levene檢驗(yàn)分析方差齊。采用未配對(duì)的Student’st檢驗(yàn) （正態(tài)分布和方差齊數(shù)據(jù)）、Welcht檢驗(yàn) （方差不齊數(shù)據(jù)） 或Mann-WhitneyU檢驗(yàn) （非正態(tài)分布數(shù)據(jù)） 進(jìn)行組間比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-361-3p對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)TGF-β1的調(diào)節(jié)作用

miR-361-3p mimic作用成骨細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)miR-361-3p mRNA表達(dá)水平明顯升高 （圖1A），TGF-β1mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，TGF-β1蛋白表達(dá)水平受到明顯抑制 （圖1B、1C），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。

圖1 miR-361-3p 對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)TGF-β1表達(dá)的影響Fig.1 Effects of miR-361-3p on TGF-β1 expression in osteoblasts

2.2 miR-361-3p對(duì)成骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響

miR-361-3p mimic作用成骨細(xì)胞48 h后，CCK-8結(jié)果顯示細(xì)胞增殖被顯著抑制 （圖2A）；同時(shí)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和Western blotting均發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞內(nèi)caspase 3蛋白表達(dá)水平明顯升高 （圖 2B、2C），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜ 0.05）。

圖2 miR-361-3p對(duì)成骨細(xì)胞增殖及caspase 3 活性的調(diào)控作用Fig.2 Regulation of miR-361-3p on osteoblast proliferation and caspase 3 activity

2.3 miR-361-3p負(fù)向調(diào)控靶基因TGF-β1對(duì)成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

miR-361-3p與TGF-β1mRNA的3’-UTR區(qū)域存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn) （圖3A）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-361-3p mimic組中 WT-TGF-β1的熒光素酶活性明顯降低 （圖3B），證實(shí)miR-361-3p可與TGF-β1mRNA結(jié)合并干預(yù)其表達(dá)；與control組和inhibitor-NC組比較，miR-361-3p inhibitor可明顯抑制成骨細(xì)胞內(nèi)miR-361-3p mRNA的表達(dá)和caspase 3的蛋白活性 （圖 3C、3F），顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖效應(yīng) （圖3E）；si-TGF-β1可顯著抑制成骨細(xì)胞增殖，而顯著增強(qiáng)caspase 3的蛋白活性 （圖3D、3F），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜0.05）。以上均證實(shí)miR-361-3p/TGF-β1對(duì)成骨細(xì)胞增殖和凋亡具有調(diào)控作用。

圖3 miR-361-3p/TGF-β1調(diào)控成骨細(xì)胞增殖和凋亡的作用Fig.3 Role of miR-361-3p/TGF-β1 in regulating osteoblast proliferation and apoptosis

3 討論

miRNA是基因表達(dá)調(diào)控的重要組成部分，通常由20～24個(gè)核苷酸組成，通過(guò)多種途徑 （包括直接抑制翻譯過(guò)程，或通過(guò)烯基化使mRNA靶點(diǎn)降解） 參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等過(guò)程及炎癥、感染、固有免疫的調(diào)控，在機(jī)體的免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用［3］。近年來(lái)，miRNA對(duì)骨代謝的影響受到廣泛關(guān)注。研究表明，miR-150-3p 通過(guò)β-catenin對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化產(chǎn)生影響［4］；miR-23b通過(guò)影響Smad3抑制MC3T3-E1細(xì)胞的成骨化［5］；miR-103a通過(guò)在轉(zhuǎn)錄過(guò)程后調(diào)控Runx2，抑制成骨細(xì)胞的活性，從而降低細(xì)胞外基質(zhì)的礦化［6］；miR-204和miR-211通過(guò)抑制Runx2蛋白在成骨活動(dòng)中的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，增加人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)的脂肪生成［7］。本研究結(jié)果顯示，miR-361-3p可能通過(guò)抑制靶基因TGF-β1的轉(zhuǎn)錄和蛋白活性，抑制成骨細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。

miRNA通過(guò)與靶基因相關(guān)序列位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮作用。此序列通常僅包含6～8個(gè)堿基，因此，1個(gè)miRNA可能對(duì)多個(gè)mRNA產(chǎn)生作用，而1個(gè) mRNA可能受多個(gè)miRNA調(diào)控［8］。某些miRNA的缺失可能不會(huì)影響機(jī)體正常的生長(zhǎng)發(fā)育，但可能引發(fā)疾病，很多慢性疾病的發(fā)生均與miRNA特殊的作用方式有關(guān)。miR-361-3p作為一種抗炎mi-RNA，可通過(guò)靶向抑制活化性T淋巴細(xì)胞核因子5調(diào)節(jié)核因子κB［9］；miR-361-3p在肺組織中存在表達(dá)，通過(guò)抑制癌細(xì)胞的生成、轉(zhuǎn)移，加速癌細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抗癌的功能［10］；miR-361-3p過(guò)量表達(dá)可抑制高糖環(huán)境下的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，降低乳酸脫氫酶含量，提高腎小管上皮細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞內(nèi)丙二醛和caspase 3 的表達(dá)水平［11］。miR-361-3p能調(diào)控多種靶基因，如胰島素樣生長(zhǎng)因子1、TNF、p73和促卵泡激素等［12］。本研究表明，人成骨細(xì)胞內(nèi)的miR-361-3P與靶基因TGF-β1的啟動(dòng)區(qū)有8個(gè)堿基結(jié)合位點(diǎn)，可靶向抑制TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄，參與成骨細(xì)胞凋亡。

TGF-β1具有多效性及多向性，通過(guò)自分泌或旁分泌等方式與細(xì)胞表面受體信號(hào)結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡。研究［13］表明，TGF-β1對(duì)心肌細(xì)胞增殖、凋亡及成纖維化等有調(diào)控作用；TGF-β1高表達(dá)通過(guò)旁分泌機(jī)制使心臟成纖維細(xì)胞的膠原形成增加，導(dǎo)致心肌肥厚、心肌收縮功能降低［14］。骨組織微環(huán)境中，TGF-β1由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)控制成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨代謝活動(dòng)，在骨組織形成和骨組織吸收的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。對(duì)小鼠成骨細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可通過(guò)降低RANKL、增加OPG的表達(dá)，減少破骨細(xì)胞的生成和骨吸收降低［15］。本研究通過(guò)檢測(cè)凋亡蛋白caspase 3的活性表達(dá)，探討miR-361-3p/TGF-β1和成骨細(xì)胞凋亡間可能存在的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)阻斷miR-361-3p/TGF-β1通路時(shí)，成骨細(xì)胞凋亡和caspase 3蛋白活性明顯增強(qiáng)，表明miR-361-3p/TGF-β1可負(fù)向調(diào)控成骨細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究探討了miR-361-3p通過(guò)TGF-β1影響成骨細(xì)胞增殖及凋亡的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)TGF-β1是miR-361-3p的靶基因，且miR-361-3p通過(guò)下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制成骨細(xì)胞凋亡。