李 歡，陳曉靜

（1.蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，安徽蚌埠 233030；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物遺傳育種研究所，福建福州 350002）

中國水仙（Narcissus tazettavar.chinensis）是蒜科水仙屬植物，是多花水仙（Narcissus tazettaL.）的一個(gè)變種。由于中國水仙品種較少、花色單一、育種資源匱乏等原因，傳統(tǒng)育種方面進(jìn)展較慢，改良中國水仙依然是廣大研究者對(duì)水仙研究的重點(diǎn)之一[1]。

轉(zhuǎn)錄因子（反式作用因子）是一類能與基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，主要作用是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)[2]。常見的和花色調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有MYB、bHLH和WD40 三大類[3]。MYB 根據(jù)R 基數(shù)量可分為4 個(gè)亞群，其中含量最多的為R2R3型MYB[4]。bHLH（basic/helix-loop-helix）是植物中的第二大類轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥中含有147 個(gè)bHLH 轉(zhuǎn)錄因子被分成21 個(gè)亞族[5]。WD40 由Fong 等[6]首次發(fā)現(xiàn)，van Nocker 和Ludwig[7]把擬南芥中的237個(gè)WD 轉(zhuǎn)錄因子分為143個(gè)亞族。植物中，花青素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控受MYB-bHLH-WD40（MBW）復(fù)合體的協(xié)同調(diào)控[8]。如，擬南芥中TTG1（WD40）與bHLH 的互作有助于加強(qiáng)花青素的合成[9]。

云香水仙（證書標(biāo)號(hào)：認(rèn)2012-34-1）為福建農(nóng)林大學(xué)遺傳育種研究所培育出來的一種多花水仙，其形態(tài)特征（花徑較大，小花量大，繁殖容易且抗病強(qiáng)）、花色（副冠顏色較淺）、香氣（香氣特別濃）等與其它兩色花主栽品種不同，在一定程度上豐富了中國水仙花資源。目前，伴隨生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程手段改善中國水仙花色已成為可能[10]。本研究以云香水仙為實(shí)驗(yàn)材料，通過對(duì)WD40進(jìn)行基因克隆和序列分析，并對(duì)其不同花期表達(dá)量進(jìn)行研究，以期為中國水仙花色改良提供部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

云香水仙（白色花瓣和黃色副冠）由福建農(nóng)林大學(xué)遺傳育種研究所提供。分別取花苞、花蕾、始花和盛花期的花朵，去掉花絲、花藥和花柱，花瓣和副冠分別置于離心管中，液氮速凍，-80 ℃保存[1-2]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

采用離心柱型多糖多酚RNA 提取試劑盒（購自北京百泰克生物限公司）分別提取云香水仙4個(gè)花期的花瓣與副冠的總RNA。采用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（購自Fermenta）合成的cDNA用于3′-RACE[1-2]。

1.2.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組（NCBI SRA 數(shù)控庫，登錄號(hào)：SRR2477578 和SRR2477579）已經(jīng)獲得的花色相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。

表1 引物及其序列

1.2.3WD40開放閱讀框的獲得

以云香水仙的cDNA 為模板，采用NtWD40-F 和NtWD40-R 為上下游引物擴(kuò)增NtWD40 的ORF。PCR 擴(kuò)增采用25 mL 反應(yīng)體系（表2）和35 cycle、退火時(shí)間均為90 s。凝膠電泳后回收目的片段，連接18-T 載體，轉(zhuǎn)化DH5α（Escherichia coli），后測(cè)序鑒定目的片段[1-2]。

表2 PCR 反應(yīng)體系/μL

1.2.4 序列拼接及生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN 和Primer5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和序列拼接。氨基酸多重序列比對(duì)和CDD功能區(qū)域分析使用NCBI 中的BLASTX；氨基酸理化分析使用Ex-PASy-ProtParam tool；構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹使用MEGA5.05 中的鄰近相法neighbor-joining tree；氨基酸信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用SignalP 4.1Server；氨基酸跨膜預(yù)測(cè)使用TMHMM Server v.2.0；氨基酸的親疏水特性使用ProtScale；亞細(xì)胞定位使用Softberry[1-2]。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

實(shí)時(shí)熒光定量特異性引物見表1 中的qNt-WD40-F 和qNtWD40-R。使用20 μL qRT-PCR反應(yīng)體系：ddH2O9.2 μL；Premix ExTaqTM(2×) 8 μL；PCR Forward 和Reverse Primer (10 μmol/L) 各0.4 μL；cDNA 模板2.0 μL。設(shè)定反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ?C 預(yù)變性3 min，95 ?C 變性15 s,60 ?C 退火15 s，72 ?C分離20 s[1-2]。反應(yīng)結(jié)束后，分析融解曲線和擴(kuò)增曲線并得到Ct 值。采用2-ΔΔCT法最終得到不同基因的相對(duì)表達(dá)量[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtWD40基因開放閱讀框的獲得

以云香水仙RNA 反轉(zhuǎn)錄成的cDNA 為模板，使用特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。得到一條與預(yù)測(cè)相當(dāng)?shù)募s為1 000 bp 的片段（圖1），開放閱讀框1 020 bp，初步判斷已經(jīng)獲得NtWD40基因的cDNA全長。

圖1 NtWD40基因的凝膠電泳圖

2.2 NtWD40蛋白生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN 分析NtWD40 基因序列，結(jié)果顯示NtWD40 共編碼339 個(gè)氨基酸。使用ExPASy-ProtParam 等在線工具推測(cè)WD40氨基酸基本理化性質(zhì)（表3），結(jié)果顯示為親水性和酸性不穩(wěn)定蛋白，等電點(diǎn)為4.73。二級(jí)結(jié)構(gòu)中最多的為無規(guī)卷曲且β-轉(zhuǎn)角最少。該蛋白不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白。Nt-WD40蛋白跨膜螺旋數(shù)為0，預(yù)測(cè)其不屬于跨膜蛋白。此外，亞細(xì)胞定位在線預(yù)測(cè)顯示NtWD40位于細(xì)胞核的可能性較大。

表3 NtWD40 蛋白的理化性質(zhì)

將NtWD40 基因編碼區(qū)的氨基酸序列在NCBI的CDD 上搜索，如圖2，該基因?qū)儆诘湫偷腤D40 superfamily。對(duì)其開放閱讀框所推導(dǎo)的氨基酸進(jìn)行同源序列分析（圖3），NtWD40 同擬南芥的AtTTG1、蘋果的MdTTG1、矮牽牛的PhAN11 及苜蓿的Mt-WD40-1的同源性分別為68%、68%、68%和69%。為了研究NtWD40蛋白的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA5.05中的鄰近相法neighbor-joining tree 法構(gòu)建了NtWD40的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），分析表明，云香水仙與玉米親緣關(guān)系最近，處于同一分支，同屬于單子葉植物，其次是雙子葉植物大豆、百脈根等。矮牽牛和番茄同屬茄科，蘋果和沙梨同屬薔薇科，小心葉薯、橙紅蔦蘿和大花牽牛同屬旋花科，處于進(jìn)化樹的同一分支，此進(jìn)化樹分析同植物分類學(xué)基本一致。

圖2 NtWD40基因編碼區(qū)的保守結(jié)構(gòu)域

圖3 NtWD40氨基酸序列多重序列比對(duì)

圖4 NtWD40系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 NtWD40蛋白生物信息學(xué)分析

隨著云香水仙花朵的綻放，NtWD40在花苞、花蕾、始花和盛花期的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，始花期花瓣和副冠的相對(duì)表達(dá)量分別是花苞期花瓣和副冠的5 倍和8.1 倍（圖5）。在花苞期和花蕾期，NtWD40在花瓣中的表達(dá)量稍高于副冠，而始花期和盛花期副冠中NtWD40表達(dá)量稍高于花瓣。

圖5 NtWD40基因的表達(dá)分析

3 討論

WD40 蛋白一般有4～16 個(gè)串聯(lián)的WD40 基元，該高度保守的基元約由40個(gè)氨基酸殘基組成，在不同的植物中高度保守[12-13]。WD40蛋白參與植物的多種生理活動(dòng)，如參與植物的胚胎發(fā)育[14]、開花過程[13]、花的發(fā)育[15]和調(diào)控花青素的合成[16]等。

本研究中，NtWD40推導(dǎo)的氨基酸同MtWD40-1、AtTTG1、MdTTG1和PhAN11的氨基酸序列同源比對(duì)表明，NtWD40 同樣含有4 個(gè)高度保守的WD 基序（WD、FD、LD 和WE）。研究表明MtWD40-1[17]、AtTTG1[18]、MdTTG1[19]和PhAN11[20]參與花青素的生物合成調(diào)控。因此，推測(cè)NtWD40可能參與云香水仙類黃酮及花青素的生物合成。

此外，NtWD40基因的熒光定量結(jié)果顯示，Nt-WD40在云香水仙花苞期、花蕾期和始花期中呈上升趨勢(shì)，這和花苞期副冠和花瓣的淺綠色至始花期的黃色和乳白色的表觀相符合。盛花期NtWD40的表達(dá)量低于始花期，這和盛花期副冠和花瓣的顏色變淺相一致，因此推測(cè)NtWD40可能參與云香水仙類黃酮途徑相關(guān)色素的合成。本研究的開展對(duì)中國水仙花色育種及品種改良提供了一定的基因資源和理論基礎(chǔ)。