劉雅涵，吳育朔，趙澤滿，蔡思源，靳小石

1 河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，河北 保定 071000；2 河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院

結(jié)腸癌是當(dāng)前全球范圍內(nèi)發(fā)病率排名第三的腫瘤，且發(fā)病率更是在逐年增加［1］。在我國，結(jié)腸癌的發(fā)病率形勢亦不容樂觀，近十年來數(shù)據(jù)統(tǒng)計我國結(jié)腸癌的發(fā)病率在常見惡性腫瘤中位于第四位，僅次于肺癌、胃癌和肝癌。結(jié)腸癌作為生長迅速、惡性程度高、轉(zhuǎn)移性強、死亡率高的惡性腫瘤，是最具侵襲性的腫瘤之一。SLC5A8基因位于人類染色體的12q13-23，與人體內(nèi)多種組織器官腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，現(xiàn)已知其可在包括結(jié)腸腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤中誘導(dǎo)細胞凋亡，因此它已經(jīng)被標(biāo)記為腫瘤抑制基因［2-8］。T淋巴細胞亞群是一個具有多功能的細胞群體，分為CD3+、CD4+和CD8+多個亞群，維持機體正常的免疫應(yīng)答。在腫瘤免疫中，T淋巴細胞亞群發(fā)揮著重要作用，對臨床指導(dǎo)腫瘤的免疫治療具有極其重要的理論意義和臨床意義。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在基因構(gòu)建重組中發(fā)揮了強大作用，該技術(shù)可利用靶點特異性的RNA將Cas9核酸酶帶到基因組上的具體靶點，從而對特定基因進行敲除。2022年10—12月，我們觀察了SLC5A8基因敲除后皮下種植結(jié)腸癌細胞株MC-38的負瘤模型小鼠腫瘤微環(huán)境中T淋巴細胞亞群占比變化，為結(jié)腸癌基因治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 結(jié)腸癌細胞株MC-38由河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室凍存于-80℃冰箱。RPMI Medium 1640 basic（1×）購自中國THermo Fisher Scientific公司，DNAse I、Collagenase IV均購自美國SIGMA公司，PBS購自碧云天有限公司，紅細胞裂解液購自河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室。流式細胞儀購自美國BD公司，細胞計數(shù)儀購自睿鈺有限公司，手持組織粉碎器購自美國Biospec公司，高速冷凍離心機購自美國Thermo公司，過濾器購自中國紹興衛(wèi)星醫(yī)療有限公司。

1.2 SLC5A8基因敲除方法 預(yù)先設(shè)計SLC5A8-gRNA1（GTCTCGGACAAGCCTAGACT）、SLC5A8-gRNA2（GGGAGGCTCTCGCACTATCC），進行卵細胞顯微注射，將小鼠逐步傳代并剪尾行PCR檢測，產(chǎn)出SLC5A8-/-純合型小鼠。以上小鼠均由北京維通達生物技術(shù)有限公司提供技術(shù)支持（許可證件編號：SCXK（京）2019-0002）。本研究選取均為雌鼠，8～12周齡，體質(zhì)量為18～22 g，均飼養(yǎng)于河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級動物實驗中心，維持室溫在21～25 ℃，每天24小時進行高效的過濾換氣，濕度維持在40%～60%，12 h光照、12 h黑夜，小鼠的食用飼料和所鋪墊料均需經(jīng)過高強度射線定時定量進行照射消毒滅菌，小鼠飼養(yǎng)方式均按照標(biāo)準嚙齒類動物飼養(yǎng)。每3天補足飼料及自來水并更換墊料，分籠飼養(yǎng)1周。小鼠的實驗設(shè)計符合實驗動物福利倫理要求，審批號：2020XS021，本實驗符合動物實驗3R原則。

1.3 小鼠分組及MC-38負瘤模型的制備 打開紫外線燈，對超凈臺照射消毒滅菌約30 min，再將含有1 mL MC-38細胞株懸液的凍存管放置在37 ℃水浴鍋中緩慢搖晃解凍直至冰晶完全消失，將凍存管用75%乙醇擦拭消毒后轉(zhuǎn)移到超凈臺內(nèi)，加入4 mL的1640培養(yǎng)基混合均勻，1000 r/min離心4 min，棄去上清液，補加2 mL的1640培養(yǎng)基后吹打均勻，然后將混勻后的全部液體倒入培養(yǎng)瓶中過夜。第2天及時更換瓶內(nèi)培養(yǎng)液，并檢查細胞密度。當(dāng)細胞密度達到80%～90%時即可進行傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的MC-38細胞，使用臺盼藍溶液對其進行染色后計數(shù)。將MC-38細胞懸液與臺盼藍混合均勻后滴至計數(shù)板上進行計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至5×106/mL。分別取SLC5A8基因敲除型C57BL/6小鼠、普通C57BL/6小鼠各4只，記為實驗組、對照組。將兩組小鼠依次取出，在異氟烷吸入麻醉下固定放置于工作臺上，對背部皮膚進行脫毛，再以75%的乙醇消毒背部皮膚，從MC-38細胞懸液中抽取0.2 mL懸液接種于小鼠右側(cè)背部皮下區(qū)域，種植后約一周左右，小鼠的背部皮下便可見一直徑2～5 mm、形狀不規(guī)則、移動性尚可、界限清楚的質(zhì)硬結(jié)節(jié)，視為模型制備成功。

1.4 各組小鼠腫瘤微環(huán)境中T淋巴細胞亞群占比測算 采用流式細胞法。將兩組MC-38負瘤模型小鼠腫瘤組織完整剖下后，去除外層皮膚與被膜，選取盡可能多的腫瘤組織，盡量避開中心壞死區(qū)，放置于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基的六孔板中。每孔放置1片流式濾膜，用剪刀剪碎腫瘤組織后用EP管充分研磨腫瘤組織，之后轉(zhuǎn)移、裂解、水浴、離心、重懸、臺盼藍染色計數(shù)，以制備結(jié)腸癌組織的單細胞懸液。每只小鼠的單細胞懸液準備3個EP管，每個EP管加入2×106個細胞，再加抗體CD45和CD483進行染色。再次離心、重懸后，使用流式濾膜過濾到流式專用試管，應(yīng)用流式細胞儀檢測小鼠腫瘤微環(huán)境中T淋巴細胞亞群的占比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0和GraphPad Prism8統(tǒng)計軟件。計量資料呈正態(tài)分布時以±s表示，比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

實驗組小鼠腫瘤微環(huán)境中CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞占比分別為27.730% ± 2.861%、50.923% ± 4.823%、10.205% ±1.234%，對照組小鼠腫瘤微環(huán)境中CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞占比分別為40.790% ± 9.940%、58.355% ± 3.292%、22.950% ±1.948%，實驗組小鼠腫瘤微環(huán)境中CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞占比均低于對照組（P均＜0.05）。

3 討論

2002年，RODRIGUEZ等［9］發(fā)現(xiàn)并從人腎cDNA文庫中克隆鑒定出一個編碼610個氨基酸的基因序列，將其作為溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白（Solute carrier，SLC）第5家族的第8號成員，即SLC5A8。SLC5A8基因位于人類染色體的12q13-23，其編碼的蛋白與鈉離子高度耦聯(lián)，主要作用底物為短鏈脂肪酸（Short fatty acids，SCFAs）類物質(zhì)，如丁酸、丙酸、和丙酮酸等，以上物質(zhì)均可作為組蛋白脫乙?；敢种苿?，通過組蛋白乙?；淖饔枚绊懠毎脑鲋?，可以上調(diào)促凋亡基因和下調(diào)抗增殖基因而導(dǎo)致細胞凋亡［10］。故通常認定SLC5A8為候選抑癌基因。

GURAV等［11］研究提示，SLC5A8基因在結(jié)腸是通過膳食纖維的細菌代謝產(chǎn)物—丁酸鹽作用于免疫系統(tǒng)，尤其是黏膜中的樹突狀細胞，進而發(fā)揮抗炎抗腫瘤作用。并且，SLC5A8基因與結(jié)腸內(nèi)細菌分解產(chǎn)物—短鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運過程有著密切關(guān)系。在腸道黏膜組織，尤其是在丁酸含量較高結(jié)腸黏膜組織中含量最多。在SIVAPRAKASAM等［12］對炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）的研究中顯示，IBD的特征是由于宿主免疫系統(tǒng)和微生物群之間的共生關(guān)系被破壞而導(dǎo)致腸道慢性炎癥。各種因素會改變腸道微生物群，導(dǎo)致生態(tài)失調(diào)，尤其是飲食和膳食纖維兩個因素。細菌在結(jié)腸中發(fā)酵這些膳食纖維并產(chǎn)生SCFAs，其介導(dǎo)膳食纖維的抗炎抗腫瘤的作用。以上研究提示，SLC5A8基因表達產(chǎn)物在結(jié)腸組織中有優(yōu)勢分布的特點，從而證實了該基因?qū)Y(jié)腸癌的研究中具備更重要的意義。

然而，SLC5A8基因的研究大多限于臨床標(biāo)本的檢測與觀察，尚缺乏真正的實驗證據(jù)來證明該基因的腫瘤抑制作用。因此，建立目的基因缺失的癌癥模型是研究SLC5A8基因與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性的關(guān)鍵。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的優(yōu)越性與可靠性為我們提供了新的研究思路。其主要工作原理是CRISPR-derived RNA（crRNA）通過堿基配對與trans-activating RNA（tracrRNA）結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物可引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶點剪切外源性DNA，從而實現(xiàn)對基因的編輯［13-14］。本研究成功應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立SLC5A8基因缺失動物癌癥模型，為SLC5A8基因與結(jié)腸癌的體內(nèi)實驗研究提供了重要基礎(chǔ)。

腫瘤微環(huán)境與腫瘤細胞之間的相互作用貫穿了腫瘤發(fā)展全過程，而且，以T淋巴細胞主導(dǎo)的免疫是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中機體主要的細胞免疫方式［15］。T淋巴細胞是一個具有多功能的細胞群體，分為CD3+、CD4+和CD8+多個亞群，維持機體正常的免疫應(yīng)答。其中，CD3+代表了所有外周成熟的T淋巴細胞，它的作用是協(xié)助T淋巴細胞抗原受體識別抗原提呈細胞上的主要組織相容復(fù)合物——抗原決定簇復(fù)合物［16-17］。CD4+和CD8+是兩類重要的T細胞亞群，反映宿主的免疫調(diào)節(jié)能力。CD4+T細胞在抑炎因子的作用下，分化為調(diào)節(jié)性T細胞，主要介導(dǎo)腫瘤細胞對免疫系統(tǒng)的耐受［18］。CD8+T細胞可以在促炎因子的作用下分化為細胞毒性T細胞，可以加強機體對腫瘤細胞的殺傷作用［19］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組小鼠腫瘤微環(huán)境中CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞占比均降低，表明敲除了SLC5A8基因的小鼠細胞免疫抑制程度增加，腫瘤微環(huán)境中免疫屏障功能進一步受損，癌細胞可能進一步發(fā)生免疫逃逸，腫瘤進而進一步生長和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，與普通C57BL/6小鼠相比，SLC5A8基因敲除后皮下種植MC-38細胞的負瘤模型小鼠腫瘤微環(huán)境中CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞占比均下降。SLC5A8基因的缺失導(dǎo)致小鼠腫瘤微環(huán)境中T淋巴細胞亞群的占比下降，可能進一步使細胞免疫屏障受損，促進結(jié)腸癌細胞的免疫逃逸，從而促進結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展，這為今后結(jié)腸癌基因治療提供了一定的思路以及實驗依據(jù)。