熊海濤，徐藝鳳，徐承娥

（1 陜西理工大學(xué) 陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點實驗室 陜西漢中 723001 2 陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 陜西漢中 723001）

作為一種生物功能組分，焦磷酸鹽（Pyrophosphate，PPi）是三磷酸腺苷（ATP）及其它核苷酸的水解產(chǎn)物，在DNA 和RNA 的聚合反應(yīng)與復(fù)制、部分酶促反應(yīng)、能量傳遞、多種代謝等生命活動中扮演著重要角色，也可以作為臨床診斷與治療關(guān)節(jié)炎的一種潛在生物標(biāo)志物[1-3]。PPi 是一種食品添加劑，可以提高蛋白質(zhì)成膜的幾率，改善肉制品的品質(zhì)和口味，增加肉制品的滲透能力，在一定程度上抑制肉制品褪色和變質(zhì)，并能增加肉制品的彈性[4]。而如果攝入過量的PPi 可使鈣磷聚合物大量產(chǎn)生，進而導(dǎo)致血管發(fā)生鈣化[5]，甚至致癌[6]。建立一種準(zhǔn)確且靈敏的PPi 檢測方法，對保證食品安全及臨床診斷十分重要。

目前，檢測PPi 的方法主要有比色法[7-9]、色譜分析法[10-11]、熒光光度法[12-15]、生物發(fā)光法[16]、化學(xué)發(fā)光法[17-18]及電化學(xué)分析法[19-21]等。其中，熒光光度分析法具有操作簡單，靈敏度與準(zhǔn)確度較高等優(yōu)點，受到較多關(guān)注。近些年，利用熒光光度法測定實際樣品中PPi 含量的方法主要有兩種[22]：1）設(shè)計并合成有機熒光探針，以選擇性識別與檢測PPi[23-24]；2）利用金屬離子與合成的熒光探針及PPi 之間的競爭反應(yīng)，以實現(xiàn)對少量PPi 的高靈敏檢測[25]。然而，熒光探針大多需要特殊設(shè)計，而且合成過程較為復(fù)雜，分離繁瑣、費時，成本較高，因此其應(yīng)用受到一定的限制。

本研究采用具有微弱熒光的茚三酮-過氧化氫混合體系為基底反應(yīng)物，通過在基底液中加入具有催化活性的Cu2+，使體系的熒光強度增強。當(dāng)體系中加入少量的PPi 后，基于Cu2+能與PPi 形成穩(wěn)定的配離子，使催化體系的熒光強度降低，從而建立一種新型熒光光度法，以檢測食品中焦磷酸鹽含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦仁與帶魚樣品均購自漢中市水產(chǎn)品市場。

冰乙酸（99.5%），天津市登峰化學(xué)試劑廠；無水乙酸鈉，天津市化學(xué)試劑六廠；過氧化氫（30%），成都市科龍化學(xué)品有限公司；焦磷酸鈉，天津市同鑫化工廠；茚三酮，天津市大貌學(xué)試劑廠；硫酸銅，天津市天力化工有限公司。試驗用水如無特別說明，均為超純水，固體試劑均為分析純級。

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH 5.5）；硫酸銅溶液（1.0×10-3mol/L）；H2O2（1.0 mol/L）；茚三酮溶液（1.0×10-2mol/L）。焦磷酸鈉儲備液（1.0×10-2mol/L）：在電子天平上準(zhǔn)確稱量0.2660 g 焦磷酸鈉固體，用超純水溶解，并定容于100 mL 容量瓶中，搖勻。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（KQ-700VDE 型），北京科偉水興儀器有限公司；粉碎機（FW-80 型），鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司；電子天平（AR124CN 型），奧豪斯儀器（上海）有限公司；熒光分光光度計（F-4600 型），日立高新技術(shù)公司；烘箱（MH-1000型），北京科偉永興儀器有限公司；馬弗爐（KRD-16CMA 型），山東科瑞達電爐有限公司。

1.3 樣品預(yù)處理

首先，將適量蝦仁與帶魚用水洗凈，蝦仁置于60 ℃烘箱中烘干，切碎并研磨成粉末，備用。將帶魚低溫冷凍24 h，取可食用部分，剪成小塊狀用粉碎機徹底攪碎，充分?jǐn)嚢杌靹?，備用。取上述兩種樣品各2.5000 g，分別置于2 個瓷坩堝中，通過電爐加熱使其碳化，再將二者于馬弗爐（600 ℃）內(nèi)灰化6 h。冷卻至室溫，將其分別轉(zhuǎn)移至2 只燒杯中，并加入少量NaOH 與超純水使其全部溶解，加入活性炭并攪拌8 min，靜置30 min。最后，依次使用濾紙、0.45 μm 及0.22 μm 濾膜各過濾1 次，將獲得的透明樣品溶液用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液稀釋至10 mL。以同樣的方法，蝦仁與帶魚各平行處理2 份。

1.4 試驗方法

取兩支25 mL 的比色管依次編號1、2，各加入5.0 mL 茚三酮（1.0×10-2mol/L）溶液，1 號比色管中加入0.5 mL 過氧化氫及0.5 mL 的硫酸銅溶液儲備液，然后用pH 為5.5 的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液定容至刻度線，2 號比色管加入0.5 mL 過氧化氫，0.5 mL 的硫酸銅溶液儲備液及一定濃度的焦磷酸鈉溶液，然后用相同的緩沖溶液定容至刻度線，每支比色管搖勻，再靜置30 min 后，用F-4600 熒光光度計以310 nm 為激發(fā)波長測定茚三酮-H2O2-Cu2＋（F1）、茚三酮-H2O2-Cu2＋-PPi（F2）兩個不同反應(yīng)體系的熒光發(fā)射光譜。然后，在421 nm 的發(fā)射波長處，以降低的熒光強度（ΔF=F1-F2）對標(biāo)準(zhǔn)系列PPi 濃度的對數(shù)值作圖，以對食品樣品中的焦磷酸鹽含量進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體系熒光光譜的研究

按照1.4 節(jié)的試驗方法，分別測定茚三酮-緩沖液、茚三酮-H2O2-緩沖液、茚三酮-H2O2-Cu2＋-緩沖液、茚三酮-H2O2-Cu2＋-PPi-緩沖液4 個反應(yīng)體系的熒光發(fā)射光譜（固定其激發(fā)波長均為310 nm）。如圖1 所示，4 種體系的熒光發(fā)射波長均為421 nm，茚三酮-緩沖溶液體系（曲線a）無明顯的熒光產(chǎn)生，茚三酮-H2O2-緩沖溶液體系（曲線b）熒光強度為1 685，這可能是由于茚三酮與H2O2之間的氧化產(chǎn)物具有微弱的熒光特性；而茚三酮-H2O2-Cu2＋-緩沖溶液體系（曲線c）的熒光強度為8 077，說明Cu2＋在酸性介質(zhì)下能顯著催化茚三酮-H2O2之間的氧化還原反應(yīng)而獲得較高的熒光強度，這與文獻[26]報道相一致。而當(dāng)茚三酮-H2O2-Cu2＋-緩沖溶液加入少量的PPi 后（曲線d），體系的熒光強度變?yōu)? 415，這可能是由于加入的PPi 與反應(yīng)體系中的Cu2＋穩(wěn)定結(jié)合，而生成焦磷酸合銅（II）配離子，使茚三酮-H2O2-Cu2＋體系的熒光強度顯著減弱。結(jié)合已報道的文獻[26]～[28]，推測PPi 的檢測原理如圖2 所示，當(dāng)體系中沒有PPi 存在時，Cu2+能催化過氧化氫氧化茚三酮而產(chǎn)生大量的氧化產(chǎn)物，該氧化產(chǎn)物在310 nm 的激發(fā)波長下，具有非常強的熒光發(fā)射波長（λEM=421 nm）。而當(dāng)在Cu2+-過氧化氫-茚三酮體系中加入少量PPi后，基于PPi 能與Cu2+形成穩(wěn)定的[Cu（PPi）2]6-而使體系中游離態(tài)的Cu2+數(shù)目大量減少，從而減弱了體系中的催化-氧化反應(yīng)程度，致使茚三酮的氧化產(chǎn)物量減少，此時僅能在421 nm 的發(fā)射波長（λEX=310 nm）處檢測到1 個較弱的熒光發(fā)射。根據(jù)PPi 存在前、后，Cu2+-過氧化氫-茚三酮體系熒光發(fā)射的顯著差異，可研發(fā)一種新的阻抑熒光光度法對實際樣品的PPi 進行準(zhǔn)確檢測。

圖1 不同體系熒光發(fā)射光譜圖Fig.1 Fluorescence emission spectrums of different systems

圖2 檢測PPi 的原理說明圖Fig.2 Schematic illustration of the mechanism for the determination of PPi

2.2 試驗條件優(yōu)化

2.2.1 過氧化氫濃度的選擇 考察過氧化氫濃度（4.0×10-6，6.0×10-6，8.0×10-6，1.0×10-5，2.0×10-5，3.0×10-5，4.0×10-5，5.0×10-5mol/L）對選定體系熒光強度的影響。由圖3 可知，隨著過氧化氫濃度的增加，相對熒光強度先增強后減弱；當(dāng)過氧化氫濃度為3.0×10-5mol/L 時，體系的熒光降低幅度最大；當(dāng)過氧化氫的濃度小于3.0×10-5mol/L 時，隨著過氧化氫濃度的增加，體系的相對熒光強度逐漸增大?？赡苁怯捎谳^低濃度的過氧化氫導(dǎo)致體系間的氧化還原反應(yīng)較弱，隨著過氧化氫濃度的增加，體系的相對熒光強度增強。而當(dāng)過氧化氫的濃度大于3.0×10-5mol/L 時，體系的相對熒光強度有所減弱，這可能是由于隨著過氧化氫濃度的持續(xù)增大，體系的熒光空白信號與標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光信號均增加，而少量的Cu2+與PPi 對體系的熒光特性影響較小。因此，確定過氧化氫的最佳濃度為3.0×10-5mol/L。

圖3 不同過氧化氫濃度對體系熒光強度的影響Fig.3 Effect of different concentrations of hydrogen peroxide on the relative fluorescence intensity

2.2.2 最佳時間的選擇 設(shè)置茚三酮-H2O2-Cu2+及茚三酮-H2O2-Cu2+-PPi 兩種體系溶液均反應(yīng)5，10，15，20，30，40，50 min 后進行熒光光譜掃描。由圖4 可知，在兩種體系各自反應(yīng)40 min 時，相對熒光強度達到最大值，再延長反應(yīng)時間，熒光信號減小的程度基本保持不變。這說明PPi 與Cu2+在40 min 時反應(yīng)完全。因此，確定最佳反應(yīng)時間為40 min。

圖4 不同反應(yīng)時間對體系相對熒光強度的影響Fig.4 Effect of reaction time on the relative fluorescence intensity

2.2.3 茚三酮濃度的選擇 加入不同濃度（2.0×10-4，4.0×10-4，6.0×10-4，8.0×10-4，1.0×10-3，2×10-3，3×10-3，4.0×10-3mol/L）的茚三酮，其它反應(yīng)條件不變，對茚三酮-H2O2-Cu2+及茚三酮-H2O2-Cu2+-PPi兩種體系熒光光譜掃描。由圖5 可知，隨著茚三酮濃度的增加，相對熒光強度先增強后減弱，這可能是由于過低濃度的茚三酮會得到較弱的熒光發(fā)射峰值，而過高濃度的茚三酮會使少量焦磷酸根存在，恢復(fù)的體系熒光發(fā)射不明顯，而當(dāng)茚三酮濃度為2.0×10-3mol/L 時熒光強度減弱程度最大。因此，確定茚三酮的最佳濃度為2.0×10-3mol/L。

圖5 不同茚三酮濃度對熒光減弱程度的影響Fig.5 Effect of different concentrations of ninhydrin on the decreasing fluorescence intensity

2.2.4 Cu2+濃度的選擇 在其它反應(yīng)條件不變的情況下，考察不同Cu2+濃度（1.0×10-5，2.0×10-5，4.0×10-5，6.0×10-5，8.0×10-5mol/L）對茚三酮-H2O2-Cu2+及茚三酮-H2O2-Cu2+-PPi 兩種反應(yīng)體系熒光強度的影響。如圖6 所示，隨著Cu2+濃度的增大，體系的相對熒光強度呈先增大后減小的趨勢；當(dāng)Cu2+濃度為6.0×10-5mol/L 時，體系的熒光強度下降最大；當(dāng)Cu2+濃度超過6.0×10-5mol/L 時，體系的熒光強度變化有所減弱。這可能是由于Cu2+濃度過高會導(dǎo)致體系的空白熒光信號較強，而少量的PPi 加入反應(yīng)體系后，形成穩(wěn)定的[Cu（P2O7）2]4-較少而不足以影響的催化體系的熒光強度。故確定Cu2+濃度為6.0×10-5mol/L。

圖6 Cu2+濃度對體系相對熒光信號的影響Fig.6 Effect of Cu2+ concentration on the relative fluorescence signal

2.2.5 反應(yīng)溫度的選擇 在固定上述條件的情況下，考察不同溫度（10，20，30，40，50，60 ℃）對反應(yīng)體系熒光強度的影響。由圖7 可知，隨著溫度的升高，熒光的降低強度呈先增加后減弱的趨勢，在10～30 ℃時，隨著溫度的升高，反應(yīng)體系的熒光強度降低程度增強，這可能是由于反應(yīng)溫度升高促進了該反應(yīng)體系的反應(yīng)效率；在30～60 ℃時，隨著溫度的升高，體系的相對熒光強度呈下降趨勢，這可能是由于反應(yīng)溫度過高會使Cu2＋與PPi 之間的配位效應(yīng)減弱。因此，確定30 ℃時對體系進行熒光光譜掃描。

圖7 反應(yīng)溫度對體系相對熒光強度的影響Fig.7 Effect of reaction temperature on the relatire fluorescence intensity

2.3 優(yōu)化方法的分析特性

在上述優(yōu)化的試驗條件下，降低的熒光強度（見圖8a）與PPi 的濃度在3.0×10-7～8.0×10-6mol/L范圍內(nèi)的對數(shù)值呈良好的線性相關(guān)（見圖8b），其回歸方程為ΔF=722.2lgC ＋4868，相關(guān)系數(shù)為0.9915，方法的檢出限為3.2×10-8mol/L。對含有4.0×10-7mol/L PPi 的反應(yīng)體系進行平行11 次測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%，說明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

圖8 不同PPi 濃度的熒光發(fā)射光譜（a）與校準(zhǔn)曲線（b）Fig.8 Fluorescence emission spectrums（a）in the presence of different concentrations of PPi and calibration curve（b）

2.4 干擾組分的考察

在最優(yōu)的試驗驗條件下（過氧化氫濃度為3.0×10-5mol/L，茚三酮濃度為2.0×10-3mol/L，Cu2＋濃度為6.0×10-5mol/L，反應(yīng)時間為40 min，反應(yīng)溫度為30 ℃），固定加入PPi 的濃度為1.0×10-6mol/L，保證相對誤差的絕對值不超過5%，考察共存組分對本方法測定焦磷酸根離子的干擾情況。結(jié)果表明，200 倍的F-、Cl-、Br-、NO3-，100 倍的淀粉、SO42-，50 倍的三聚磷酸鹽、多聚磷酸鹽，10 倍的半胱氨酸、PO3-、PO43-、Mg2＋、Zn2＋均對PPi 的檢測均無干擾。

2.5 樣品測定及回收率驗證

在最優(yōu)的試驗條件下（過氧化氫濃度為3.0×10-5mol/L，茚三酮濃度為2.0×10-3mol/L，Cu2＋濃度為6.0×10-5mol/L，反應(yīng)時間為40 min，反應(yīng)溫度為30 ℃），準(zhǔn)確移取1.3 節(jié)處理的兩種樣品各1.0 mL，按照1.4 節(jié)的試驗方法測定蝦仁與帶魚樣品處理液中焦磷酸鹽的含量，并分別加入適量的PPi標(biāo)準(zhǔn)液進行加標(biāo)回收試驗，測定結(jié)果見表1。蝦仁與帶魚樣品中焦磷酸鹽的含量分別為6.23×10-3，7.15×10-3g/kg，均低于歐美國家要求的最高限量（＜0.5 g/kg）[10]，加標(biāo)回收率在93.00%～97.80%之間，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4.8%。這說明本試驗所述方法具有較高的準(zhǔn)確度與精密度。

表1 樣品分析與回收率測定結(jié)果（n=3）Table 1 Sample analysis and recovery results（n=3）

3 結(jié)論

本文利用Cu2＋與PPi 的配位作用強于Cu2＋與茚三酮之間的相互作用，在一定程度上減弱了Cu2＋對茚三酮-H2O2體系氧化還原反應(yīng)的催化作用，使選擇體系的熒光強度明顯減弱。設(shè)計了一種熒光光度法檢測焦磷酸鹽含量的新方法，采用此方法檢測蝦仁與帶魚樣品中焦磷酸鹽含量，二者的平均回收率分別為95.71%和95.40%。該測定方法試劑廉價，靈敏度與準(zhǔn)確度較高，有望為食品樣品中焦磷酸鹽的含量分析提供一定的數(shù)據(jù)參考。