張秋會，孟高歌，王 晗，劉 昶，崔文明，王小鵬，祝超智，趙改名

（河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院 鄭州 450002）

發(fā)酵肉制品是指肉品在自然或人工控制的低溫環(huán)境中，通過微生物發(fā)酵制成的一種營養(yǎng)豐富、風味獨特且具有較長保質(zhì)期的肉制品[1-2]。臘肉是以畜肉為主要原料，配以其它輔料，經(jīng)過腌制、烘干、煙熏等工藝加工而成的肉制品，因其多在農(nóng)歷臘月制得而得名，是中國傳統(tǒng)的腌臘肉制品[3]。臘肉憑借較長的保質(zhì)時間，獨特的風味及口感，深受廣大消費者的喜愛。

目前，中國市場上的腌臘肉制品多以散戶生產(chǎn)、手工作坊制作形式。由于受作坊技術(shù)限制以及生產(chǎn)條件的局限性，此類肉制品中的微生物在自然條件下培養(yǎng)、發(fā)酵，無法通過科學的方式對產(chǎn)品中微生物的生長情況進行有效調(diào)控，導致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，貨架期不穩(wěn)定，甚至使產(chǎn)品出現(xiàn)質(zhì)量與安全問題[4-5]。鑒于此，需要結(jié)合我國傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)，同時借鑒西式發(fā)酵肉加工工藝，使國內(nèi)發(fā)酵肉制品實現(xiàn)規(guī)?；?、專業(yè)化生產(chǎn)，以保障產(chǎn)品質(zhì)量[6]。由于我國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品行業(yè)起步較晚，缺少適用于工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵劑，因此，需要篩選出活性強、發(fā)酵特性優(yōu)良的優(yōu)質(zhì)菌種[7]。尋找能夠滿足人們對風味要求的微生物發(fā)酵劑，成為發(fā)酵肉制品的重要研究方向之一[8-9]。

腌臘肉制品中微生物菌群主要為葡萄球菌、乳酸菌等細菌和酵母菌、霉菌[10]。這些微生物的存在對于腌臘肉制品的風味、質(zhì)地、口感以及貯藏時間等均會產(chǎn)生直接影響[11]。相關(guān)研究表明，不同種類的菌株具有不同的發(fā)酵性能，賦予制品不同的品質(zhì)特性。例如，葡萄球菌屬于微球菌屬，在發(fā)酵肉制品的成熟過程中，具有加快發(fā)色，縮短成熟時間，降低成本以及控制病原菌和腐敗菌的生長等作用[12]。將葡萄球菌作為肉制品發(fā)酵劑具有良好的還原硝酸鹽的能力，可以降解亞硝酸鹽生成氨，從而減少發(fā)酵肉制品中亞硝胺化合物的產(chǎn)生。同時對發(fā)酵肉制品特有風味的形成有重要作用。

本研究以市售農(nóng)家自制信陽臘肉、四川綿陽臘肉、湖南臘肉以及云南臘肉為菌株分離來源，篩選其中優(yōu)勢菌株進行分離、純化，并進行生物學鑒定。選擇具有較高耐鹽性、耐亞硝酸鹽性、耐酸性的菌株進行發(fā)酵特性研究，尋找能夠滿足臘肉生產(chǎn)所需，同時具有良好發(fā)酵特性的菌株，為肉制品發(fā)酵劑的開發(fā)及發(fā)酵肉制品加工的優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

信陽臘肉，河南信陽農(nóng)家自制；四川臘肉，四川綿陽農(nóng)家自制；湖南臘肉，湖南衡陽湘西臘肉農(nóng)家自制；云南臘肉，云南普洱農(nóng)家自制；孟加拉紅瓊脂，北京奧博興生物技術(shù)有限責任公；YPD 液體培養(yǎng)基，青島海博生物；細菌DNA 提取試劑盒，北京天根試劑；牛肉浸粉、蛋白胨、TTC、葡萄糖、碳酸鈣、氯化鈉、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺等均為分析純級。

1.2 儀器與設備

AIRTECH-SW-CJ-2FD 無菌工作臺，美國Airtech 公司；TU-1901 紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；梯度PCR 儀，Tprofessional Thermovycler；DYY-12 電泳儀，北京市六一儀器廠；均質(zhì)機，Easy MIX；VORTEX GENIUS3 渦旋震蕩器，美國Scientific Industries 公司；低溫培養(yǎng)箱，BINDER。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化 取農(nóng)家臘肉樣品25 g置于無菌均質(zhì)袋中，并加入生理鹽水225 mL，混合后使用均質(zhì)機進行均質(zhì)。將均質(zhì)后的樣品倒入無菌試管中，使用無菌生理鹽水稀釋（1∶10），取100 μL 的稀釋液在孟加拉紅瓊脂平板上進行涂布，將平板置于37 ℃無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h，從中挑選出符合酵母菌形態(tài)的菌落，進行反復劃線純化[13-14]。試驗全程遵循無菌操作。

1.3.2 16S rDNA 分子生物學鑒定 生物學鑒定參考趙改名等[15]的方法。挑取單菌落于PCR 管中，使用細菌DNA 提取試劑盒細菌提取的DNA 作為模板，使用16S rDNA 通用引物27F（5-A GAGTTTGATCCTGGCTCA-3）和1482R（5-GGT TACCTTGTTACGACTT-3）作為上、下游引物進行PCR 擴增。

PCR 反應體系（50 μL）：模板5 μL，Taq PCR Master Mix 25 μL，ITS1 5 μL，ITS4 5 μL，ddH2O 10 μL；PCR 反應條件：第1 階段：95 ℃預變性5 min；第2 階段：95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個循環(huán)；第3 階段：72 ℃延伸5 min：第4 階段：4 ℃終止反應。

1.3.3 菌株特性的研究

1.3.3.1 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定參考高紹金[16]的方法，并稍作修改。按體積分數(shù)為1%將活化3 次的菌液接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)36 h，平均2 h取1 次樣，測定其pH 值，并使用紫外分光光度計測量其在波長600 nm 下OD 值。

1.3.3.2 菌株耐鹽特性 參考徐鑫等[17]的方法，將活化后的菌株按照體積分數(shù)1%接種于NaCl 含量為0%，2%，4%，6%的4 組YPD 液體培養(yǎng)基中，并將培養(yǎng)基置于37 ℃無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將所得產(chǎn)物用紫外分光度計在波長600 nm 下測定OD值。

1.3.3.3 菌株耐亞硝酸鹽特性 菌種耐亞硝酸鹽特性的測定方法：將活化后的菌株按照體積分數(shù)1%接種于NaNO2含量為0，50，100，150 mg/kg 的4 組YPD 液體培養(yǎng)基中，并將培養(yǎng)基置于37 ℃無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將所得產(chǎn)物用紫外分光度計在波長600 nm 下測定OD 值[18-19]。

1.3.3.4 菌株耐酸特性 將活化后的菌株按照體積分數(shù)1%接種于pH 為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0 的7 組YPD 液體培養(yǎng)基中，并將培養(yǎng)基置于37 ℃無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將所得產(chǎn)物用紫外分光光度計在波長600 nm 下測定OD 值[19]。

1.3.3.5 產(chǎn)醇試驗 將活化3 次的菌液在孟加拉紅固體培養(yǎng)基上劃線，倒置于37 ℃無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。后將TTC 上層培養(yǎng)基倒入孟加拉紅固體培養(yǎng)基中覆蓋初始菌落，再次于37 ℃無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后取出培養(yǎng)基，觀察并記錄菌落的呈色情況[19]。

1.3.3.6 葡萄糖產(chǎn)氣試驗 采用杜氏小管發(fā)酵法，將活化3 次的菌株按照體積分數(shù)1%接種到葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基中，在37 ℃無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，觀察杜氏小管中有無氣泡產(chǎn)生并記錄[19]。

1.3.3.7 產(chǎn)黏液試驗 吸取適量菌液接種于MRS固體平板培養(yǎng)基中，將其在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h，挑取菌落觀察、記錄[19]。

1.3.3.8 蛋白質(zhì)降解活性試驗 將培養(yǎng)好的菌液取0.1 mL 滴入添加15%脫脂乳的固體MRS 培養(yǎng)基中，涂布均勻，于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h。當牛乳中酪蛋白被分解后，觀察菌落周圍出現(xiàn)的透明環(huán)，根據(jù)現(xiàn)象判定菌種有無蛋白質(zhì)降解活性[20]。

蛋白質(zhì)降解培養(yǎng)基：在孟加拉紅固體培養(yǎng)基中加入15%的脫脂牛奶，121 ℃滅菌15 min。

1.3.3.9 脂肪分解活性試驗 將培養(yǎng)好的菌液取0.1 mL 滴入添加了15%豬油和中性紅指示劑的固體MRS 和乳清培養(yǎng)基中，涂布均勻，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。觀察并記錄結(jié)果。如培養(yǎng)基上出現(xiàn)紅色斑點，表明菌株分解脂肪并產(chǎn)生脂肪酸，反之為不分解[20]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理與分析

所有試驗均重復3 次，試驗結(jié)果表示為“平均值±標準差”。所得數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，使用Origin 作圖。數(shù)據(jù)間的分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA），顯著性水平均設定為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 臘肉中微生物的分離與鑒定

利用菌株分離純化方法，對市售4 種農(nóng)家自制臘肉中的細菌進行分離純化，獲得16 株細菌，分別標記為X49、X51、X52、S48、S50、S51、Y50、Y51、Y54、H39、H40、H42、H43、X9、X10、X12。

將篩選出的16 株菌株的基因組進行PCR 擴增，并進行電泳檢測，電泳結(jié)果見圖1。由圖1 可知樣品的擴增產(chǎn)物約為1 500 bp，所有條帶分子質(zhì)量大小符合理論預期。

圖1 PCR 凝膠成像Fig.1 PCR gel imaging

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫，對16 株菌株的DNA 序列進行比對，BLAST 分析，鑒定出臘肉中細菌的種類，鑒定結(jié)果見表1。由表1 可知，信陽臘肉中含有乳鏈球菌、腸膜明串珠菌，四川臘肉中含有腐生葡萄球菌，云南臘肉中含有木糖葡萄球菌，湖南臘肉中含有馬葡萄球菌。從中選取X49、X10、S50、Y51、H42 作為代表進行后續(xù)試驗。

表1 臘肉中16 株分離菌株的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of 16 strains isolated from bacon

2.2 臘肉中細菌的發(fā)酵特性研究

2.2.1 耐鹽特性研究 傳統(tǒng)臘肉通常依靠添加大量食鹽以降低產(chǎn)品的水分活度，來達到抑制微生物生長的目的，導致傳統(tǒng)臘肉的食鹽含量普遍較高，因此耐鹽性是選擇臘肉發(fā)酵菌種的重要指標之一[21]。臘肉中食鹽添加量一般為4%～6%，且隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)品水分含量逐漸降低，鹽濃度會相應升高，因此要求菌株對NaCl 有較高的耐受性，使其能夠在發(fā)酵過程中保持一定的活性并發(fā)揮作用。

圖2 是5 種細菌的耐鹽特性研究結(jié)果。由圖2 可知，乳鏈球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、馬葡萄球菌對食鹽有很強的耐受性。腸膜明串珠菌對NaCl 比較敏感。隨著NaCl 濃度的增大，X10活性下降最為明顯，鹽的添加量增長至4%的過程中，X10 的活性幾乎呈現(xiàn)直線型下降趨勢，而在含量為4%～6%區(qū)間內(nèi)，下降趨勢稍緩，推測是菌株幾乎完全失活所致；Y51 與S50 的活性總體呈下降趨勢，當添加量達到6%時，菌株活性幾乎喪失；而H42 與X49 在整個試驗過程中表現(xiàn)十分穩(wěn)定，對食鹽有較強的耐受性，而在整個試驗過程中，H42 活性始終強于X49 活性。

圖2 5 種細菌的耐鹽性Fig.2 Salt tolerance of 5 species of bacteria

就菌株耐鹽性能而言，當鹽的添加量到達6%時，X10 菌株的吸光度下降了85.2%，H42 菌株吸光度下降了25.14%，Y51 菌株吸光度下降了47.06%，S50 菌株的吸光度下降了51.85%，X49 菌株吸光度升高了19.49%。H42 表現(xiàn)穩(wěn)定，耐受性較高，且活性較強，能夠滿足腌臘肉制品食鹽濃度所需；其次X49 耐受性最高，而初始活性不足；Y51 和S50菌株耐鹽性差異不明顯；X10 菌株對食鹽最為敏感，且初始活度最好。結(jié)果表明，在高鹽濃度下，H42 較為合適；在鹽含量為4%時，H42 與X10 較為適宜；在鹽含量低至2%時，H42、X10 與Y51 菌株表現(xiàn)良好。因此篩選出5 株菌株，H42 與X10 適用作為發(fā)酵肉中的細菌發(fā)酵劑，而H42 對食鹽表現(xiàn)最為優(yōu)異。

2.2.2 耐亞硝酸鹽特性研究 亞硝酸鹽一直作為食品添加劑廣泛應用于肉制品加工中，其主要目的是促進產(chǎn)品發(fā)色，改善產(chǎn)品風味，抑制有害菌的生長[22]。根據(jù)國標規(guī)定亞硝酸鈉和亞硝酸鉀最大使用量為0.15 g/kg，最大殘留量不得超過50 mg/kg。本試驗設置亞硝酸鹽最高濃度梯度為最大使用量上限。

圖3 是5 種細菌的耐亞硝鹽特性研究結(jié)果。由圖3 可知，乳鏈球菌、腸膜明串珠菌對亞硝鹽有較強的耐受性。腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、馬葡萄球菌對亞硝鹽比較敏感。

圖3 5 種細菌的耐亞硝鹽性Fig.3 Nitrite tolerance of five kinds of bacteria

隨著亞硝酸鹽濃度增加，S50、Y51、H42 均呈明顯下降趨勢，說明這3 種菌株對亞硝酸鹽較為敏感；X49 與X10 在試驗進程中，吸光度并無明顯的波動，證明這兩種菌具有較強的耐亞硝鹽性。當亞硝鹽含量到達150 mg/kg 時，X10 菌株吸光度下降了4.66%，H42 菌株吸光度下降了95.36%，Y51菌株吸光度下降了94.40%，S50 菌株吸光度下降了91.96%，X49 菌株吸光度下降了21.24%。

因此就菌株耐亞硝酸鹽性能而言，X10 菌株對亞硝酸鹽的耐受性最強，同時活度較高[21]；X49菌株對亞硝酸鹽耐受性次之，較為穩(wěn)定，而菌株活度較低。結(jié)果證明：高亞硝酸鹽濃度對5 株菌株均有明顯的抑制現(xiàn)象，在100 mg/kg 時，H42、X10、X49 較為適宜，其中X10 和X49 對亞硝鹽的表現(xiàn)更為穩(wěn)定。

2.2.3 耐酸性的研究 在肉制品的發(fā)酵過程中，乳酸菌具有較強的產(chǎn)酸能力，會改變?nèi)馄返膒H環(huán)境，因此要求所篩選得到的細菌發(fā)酵劑應該具有較高的耐酸能力[23]。

圖4 是5 種細菌的耐酸特性研究結(jié)果。由圖4 可知，5 株菌株對酸性都十分敏感。

圖4 5 種細菌的耐酸性Fig.4 ACID resistance of 5 species of bacteria

根據(jù)調(diào)查，傳統(tǒng)腌臘肉制品pH 值在5.5～6.0的范圍中，此時菌株中X10 的活性最強，遠高于其它4 株菌株的活度，其它4 株菌株的吸光度無明顯差異且較低。當pH 值下降至5.5 時，X10 吸光度下降了3.58%，S50 吸光度下降了22.54%，H42吸光度下降了23.62%，X49 吸光度下降了15.12%，Y51 吸光度升高了13.27%，可知在較高pH 值時，X10 菌株與Y51 菌株具有較好的耐受性，適用于肉制品的發(fā)酵；當pH 值下降至4.5 時，X10 菌株吸光度下降了81.29%，S50 菌株吸光度下降了90.52%，H42 菌株吸光度下降了99.46%，X49 吸光度下降了99.40%，Y51 的吸光度下降了98.70%，可知當pH 值下降至一定程度時，菌株幾乎完全失活，X10 菌株由于初始活度更高，依舊具有較高的吸光度。

就菌株耐酸性能而言，在正常發(fā)酵肉制品的pH 值條件下，5 株菌株均可以作為微生物發(fā)酵劑使用，然而X10 菌株的表現(xiàn)更加優(yōu)異。然而當環(huán)境pH 值過低時，嚴重抑制菌株生長，因此可以在發(fā)酵過程中通過一些手段控制酸度，使發(fā)酵正常進行。

2.2.4 菌株的生長曲線和產(chǎn)酸曲線的研究 圖5為5 株菌株的生長曲線。由圖5 可知S50、X49、Y51、H42 菌株在0～8 h 時為遲緩區(qū)，此階段菌株的生長速度較為緩慢。X10 菌株的遲緩區(qū)較短，很快就進入對數(shù)區(qū)，在12 h 之后進入穩(wěn)定期。而X10菌種的活性最強，菌液濃度全程顯著高于另外4株菌株。

圖5 菌株的生長曲線Fig.5 Growth curve of the strain

圖6 為5 株菌株的產(chǎn)酸曲線。由圖6 可知H42 菌株的pH 值下降最快，初始pH 值為6.68，在6 h 時pH 值下降為6.04；其次為H42 菌株，初始pH 值為5.54，在6 h 時pH 值下降為4.95；而其余S50、X49、Y51 菌株的產(chǎn)酸能力差異不明顯。

圖6 菌株的產(chǎn)酸曲線Fig.6 Acid production curve of the strain

結(jié)合圖5 與圖6 曲線可知，5 株菌株的產(chǎn)酸曲線與生長曲線相對應，其中遲緩區(qū)、對數(shù)區(qū)和穩(wěn)定期時間基本一致。其中X10 的產(chǎn)酸能力最強，且增長較快，具有較高的活度；H42 在前期具有較強的產(chǎn)酸能力以及生長能力；而其它3 株菌株并無明顯差異，這與張曉瓊等[20]的結(jié)果相差不大。

2.2.5 細菌的主要發(fā)酵特性 表2 是細菌的主要發(fā)酵特性結(jié)果。根據(jù)表2 可知，產(chǎn)氣、產(chǎn)醇、產(chǎn)黏液、脂肪分解能力、蛋白質(zhì)降解能力試驗結(jié)果均為陰性。

表2 細菌的主要發(fā)酵特性Table 2 Main fermentation characteristics of bacteria

在肉制品生產(chǎn)過程中，微生物可以利用發(fā)酵基制中的糖分，并將其轉(zhuǎn)化為醇類物質(zhì)，從而賦予發(fā)酵肉制品獨特的風味。由表2 可知，產(chǎn)醇試驗中，根據(jù)最終菌落的呈色情況判斷，5 株菌株均不產(chǎn)醇，可以認為肉制品的風味物質(zhì)是由其它種類微生物發(fā)酵而來。

在肉制品的發(fā)酵過程中，微生物會產(chǎn)生氣體，破壞肉制品的品質(zhì)、風味以及產(chǎn)品外觀，對產(chǎn)品質(zhì)量造成嚴重的影響，甚至會產(chǎn)生安全問題。由表2可知，產(chǎn)氣試驗結(jié)果中，杜氏小管內(nèi)均沒有產(chǎn)生氣泡，表明5 株菌株均不產(chǎn)氣。

肉制品表面產(chǎn)生黏液，是在肉制品加工或者貯存過程中，由于微生物作用導致。黏液的存在會影響產(chǎn)品的質(zhì)量、風味以及感官，甚至引發(fā)產(chǎn)品安全問題。因此進行產(chǎn)黏液試驗是十分必要的。由表2 可知，產(chǎn)黏液試驗中，挑取菌落觀察可知，5 株菌株均不產(chǎn)黏液。表明在試驗條件下，5 株菌株的安全性均符合作為發(fā)酵劑的要求。

在肉制品中，微生物具有過強的蛋白質(zhì)降解能力以及脂肪分解能力，會消耗營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生過多的芳香物質(zhì)，從而導致產(chǎn)品不被消費者接受，銷量降低[24]。由表2 可知，5 株菌株在試驗的生長過程中均不消耗蛋白質(zhì)與脂肪，可以認為5 株菌株的蛋白質(zhì)與脂肪的分解能力較低，未被檢出。

3 結(jié)論

本試驗從4 個特色自制臘肉產(chǎn)品中篩選出16 株細菌，鑒定為乳鏈球菌、腸膜明串珠菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、馬葡萄球菌。從中選擇5 株細菌進行發(fā)酵特性研究，結(jié)果表明，腸膜明串珠菌的生長速率最快，可以作為肉制品發(fā)酵劑的潛在菌株；馬葡萄球菌和腸膜明串珠菌可以在高鹽環(huán)境下發(fā)酵；乳鏈球菌、腸膜明串珠菌可以在高亞硝酸鹽的環(huán)境下發(fā)酵；在肉制品發(fā)酵的正常酸度下，5 株菌株均可正常發(fā)酵，腸膜明串珠菌可以在酸性較低的環(huán)境下發(fā)酵。同時，5 株菌株均不分解蛋白質(zhì)和脂肪，不產(chǎn)生黏液、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)氨、不產(chǎn)H2S，因此，乳鏈球菌、馬葡萄球菌、腸膜明串珠菌有望在臘肉的工業(yè)生產(chǎn)中作為細菌發(fā)酵劑進行使用。